榮娜娜，劉 屹，劉繼華，桂麗華，任李玥，李志遠(yuǎn)*

（1.云南省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，昆明 650106；2.云南省食品藥品審核查驗(yàn)中心，昆明 650106）

諾氟沙星為第三代喹諾酮類藥物，主要作用于拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ，通過影響細(xì)菌DNA合成從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡呈現(xiàn)殺菌作用，具有抗菌譜廣、抗菌作用強(qiáng)的特性，對革蘭氏陽性菌、陰性菌，包括銅綠假單胞菌均有良好的抗菌活性〔1-2〕。臨床主要用于敏感菌所致的呼吸道感染、尿路感染、淋病、前列腺炎、腸道感染和傷寒及其他沙門菌感染〔3-4〕。諾氟沙星葡萄糖注射液為我國獨(dú)有劑型，國內(nèi)首研企業(yè)為安徽蚌埠豐原涂山制藥廠。諾氟沙星葡萄糖注射液是2018年國家評價性抽驗(yàn)品種，為復(fù)方制劑，由諾氟沙星和葡萄糖兩種成分組成，其中諾氟沙星作為有效成分，葡萄糖則作為滲透壓調(diào)節(jié)劑。

檢索各國藥典發(fā)現(xiàn)，《中華人民共和國藥典》2020版（ChP2020）〔5〕、《美國藥典》41版（USP41）〔6〕和《歐洲藥典》9.3版（EP9.3）〔7〕等均未收載諾氟沙星葡萄糖注射液，均只收載諾氟沙星的原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)〔5-6〕。諾氟沙星葡萄糖注射液的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為國家藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-（X-0722）-94Z，在該標(biāo)準(zhǔn)中缺少對有關(guān)物質(zhì)的控制。有關(guān)物質(zhì)是反映藥品生產(chǎn)工藝水平的重要參數(shù)，也是評價藥品質(zhì)量的重要指標(biāo)，直接關(guān)系到注射劑的安全性，所以有必要建立諾氟沙星葡萄糖注射液中有關(guān)物質(zhì)的檢測方法，從而對相關(guān)雜質(zhì)進(jìn)行控制。查閱文獻(xiàn)，未見對諾氟沙星葡萄糖注射液有關(guān)物質(zhì)及測定方法的報道〔8-9〕。本文采用高效液相色譜梯度洗脫的方法，檢查諾氟沙星葡萄糖注射液有關(guān)物質(zhì)，該方法能使所有雜質(zhì)完全分離，方法專屬性更強(qiáng)，靈敏度更高。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 高效液相色譜儀（島津LC-20AD，二極管陣列檢測器）；電子天平（賽多利斯BP211D）。

1.2 試劑 乙腈（色譜純，德國默克公司，批號：JA084830）；磷酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20200911）；三乙胺（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20200612）。

1.3 對照品 諾氟沙星對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130550-201206；純度99.5%）；諾氟沙星雜質(zhì)A對照品（USP，批號：F000D0）；諾氟沙星雜質(zhì)E對照品（USP，批號：F000E0）；諾氟沙星雜質(zhì)K對照品（USP，批號：F000G0）；諾氟沙星雜質(zhì)H對照品（USP，批號：F000F0）。

1.4 樣品 諾氟沙星葡萄糖注射液（湖南科倫制藥有限公司；規(guī)格：100 mL∕瓶，諾氟沙星0.2 g、葡萄糖5 g；2018年國家監(jiān)督抽驗(yàn)樣品）；諾氟沙星原料、葡萄糖原料和輔料由湖南科倫制藥有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 流動相A：0.02 mol∕L磷酸溶液（用三乙胺調(diào)節(jié)pH至（3.0±0.1））-乙腈（90∶10）；流動相B：乙腈，梯度洗脫（0～30 min 100%A；30～35 min，100%→80%A；35～60 min，80%→100%A）；色譜柱：SHISEIDO C18柱（MGII，4.6 mm×250 mm，5μm）；檢測波長：278 nm；柱溫：40℃；流速：1.0 mL∕min；進(jìn)樣量：20μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性溶液 精密稱取諾氟沙星雜質(zhì)A、E、K、H對照品各10 mg置于100 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取適量，加流動相A定量稀釋成每1 mL中約含10μg的雜質(zhì)品混合溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密量取諾氟沙星葡萄糖注射液15 mL（取約相當(dāng)于諾氟沙星30 mg）置于200 mL量瓶中，用流動相A定容至刻度。搖勻、濾過即得（0.15 mg∕mL）。

2.2.3 原料溶液 精密稱取諾氟沙星原料30 mg置于200 mL量瓶中，用流動相A定容至刻度。搖勻、濾過即得（0.15 mg∕mL）。

2.2.4 對照品溶液 取諾氟沙星對照品適量，精密稱定，加流動相A溶解并定量稀釋制成每1 mL中含諾氟沙星10μg的溶液作為對照品溶液。

2.2.5 空白對照溶液 根據(jù)廠家提供的輔料種類和處方比例配制空白混合輔料，混勻后按供試品溶液所需稱樣量取樣，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液同法處理配制即得。

2.3 專屬性試驗(yàn) 取系統(tǒng)適用性溶液、供試品溶液、原料溶液、對照品溶液和空白對照溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，系統(tǒng)適用性溶液中諾氟沙星雜質(zhì)A、E、K、H的分離度良好，供試品中各雜質(zhì)峰之間，雜質(zhì)峰和主峰之間分離度良好，色譜圖見圖1。

圖1 色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取諾氟沙星及其雜質(zhì)A、E、K、H對照品適量，加入0.1 mol∕L的鹽酸溶液2 mL溶解，并用流動相A稀釋制成系列濃度梯度的溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，以濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程：諾氟沙星線性方程Y=18 519X+3 660，r=0.999 7（n=6）；雜質(zhì)A線性方程Y=20 241X+1 037，r=0.999 7（n=6）；雜質(zhì)E線性方程Y=24 617X+3 366，r=0.999 7（n=6）；雜質(zhì)K線性方程Y=19 177X+1 021，r=0.999 7（n=6）；雜質(zhì)H線性方程Y=172 189X+2 209，r=0.999 7（n=6）。結(jié)果表明，諾氟沙星、雜質(zhì)A、E、K、H在3.018～603.590μg∕mL范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系。

2.5 檢測限和定量限 在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下，以信噪比S∕N=3為指標(biāo)，計算最低檢測限，以信噪比S∕N=10為指標(biāo)，計算定量限。結(jié)果：諾氟沙星及其雜質(zhì)A、E、K、H檢測限分別為20.0、19.2、16.4、14.7和11.6 ng，定量限分別為0.010、0.097、0.029、0.032和0.022μg。

2.6 破壞性試驗(yàn) 取經(jīng)酸破壞（1 mol∕L鹽酸溶液放置24 h）、堿破壞（1 mol∕L氫氧化鈉溶液放置24 h）的樣品，分別中和至中性后的樣品，氧化破壞（30%過氧化氫浸潤24 h）的樣品，紫外光破壞（紫外光照射24 h）的樣品按照“2.1”項(xiàng)下的方法進(jìn)行試驗(yàn)，色譜圖見圖2。

圖2 破壞性試驗(yàn)色譜圖

酸破壞、堿破壞和氧化破壞對樣品的穩(wěn)定性影響較小，紫外光破壞后雜質(zhì)（相對保留時間（RRt）=0.75）有明顯增大的趨勢。在各破壞條件下雜質(zhì)峰之間及雜質(zhì)峰與主峰之間分離度良好，諾氟沙星的主成分及各降解雜質(zhì)均能有效分離。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，用線性關(guān)系考察試驗(yàn)的對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，峰面積的RSD為0.47%（n=6）。取同一批樣品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，總雜質(zhì)的RSD為1.6%（n=6），表明分析方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，取供試品溶液，分別于0、1、2、4、6、24 h進(jìn)樣分析，諾氟沙星峰面積RSD為1.2%（n=6），雜質(zhì)K、最大單雜質(zhì)及總雜質(zhì)的峰面積RSD分別為0.1%、0.6%和1.2%，未有新雜質(zhì)引入，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 樣品測定 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，對2018年國家評價性抽驗(yàn)的1個企業(yè)15批樣品及企業(yè)提供的1批原料中有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢測，從圖1可知，諾氟沙星葡萄糖注射液雜質(zhì)較少，雜質(zhì)譜主要集中為RRt 0.18、0.31、0.51、0.59和0.67的5個雜質(zhì)，其中RRt=0.18的雜質(zhì)為5-羥甲基糠醛，由主藥葡萄糖降解產(chǎn)生；RRt=0.67的雜質(zhì)為雜質(zhì)K；樣品和原料中均未檢出雜質(zhì)A、H、E。樣品中單個最大雜質(zhì)的平均含量為0.08%～0.10%，總雜質(zhì)的平均含量為0.20%，雜質(zhì)K的含量為0.05%；原料中單個雜質(zhì)的含量為0.06%，總雜質(zhì)的含量為0.20%；雜質(zhì)K的含量為0.05%。原料和樣品中雜質(zhì)K的含量一樣，說明雜質(zhì)K由原料帶入，提示相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)關(guān)注對雜質(zhì)K的控制。

3 討論

3.1 流動相的優(yōu)化 在前期研究中，參考了ChP2020、USP41和EP9.3中諾氟沙星原料有關(guān)物質(zhì)的檢測方法，其中USP41和EP9.3的檢測方法相同。ChP2020中只對雜質(zhì)A進(jìn)行了控制，未對雜質(zhì)E、H、K進(jìn)行控制，采用該方法測定，雜質(zhì)E和諾氟沙星主峰不能分離，雜質(zhì)K和本品中紫外光破壞的降解雜質(zhì)（RRt=0.75）的峰不能分離。USP41版中的方法對雜質(zhì)A、E、H、K均進(jìn)行控制，但使用的色譜柱較為特殊，在USP41中標(biāo)注的型號為L60，是在多孔硅膠表面進(jìn)行共價修飾棕櫚酰胺-丙基的C18柱。選用國內(nèi)生產(chǎn)填料工藝接近的色譜柱，采用USP41的方法進(jìn)行測定后，雜質(zhì)E和雜質(zhì)A的分離度不能滿足要求，該法對諾氟沙星葡萄糖注射液的雜質(zhì)檢出率較低，僅能檢出2個雜質(zhì)，色譜圖2中的RRt為0.51、0.59和0.67的色譜峰表現(xiàn)為一個峰。本研究采用國內(nèi)較常見的C18柱，對ChP2020中的流動相進(jìn)行優(yōu)化，選擇磷酸溶液-乙腈系統(tǒng)按不同比例進(jìn)行梯度洗脫，雜質(zhì)A、E、H、K和本品中各降解雜質(zhì)峰均能有效分離。在流動相中磷酸溶液濃度分別選擇了0.01、0.02、0.05 mol∕L的3個濃度進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)濃度為0.02 mol∕L時目標(biāo)物質(zhì)分離效果最好，出峰穩(wěn)定且峰形尖銳，故選擇磷酸溶液濃度為0.02 mol∕L。

3.2 檢測波長的選擇 采用二極管陣列檢測器對諾氟沙星、葡萄糖和雜質(zhì)峰在200～400 nm波長范圍進(jìn)行光譜掃描，諾氟沙星峰在波長278 nm處有最大吸收，最大單個雜質(zhì)的最大吸收波長在278 nm，雖雜質(zhì)A的最大吸收在262 nm，但在278 nm處也有吸收，同時由于其他破壞雜質(zhì)含量過低無法通過掃描獲得紫外吸收光譜以確定最大吸收波長，故根據(jù)諾氟沙星和最大雜質(zhì)的紫外吸收特征選擇278 nm作為檢測波長。

3.3 柱溫的考察 USP41中的測定方法柱溫要求為60℃，這個溫度是國內(nèi)較多數(shù)C18柱使用的極限溫度，在這個溫度下使用，色譜柱填料容易塌陷，導(dǎo)致色譜柱的使用壽命較短。ChP2020中的方法未對柱溫進(jìn)行要求?？疾?0、40、50℃時，各雜質(zhì)之間以及雜質(zhì)和主峰之間的分離度：柱溫為30℃時，雖然各雜質(zhì)峰分離較好，但柱壓較高；柱溫為50℃時，雜質(zhì)A和雜質(zhì)H峰分離度不能滿足要求；柱溫為40℃時，柱壓和各峰之間的分離度均良好，所以柱溫選擇40℃。

4 結(jié)論

本研究為諾氟沙星葡萄糖注射液提供了一種高效的有關(guān)物質(zhì)測定方法，所建立方法專屬性良好，空白輔料均不干擾測定，專屬性強(qiáng)、靈敏度高，能有效分離諾氟沙星葡萄糖注射液的主成分及各種降解雜質(zhì)。測定的方法和結(jié)果對有關(guān)生產(chǎn)企業(yè)加強(qiáng)原料、輔料質(zhì)量控制、改進(jìn)工藝并通過穩(wěn)定性試驗(yàn)考察制定更加合理的貯藏條件和有效期具有較強(qiáng)的指導(dǎo)意義。