郭鳳云， 過子怡， 高 蕾， 鄭霖婧

(1. 浙江理工大學(xué) 紡織科學(xué)與工程學(xué)院， 浙江 杭州 310018；2. 浙江理工大學(xué) 先進(jìn)紡織材料與制備技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 浙江 杭州 310018)

進(jìn)入21世紀(jì)后，人類心血管疾病的發(fā)病率逐年增加，治療疾病的成本越來越高，這使得臨床人造血管支架的需求越來越大?，F(xiàn)階段，內(nèi)徑在6 mm以上的大口徑人造血管已經(jīng)用于臨床，但內(nèi)徑小于6 mm的小口徑人造血管常會(huì)植入失敗，因此，新型小口徑人造血管的研制和開發(fā)具有重要意義。自體或異體移植是臨床上進(jìn)行小口徑血管重建的常用方法。但這些方法不可避免地會(huì)出現(xiàn)一些問題，如血液相容性差，力學(xué)強(qiáng)度較弱等[1]。目前，組織工程制備人造血管支架的方法主要有自組裝[2]、水凝膠[3]、溶劑澆鑄及浸出、熱致相分離、靜電紡絲等[4-5]。其中，由于靜電紡絲方法參數(shù)可控、經(jīng)濟(jì)高效，作為具有代表性的制備纖維方法[6]，能夠靈活有效地調(diào)控材料的組成、尺寸、結(jié)構(gòu)和性能，所以近年來針對(duì)靜電紡絲人造血管支架的研究日益增加[7-9]。

聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚氨酯(PU)、聚己內(nèi)酯(PCL)等生物可降解高分子，常被用作靜電紡制備人造血管支架材料[10-11]，但由于各種各樣的缺陷以及組分單一的弱點(diǎn)，限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。其中，力學(xué)性能作為血管支架使用最基本的先決條件，其研究對(duì)實(shí)際應(yīng)用顯得尤為重要[12-13]。對(duì)人造血管支架的力學(xué)研究大都基于單向拉伸且強(qiáng)度較弱，沒有考慮到其在實(shí)際應(yīng)用中的縱向拉伸及橫向伸縮擴(kuò)張所需的力學(xué)差異性。除此之外，具有細(xì)胞無毒性、植入后耐穿刺不發(fā)生泄露、具備足夠的機(jī)械循環(huán)穩(wěn)定性等也是人造血管支架所要滿足的功能需求。

由于血液相容性差，纖維力學(xué)強(qiáng)度較弱等，開發(fā)小口徑、力學(xué)性能持久且功能完整的人造血管支架具有一定的挑戰(zhàn)。從紡織材料學(xué)角度出發(fā)，使用生物相容性的合成材料通過紡織機(jī)械加工手段研制力學(xué)性能良好，盡可能滿足更多功能要求的人造血管支架，成為解決小口徑人造血管支架的一個(gè)有效方法。在此背景下，本文在前期調(diào)控靜電紡絲條件、血管材料的組成配比及纖維孔徑的工作基礎(chǔ)上[14-16]，利用靜電紡絲技術(shù)結(jié)合浸泡脫管法，通過熱處理在保證適當(dāng)孔隙率的情況下制備具有粘結(jié)結(jié)構(gòu)的PCL/PU復(fù)合纖維小口徑人造血管支架，并對(duì)人造血管支架的微觀結(jié)構(gòu)、雙向拉伸強(qiáng)度、細(xì)胞毒性和穿刺性等進(jìn)行分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

材料：聚氨酯(顆粒狀，相對(duì)分子質(zhì)量為270 000)、聚己內(nèi)酯(相對(duì)分子質(zhì)量為 80 000)、膨體聚四氟乙烯管(e-PTFE)、羥乙基淀粉HES的生理鹽水溶液，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；四氫呋喃(THF)、N, N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、胎牛血清(FBS)，分析純，北京化工廠；含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基DMEM、小鼠成纖維細(xì)胞，中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

儀器：靜電紡絲裝置(自制)；AGS-X型萬能力學(xué)測(cè)試儀(日本島津公司)；Quanta 250 FEG型掃描電子顯微鏡(美國賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；ELx800型酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀(美國寶特公司)；BZF-50型真空烘箱(上海博訊公司)。

1.2 纖維膜和人造血管支架的制備

首先配制前驅(qū)體溶液：將聚氨酯(PU)和聚己內(nèi)酯(PCL)溶于質(zhì)量比為1∶1的四氫呋喃和N,N-二甲基甲酰胺混合溶液中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的PCL/PU混合溶液，其中PCL與PU質(zhì)量比為1∶3。此外，將PVP溶于乙醇中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的PVP溶液，然后進(jìn)行靜電紡絲，具體過程如圖1所示。

圖1 人造血管支架制備示意圖Fig.1 Preparation schematic of artificial blood vessel.(a) Electrospinning process; (b) Tubing-off process

將上述前驅(qū)體溶液裝入5 mL注射器中，調(diào)整合適的流速，設(shè)置電壓范圍為10～20 kV，靜電紡絲距離為20 cm。作為對(duì)比，PU、PCL/PU和PCL纖維膜靜電紡絲過程中直接用鋁箔接收。PCL/PU人造血管支架接收裝置為直徑2、3、5 mm的不銹鋼空心轉(zhuǎn)輥。PCL/PU人造血管支架紡絲過程主要包括靜電紡絲、溶解脫管和加熱粘結(jié)，具體為：第1步，紡制1層PVP纖維膜于轉(zhuǎn)輥上；第2步，在PVP纖維膜轉(zhuǎn)輥上繼續(xù)進(jìn)行PCL/PU復(fù)合纖維的紡絲；第3步，將收集到的纖維和轉(zhuǎn)輥一起置于水中20 h，溶去內(nèi)層PVP，脫去不銹鋼管轉(zhuǎn)輥，將得到的纖維管置入55 ℃干燥箱中熱處理，烘干，即可得到PCL/PU人造血管支架材料。

1.3 纖維膜和人造血管支架表面結(jié)構(gòu)表征

將纖維膜剪裁成三角形，貼在樣品臺(tái)表面；將人造血管支架剪開，裁成方形片狀，內(nèi)外表面和橫截面分別貼在樣品臺(tái)表面和側(cè)面。噴金處理后用掃描電子顯微鏡在真空環(huán)境觀察材料表面和截面形貌結(jié)構(gòu)。

1.4 人造血管支架力學(xué)性能測(cè)試

選取直徑為5 mm的人造血管支架，剪切成小圓柱狀，長(zhǎng)為15 mm，把樣品置于剪好的紙片框架上，空隙間距為5 mm，采用萬能力學(xué)測(cè)試儀進(jìn)行力學(xué)拉伸測(cè)試。橫向拉伸方向?yàn)槿嗽煅苤Ъ艿膱A周方向，縱向拉伸方向?yàn)槿嗽煅苤Ъ艿妮S向方向。測(cè)試溫度為常溫，速度為10 mm/min。每個(gè)樣品至少測(cè)試5次，取平均值。根據(jù)測(cè)得的載荷位移繪制應(yīng)力與應(yīng)變曲線，計(jì)算樣品的斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率等力學(xué)參數(shù)。

拉伸力學(xué)穩(wěn)定性測(cè)試通過固定拉伸強(qiáng)度為25 MPa和拉伸應(yīng)變?yōu)?00%，在儀器循環(huán)模式下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 人造血管支架耐穿刺性能測(cè)試

作為對(duì)照，將人造血管支架和商用e-PTFE管分別連在2個(gè)封閉的注射器中間，管內(nèi)填充人造血漿羥乙基淀粉HES的生理鹽水溶液，然后用同樣大小的注射器針頭進(jìn)行穿刺實(shí)驗(yàn)，觀察血漿滲出情況。

1.6 人造血管支架細(xì)胞毒性測(cè)試

首先對(duì)人造血管支架進(jìn)行滅菌處理，然后置于96孔培養(yǎng)板中，添加細(xì)胞培養(yǎng)液和小鼠成纖細(xì)胞L929，每個(gè)孔內(nèi)加入100 μL細(xì)胞懸液，分別培養(yǎng)1、3、5、7 d，加入DMSO、FBS和DMEM等營養(yǎng)基，在設(shè)定的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定波長(zhǎng)在490 nm處的吸光度A。每個(gè)樣品在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)準(zhǔn)備5個(gè)平行樣，取平均值。根據(jù)不同時(shí)間的空白組和實(shí)驗(yàn)組吸光度差值之比，計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 形貌結(jié)構(gòu)分析

利用圖1所示裝置制備了不同口徑和長(zhǎng)度的PCL/PU人造血管支架。PCL/PU人造血管支架呈現(xiàn)明顯的中空管狀結(jié)構(gòu)，且結(jié)構(gòu)完整可自支撐。通過懸掛重物承重測(cè)試發(fā)現(xiàn)，人造血管支架可承受416 g的重物。圖2示出PCL、PU、PCL/PU纖維膜和PCL/PU人造血管支架的掃描電鏡照片。

圖2 纖維膜和人造血管的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.2 SEM images of fibrous film and artificial blood vessel. (a) PU fibrous film(×10 000); (b) PCL/PU fibrous film(×10 000); (c) PCL fibrous film(×10 000); (d) Inner layer of artificial blood vessel(×4 000); (e) Outer layer of artificial blood vessel(×4 000); (f) Cross-sectional of artificial blood vessel(×10 000)

由圖2(a)～(c)可以看出，靜電紡絲纖維表面光滑，結(jié)構(gòu)完好，有明顯的粘結(jié)點(diǎn)，纖維呈無序均勻分布狀態(tài)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)纖維直徑平均為792 nm。由人造血管支架電鏡照片可以看出，其內(nèi)外表面的纖維光滑無序，分布均勻，含有粘結(jié)點(diǎn)結(jié)構(gòu)，截面纖維緊密交錯(cuò)堆疊，該結(jié)構(gòu)對(duì)人造血管支架力學(xué)性能的增強(qiáng)具有較大的促進(jìn)作用。本文制備的人造血管支架具有由連續(xù)纖維交錯(cuò)堆積形成的三維立體孔結(jié)構(gòu)，具有一定的孔隙。根據(jù)質(zhì)量、密度和體積，通過計(jì)算得出人造血管支架的孔隙率約為72%，這有利于細(xì)胞滲透、營養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物的輸送。

2.2 力學(xué)性能分析

為進(jìn)一步了解材料的力學(xué)性能以滿足人造血管支架的應(yīng)用要求，對(duì)PCL、PU、PCL/PU纖維膜和PCL/PU人造血管支架進(jìn)行了拉伸測(cè)試，結(jié)果如圖3所示。研究發(fā)現(xiàn)，PCL/PU人造血管支架軸向拉伸強(qiáng)度高達(dá)68.6 MPa，較純PU纖維膜提高約7倍，且在25 MPa拉伸強(qiáng)度和200%的拉伸應(yīng)變下，循環(huán)拉伸15次后材料力學(xué)性能仍然能夠保持，呈現(xiàn)出良好的拉伸循環(huán)穩(wěn)定性。相比之下，PCL/PU人造血管支架的橫向拉伸性能較弱，平均強(qiáng)度為39.3 MPa。分析認(rèn)為在縱向拉伸過程中，纖維之間形成了三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，纖維間互相交錯(cuò)相連；而在橫向拉伸時(shí)，纖維邊緣的缺口使得纖維間的滑移比較嚴(yán)重，所以縱向較橫向好。但二者均能滿足血管支架的力學(xué)要求，且這種各向異性的力學(xué)性能使其在臨床試驗(yàn)中能得到很好的應(yīng)用，更有利于人造血管支架的伸縮擴(kuò)張。

圖3 纖維膜和人造血管支架的力學(xué)性能Fig.3 Mechanical properties of fibrous film(a) and artificial blood vessel(b)

2.3 耐穿刺性能分析

血液透析或者抽血等過程往往需要對(duì)血管進(jìn)行破壞性穿刺，因此，研究人造血管支架的耐穿刺性能具有重要意義。圖4示出本文制備的PCL/PU人造血管支架和商用e-PTFE人造血管支架的穿刺實(shí)驗(yàn)對(duì)比圖。研究發(fā)現(xiàn)：PCL/PU在穿刺后10 h內(nèi)液體不會(huì)流出，即不會(huì)滲血；而e-PTFE管則出現(xiàn)液體泄漏的現(xiàn)象，如圖中虛線標(biāo)記區(qū)域所示。表明PCL/PU人造血管支架耐穿刺性較好，液體不會(huì)滲出。

圖4 人造血管支架穿刺實(shí)驗(yàn)Fig.4 Vascular puncture experiment. (a) PCL/PU fibrous artificial blood vessel; (b) Commercial e-PTFE

2.4 細(xì)胞毒性分析

在實(shí)際的組織工程應(yīng)用中，所用材料最基本的要求是要保證在一定范圍內(nèi)具有血液相容性和細(xì)胞相容性。細(xì)胞相容性可由細(xì)胞生長(zhǎng)狀況、形態(tài)變化和細(xì)胞活性來判斷。本文以小鼠成纖細(xì)胞L929為例，對(duì)人造血管支架材料進(jìn)行了細(xì)胞毒性分析，并與e-PTFE和空白對(duì)照試驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如圖5所示。

圖5 MTT法測(cè)試人造血管支架細(xì)胞毒性Fig.5 Cell viability according to a MTT assay

結(jié)果顯示隨著時(shí)間的增加，細(xì)胞相對(duì)活性最高達(dá)94%，且PCL/PU人造血管支架在第7天的細(xì)胞活性優(yōu)于空白對(duì)照和e-PTFE支架，說明本文制備的PCL/PU人造血管支架基本無細(xì)胞毒性。

3 結(jié) 論

本文利用靜電紡絲技術(shù)結(jié)合浸泡脫管法制備了具有2、3、5 mm內(nèi)徑的聚己內(nèi)酯/聚氨酯(PCL/PU)人造血管支架。該復(fù)合人造血管支架的孔隙率為72%，其力學(xué)性能較純PU纖維膜提升7倍，且橫向和縱向均具有優(yōu)異的拉伸力學(xué)性能；培養(yǎng)7 d后其細(xì)胞活性為94%，與商用的e-PTFE支架對(duì)比，該人造血管支架具有較好的耐穿刺性。本文制備的PCL/PU人造血管支架能滿足血管支架的基本要求，在人造血管組織工程領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。