齊君蔚 陳艷華 陳恒雷

（新疆大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院放射生態(tài)與離子束生物技術(shù)研究中心 烏魯木齊830046）

食用菌是可供人類(lèi)食用的大型真菌，在全世界范圍內(nèi)，中國(guó)是最早認(rèn)識(shí)食用菌且對(duì)其進(jìn)行有效利用的國(guó)家［1］。食用菌是21 世紀(jì)人類(lèi)食物中不可多得的綠色食品，具有高蛋白、低脂肪、低熱量、老少皆宜的特點(diǎn)，被譽(yù)為“素中之葷”、“上帝食品”、“健康食品”，其原因在于食用菌子實(shí)體和菌絲體所含有的真菌多糖、多肽類(lèi)以及其它極為豐富的活性成分，具有抗腫瘤、降血脂、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、保護(hù)心腦血管等多種藥用價(jià)值［2-5］。食用菌的生產(chǎn)可分為固體栽培和液體發(fā)酵兩種，固體栽培主要是為了獲得食用菌子實(shí)體，液體發(fā)酵主要是為了獲得食用菌菌絲體［6］，而制約食用菌生產(chǎn)效率的因素除了栽培技術(shù)和發(fā)酵水平外更關(guān)鍵的是菌種品質(zhì)，優(yōu)良菌株的選育是食用菌產(chǎn)業(yè)永續(xù)發(fā)展的根本保證。

離子束生物技術(shù)是20世紀(jì)80年代中期由中國(guó)科學(xué)家開(kāi)創(chuàng)的一種具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的生物育種新技術(shù)，該技術(shù)已成功應(yīng)用于小麥、水稻、玉米、大豆等大宗糧食作物的品種改良和抗生素、酶制劑、氨基酸產(chǎn)生菌等工業(yè)微生物及石油降解微生物的誘變育種［7-9］。由于重離子注入具有能量沉積、動(dòng)量傳遞、質(zhì)量沉積、電荷中和與交換等聯(lián)合作用，其生物學(xué)效應(yīng)更加顯著［10-12］。本研究基于低能重離子業(yè)已明確的誘變功效，利用低能氮離子注入3 種食用菌分生孢子，通過(guò)洗脫鏡檢、平板培養(yǎng)、液體發(fā)酵，揭示低能重離子注入食用菌的劑量效應(yīng)關(guān)系，可為食用菌的低能重離子誘變育種提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和方法學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

阿魏菇（Pleurotus ferulae）、香菇（Lentinula edodes）、猴頭菇（Hericium erinaceus）子實(shí)體，均由烏魯木齊市新北園春蔬菜批發(fā)市場(chǎng)采購(gòu)，分生孢子由本實(shí)驗(yàn)室孢子分離所得。

1.1.2 儀器

LCD-1000 型多功能離子注入機(jī)，西南核物理研究所；LRH-150B生化培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠；ZHWY-2102 新型恒溫震蕩器，烏魯木齊祥生儀器有限公司；522分光光度計(jì)，北京普源精電科技有限公司；METTLER-TOLEDO 精密分析天平（萬(wàn)分之一），METTLER TOLEDO公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基的成分為（w/v）：馬鈴薯20%（煮汁過(guò)濾）、葡萄糖2.0%、蛋白胨0.5%、磷酸二氫鉀0.20%、硫酸鎂0.15%、瓊脂粉2.0%，自來(lái)水定容，pH值自然。

液體培養(yǎng)基的成分為（w/v）：馬鈴薯20%（煮汁過(guò)濾）、小麥粉2.0%、酵母膏0.5%、磷酸二氫鉀0.20%、硫酸鎂0.15%、自來(lái)水定容，pH值自然。

1.2 方法

1.2.1 分生孢子懸液的制備及計(jì)數(shù)

取一朵新鮮的食用菌子實(shí)體去柄后置于無(wú)菌三角支架上，支架下放一無(wú)菌空白培養(yǎng)皿，一起置于干燥器中自然噴發(fā)，用無(wú)菌接種環(huán)輔助10 mL無(wú)菌水洗脫乳白色分生孢子，梯度稀釋后用移液槍吸取0.2 mL 分生孢子懸液涂布于無(wú)菌空白培養(yǎng)皿，置于超凈工作臺(tái)，風(fēng)干制備菌膜。同時(shí)，取0.2 mL分生孢子懸液用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.2 低能氮離子注入誘變

將風(fēng)干制備的3 種食用菌分生孢子菌膜置于LCD-1000 型多功能離子注入機(jī)的小靶室（見(jiàn)圖1），分別采用能量15 keV、注量（0、2、4、6、8、10、12、14）×1015cm-2的N+束，在壓強(qiáng)為2.5×10-3Pa的真空狀態(tài)下，以5 s/次、間隔5 s的脈沖方式注入。

1.2.3 培養(yǎng)方法

平板培養(yǎng)。分別用2 mL 無(wú)菌水將小靶室中經(jīng)不同劑量離子束注入后的3種食用菌分生孢子洗脫轉(zhuǎn)接到5 皿平板固體培養(yǎng)基上，26 ℃恒溫培養(yǎng)，動(dòng)態(tài)觀察3種食用菌新生菌落菌絲體在平板培養(yǎng)基上的長(zhǎng)勢(shì)，將菌絲體長(zhǎng)勢(shì)與對(duì)照菌株差異顯著的菌株分別轉(zhuǎn)接到斜面和平板固體培養(yǎng)基上26 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，動(dòng)態(tài)觀察和檢測(cè)平板培養(yǎng)菌絲體長(zhǎng)勢(shì)，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)，斜面培養(yǎng)菌絲體用于搖瓶發(fā)酵。

圖1 LCD-1000多功能離子注入機(jī)靶室示意圖1.離子束；2.大靶室；3.轉(zhuǎn)盤(pán)；4.抽氣系統(tǒng)；5.小靶室；6.無(wú)菌室；7.手動(dòng)閘門(mén)；8.小機(jī)械泵；9.送無(wú)菌風(fēng)；10.電磁閘門(mén)；11.紫外線燈管Fig.1 Diagram of target chamber for LCD-1000 multi-functional Ion implanter1.ion beam;2.large target chamber;3.turntable;4.air extraction system;5.small target chamber;6.sterile room;7.manual gate;8.small mechanical pump;9.sterile air supply;10.electromagnetic gate;11.ultraviolet lamp

搖瓶發(fā)酵。用無(wú)菌接種鉤刮取固體斜面菌絲體，按每個(gè)斜面菌種轉(zhuǎn)接3 瓶的接種量接種于裝有150 mL 液體培養(yǎng)基的500 mL 搖瓶中，轉(zhuǎn)速160 r/min、26 ℃恒溫培養(yǎng)10 d。發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)過(guò)濾收集菌絲體并測(cè)定其生物量和多糖含量，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.2.4 測(cè)定方法

菌絲體生物量測(cè)定。將發(fā)酵液倒入漏斗墊有8層紗布的抽濾瓶中，用純凈水洗脫過(guò)濾后收集菌絲體，所得菌絲體置于空白培養(yǎng)皿中放入100 ℃干燥箱干燥至恒重后，用分析天平稱(chēng)其質(zhì)量。

菌絲體多糖含量測(cè)定。將稱(chēng)重后的菌絲體研磨至粉，取10 g溶解于100 mL純凈水中，95 ℃熱水浸提3 次，每次30 min，合并浸提液后用苯酚-濃硫酸法測(cè)定菌絲體多糖含量［13］。

2 結(jié)果與分析

2.1 低能氮離子注入對(duì)三種食用菌分生孢子的刻蝕作用

通過(guò)低能氮離子注入對(duì)3種食用菌分生孢子刻蝕作用試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)圖2）不難看出，未經(jīng)低能氮離子注入的3種食用菌分生孢子細(xì)胞完整，呈現(xiàn)為橢圓形或圓形，而經(jīng)過(guò)能量15 keV、注量12×1015cm?2低能氮離子注入的3種食用菌分生孢子刻蝕作用明顯，低能氮離子不同程度破壞了細(xì)胞的完整結(jié)構(gòu)，有些細(xì)胞被打碎，有些細(xì)胞變形，有些細(xì)胞只剩下了孢子殼，內(nèi)容物全部被低能氮離子轟擊出來(lái)。出現(xiàn)這種生物學(xué)效應(yīng)的原因，從原子分子尺度來(lái)講，主要是由于低能重離子注入具有能量轉(zhuǎn)換、動(dòng)量傳遞、質(zhì)量沉積三重作用，當(dāng)入射重離子的速度不是很高時(shí)，速度越慢的重離子掠過(guò)電子的時(shí)間越長(zhǎng)，電子獲得的動(dòng)量越大，重離子的電離損失率也就越大；從細(xì)胞尺度來(lái)看，主要是因?yàn)椴捎妹}沖方式不斷對(duì)食用菌分生孢子細(xì)胞進(jìn)行注入，產(chǎn)生機(jī)械損傷和熱脹效應(yīng)，當(dāng)作用到某個(gè)分生孢子的注入劑量達(dá)到某個(gè)值時(shí)，細(xì)胞膜破裂、內(nèi)容物溢出。

圖2 低能氮離子注入對(duì)3種食用菌分生孢子的刻蝕作用(400×)Fig.2 Etching for conidium of three edible fungi by low-energy nitrogen ion implantation(400×)

通過(guò)低能氮離子注入對(duì)3種食用菌分生孢子刻蝕作用試驗(yàn)結(jié)果（圖2）不難看出，未經(jīng)低能氮離子注入的3種食用菌分生孢子細(xì)胞完整，呈現(xiàn)為橢圓形或圓形，而經(jīng)過(guò)能量15 keV、注量12×1015cm?2低能氮離子注入的3種食用菌分生孢子刻蝕作用明顯，低能氮離子不同程度破壞了細(xì)胞的完整結(jié)構(gòu)，有些細(xì)胞被打碎，有些細(xì)胞變形，有些細(xì)胞只剩下了孢子殼，內(nèi)容物全部被低能氮離子轟擊出來(lái)。出現(xiàn)這種生物學(xué)效應(yīng)的原因，從原子分子尺度來(lái)講，主要是由于低能重離子注入具有能量轉(zhuǎn)換、動(dòng)量傳遞、質(zhì)量沉積三重作用，當(dāng)入射重離子的速度不是很高時(shí)，速度越慢的重離子掠過(guò)電子的時(shí)間越長(zhǎng)，電子獲得的動(dòng)量越大，重離子的電離損失率也就越大；從細(xì)胞尺度來(lái)看，主要是因?yàn)椴捎妹}沖方式不斷對(duì)食用菌分生孢子細(xì)胞進(jìn)行注入，產(chǎn)生機(jī)械損傷和熱脹效應(yīng)，當(dāng)作用到某個(gè)分生孢子的注入劑量達(dá)到某個(gè)值時(shí)，細(xì)胞膜破裂、內(nèi)容物溢出。

2.2 不同劑量低能氮離子注入對(duì)3種食用菌存活率的影響

通過(guò)不同劑量低能氮離子注入對(duì)3種食用菌存活率的影響試驗(yàn)曲線（圖3）可以看出，隨著低能氮離子注入劑量的增加，3種食用菌的存活率均呈現(xiàn)先驟減后緩慢增大再陡降的“馬鞍型”劑量-效應(yīng)曲線。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因主要是因?yàn)榈蛣┝康腘+束射程較短只對(duì)分生孢子細(xì)胞表面產(chǎn)生刻蝕作用，未對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損傷，因而細(xì)胞存活率較高；隨著注入劑量的增加，低能氮離子對(duì)分生孢子細(xì)胞的刻蝕作用越來(lái)越嚴(yán)重，同時(shí)，N+束與細(xì)胞作用產(chǎn)生大量次生粒子和自由基損及細(xì)胞內(nèi)部活性物質(zhì)，從而使細(xì)胞存活率急劇下降，但下降到一定值后，細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到某種動(dòng)態(tài)平衡，細(xì)胞中的自我修復(fù)機(jī)制被激活，使得存活率略有回升；當(dāng)注入劑量再增大時(shí)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，存活率驟然下降。

圖3 不同劑量低能氮離子注入對(duì)3種食用菌存活率的影響：(a)阿魏菇；(b)香菇；(c)猴頭菇Fig.3 The effect of different doses of low-energy nitrogen ion implantation on the survival rate of three edible fungi：（a）Pleurotus ferulae；（b）Lentinus edodes；（c）Hericium erinaceus

2.3 不同劑量低能氮離子注入對(duì)3種食用菌平板培養(yǎng)菌絲體長(zhǎng)勢(shì)的影響

通過(guò)不同劑量低能氮離子注入對(duì)3種食用菌平板培養(yǎng)菌絲體長(zhǎng)勢(shì)影響的試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表1）發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)離子束注入平板培養(yǎng)菌絲體長(zhǎng)勢(shì)相比，所有劑量下菌絲體密度均有所增大，菌落直徑差異顯著，尤以存活率曲線峰值劑量時(shí)菌絲體密度和菌落直徑最大；相較于出發(fā)菌株，各劑量下菌絲體顏色略顯不同，氣生菌絲老化現(xiàn)象均不明顯，特別是存活率曲線峰值劑量下平板培養(yǎng)第7天的菌絲體基本都未出現(xiàn)結(jié)皮。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)楫?dāng)注入劑量介于某個(gè)劑量區(qū)間時(shí)，低能N+束與分生孢子細(xì)胞作用產(chǎn)生的大量次級(jí)粒子的電離作用有可能引起細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)DNA 雙鏈斷裂，細(xì)胞很難自我修復(fù)進(jìn)而發(fā)生遺傳變異，出現(xiàn)老化延遲生物學(xué)效應(yīng)。

表1 不同劑量低能氮離子注入對(duì)3種食用菌平板培養(yǎng)菌絲體長(zhǎng)勢(shì)的影響（第7天）Table 1 Effects of different doses of low-energy nitrogen ion implantation on mycelium growth of three edible fungi in plate culture（No.7 day）(xˉ±s，n=3）

2.4 不同劑量低能氮離子注入對(duì)3種食用菌搖瓶發(fā)酵菌絲體生物量及多糖含量的影響

通過(guò)不同劑量低能氮離子注入對(duì)3種食用菌搖瓶發(fā)酵菌絲體生物量及多糖含量影響的試驗(yàn)結(jié)果（表2）發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)離子束注入搖瓶發(fā)酵菌絲體生物量相比，所有劑量下菌絲體生物量均有所增大，尤以存活率曲線峰值劑量區(qū)間內(nèi)的菌絲體生物量最大；相較于出發(fā)菌株，各劑量下3種食用菌菌絲體多糖含量各不相同，特別是存活率曲線峰值劑量下菌絲體多糖含量普遍較高。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)楫?dāng)注入劑量介于某個(gè)劑量區(qū)間時(shí)，低能N+束與分生孢子細(xì)胞作用產(chǎn)生的大量次級(jí)粒子的電離作用有可能引起細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)DNA 雙鏈斷裂，細(xì)胞很難自我修復(fù)進(jìn)而有部分菌株發(fā)生了多糖高產(chǎn)性狀的遺傳變異。

表2 不同劑量低能氮離子注入對(duì)3種食用菌搖瓶發(fā)酵菌絲體生物量及多糖含量的影響（第10天）Table 2 Effects of different doses of low-energy nitrogen ion implantation on mycelium biomass and polysaccharide content of three edible fungi in flask fermentation（No.10 day）(xˉ±s，n=3）

3 結(jié)論

（1）低能氮離子注入對(duì)3種食用菌分生孢子的刻蝕作用顯著。未經(jīng)離子注入的3種食用菌分生孢子細(xì)胞完整，呈現(xiàn)為橢圓形或圓形，而經(jīng)過(guò)能量15 keV、注量12×1015cm?2低能氮離子注入的3種食用菌分生孢子刻蝕作用明顯。低能氮離子不同程度破壞了細(xì)胞的完整結(jié)構(gòu)，有些細(xì)胞被打碎，有些細(xì)胞變形，有些細(xì)胞只剩下了孢子殼，內(nèi)容物全部被低能氮離子轟擊出來(lái)。

（2）采用15 keV 不同注量（0、2、4、6、8、10、12、14）×1015cm?2的低能氮離子注入誘變，3種食用菌的存活率均呈現(xiàn)先驟減后緩慢增大再陡降的“馬鞍型”劑量-效應(yīng)曲線，這與王連峰等［14］開(kāi)展的阿魏菇多糖高產(chǎn)菌株篩選的離子束誘變和復(fù)合誘變對(duì)比研究試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

（3）與未經(jīng)離子束注入平板培養(yǎng)菌絲體長(zhǎng)勢(shì)相比，所有劑量下3種食用菌菌絲體密度均有所增大，菌落直徑差異顯著，尤以存活率曲線峰值劑量時(shí)菌絲體密度和菌落直徑最大，菌落直徑均超過(guò)8.20 cm；相較于出發(fā)菌株，各劑量下菌絲體顏色略顯不同，氣生菌絲老化現(xiàn)象均不明顯，特別是存活率曲線峰值劑量下平板培養(yǎng)第7天的菌絲體基本都未出現(xiàn)結(jié)皮。

（4）與未經(jīng)離子束注入搖瓶發(fā)酵菌絲體生物量相比，所有劑量下3種食用菌菌絲體生物量均有所增大，尤以存活率曲線峰值劑量區(qū)間內(nèi)的菌絲體生物量最大，均超過(guò)15.30 g?L?1；相較于出發(fā)菌株，各劑量下3 種食用菌菌絲體多糖含量各不相同，但在存活率曲線峰值劑量下3種食用菌菌絲體多糖含量普遍較高。

（5）綜合低能氮離子注入對(duì)3種食用菌的刻蝕作用、存活率、平板培養(yǎng)菌絲體長(zhǎng)勢(shì)、搖瓶發(fā)酵菌絲體生物量及多糖含量影響的試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著注入劑量的增加，低能重離子對(duì)食用菌分生孢子細(xì)胞的刻蝕作用加之產(chǎn)生的次級(jí)粒子特別是X射線能夠穿透到很深的地方［15］，有可能引起細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)DNA 單鏈或雙鏈的斷裂，根據(jù)輻射引起雙重作用理論［16］，DNA雙鏈斷裂時(shí)修復(fù)變得很困難，進(jìn)而會(huì)發(fā)生各種遺傳性狀的基因突變，低能重離子注入對(duì)生物細(xì)胞及其DNA 損傷、修復(fù)的影響仍需更深入的研究［17］。