吳堯 韓玉 揭春玉 王林 吳雙清

摘要 ：采用人工接種方法，用7個(gè)中國鑒別品種和95個(gè)自選資源材料對2014年至2015年間采自湖北省隨州地區(qū)的76個(gè)稻瘟病菌單孢菌株進(jìn)行致病型鑒定。分別利用傳統(tǒng)生理小種種群劃分方法和近鄰傳播聚類法（affinity propagation clustering，AP聚類法）進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)分析，比較兩種方法的差異。結(jié)果表明，傳統(tǒng)生理小種種群劃分方法將76個(gè)菌株分為6個(gè)菌群，14個(gè)中國小種， ZB菌群為優(yōu)勢種群，占比65.79%，ZB15為優(yōu)勢生理小種，占比達(dá)到60.53%;近鄰傳播聚類法將76個(gè)菌株分為14個(gè)菌群，Cluster 2、Cluster 6、Cluster 7、Cluster 8為隨州地區(qū)優(yōu)勢菌群，占比分別為18.42%、19.74%、22.37%、17.11%，Cluster 6、Cluster 7和Cluster 8具有相對較高的致病力;兩種方法劃分結(jié)果雖不完全一一對應(yīng)，但劃分趨勢相同，近鄰傳播聚類法在稻瘟病菌種群結(jié)構(gòu)研究中具有一定應(yīng)用前景;根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果篩選出1個(gè)代表隨州地區(qū)稻瘟病總致病譜的菌群，菌群由12個(gè)菌株組成，將其命名為“隨州生態(tài)模式菌群”。

關(guān)鍵詞 ：湖北; 隨州; 稻瘟病菌; 菌群結(jié)構(gòu); 生態(tài)模式菌株; 近鄰傳播聚類

中圖分類號：

S 435.111.41

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020122

Population structure analysis of rice blast fungus （Magnaporthe oryzae） and

the establishment of ecological type flora in Suizhou area of Hubei province

WU Yao， HAN Yu， JIE Chunyu， WANG Lin， WU Shuangqing*

（Enshi Tujia and Miao Autonomous Prefecture Academy of Agricultural Sciences， Hubei Province， Enshi 445000， China）

Abstract

Seven Chinese cultivars and 95 self-selected varieties were used to artificially inoculate and identify 76 isolates of Magnaporthe oryzae collected from Suizhou area of Hubei province from 2014 to 2015. The population structure was analyzed by using traditional race population division method and affinity propagation clustering. The differences between the two methods were compared. The results showed that 76 isolates were divided into six groups and 14 Chinese races by the traditional race population division method. ZB group was the dominant population， accounting for 65.79%， and ZB15 was the dominant race， accounting for 60.53%. 76 isolates were divided into 14 clusters by affinity propagation clustering， and Cluster 2， Cluster 6， Cluster 7 and Cluster 8 were the dominant groups in Suizhou， accounting for 18.42%， 19.74%， 22.37%， and 17.11%， respectively. Cluster 6， Cluster 7 and Cluster 8 have relatively high pathogenicity. Although the division results of the two methods are not completely one-to-one， but the division trend is the same. The affinity propagation clustering has certain application prospects in studying the population structure of M.oryzae. A group of isolates， representing the total pathogenic spectrum of M.oryzae in Suizhou area， was selected， consisting of 12 isolates， which was named “Suizhou ecological type flora”.

Key words

Hubei; Suizhou; Magnaporthe oryzae; population structure; ecological type isolate; affinity propagation clustering

稻瘟病是影響水稻生產(chǎn)的主要病害之一，水稻整個(gè)生育期均可感染稻瘟病。稻瘟病大暴發(fā)在我國各水稻種植區(qū)時(shí)有發(fā)生。2014年和2015年湖北省中稻稻瘟病大發(fā)生，除鄂西南山區(qū)稻瘟病常發(fā)區(qū)外，隨州、孝感、荊州、荊門等地區(qū)稻瘟病也嚴(yán)重發(fā)生，其中隨州損失最大，造成400 hm2水稻基本絕收[12]。

到目前為止，抗病品種的選育與利用依然是防治稻瘟病最為環(huán)保且經(jīng)濟(jì)的手段。但在生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，原本抗性表現(xiàn)較好的水稻品種在連續(xù)種植多年后，抗性逐漸喪失，其最主要的原因是稻瘟病菌種群結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。因此，弄清楚當(dāng)?shù)氐疚敛【N群結(jié)構(gòu)，對指導(dǎo)抗病育種和建立稻瘟病持久抗性具有非常重要的意義。

基于“基因?qū)颉奔僬f理論[3]，稻瘟病暴發(fā)流行可解釋為稻瘟病菌的無毒基因與水稻品種抗病基因間的直接或間接相互作用。因此，利用合適的鑒別品種對稻區(qū)菌群進(jìn)行分析是了解當(dāng)?shù)氐疚敛【N群結(jié)構(gòu)及種群多樣性的有效手段。為此，國內(nèi)外學(xué)者先后設(shè)置了多套鑒別品種。1960年美國學(xué)者Latterell用‘辛尼斯等10個(gè)品種建立了美國稻瘟病菌生理小種鑒別品種[4]，1965年將品種增加至12個(gè)[5];1961年日本建立了第一套日本鑒別品種，1976年建立了由9個(gè)粳稻品種組成的第二套鑒別品種[67];1961年我國臺灣用‘昆山五香粳等16個(gè)品種對不同來源菌株進(jìn)行了鑒定[8];1962年韓國學(xué)者用‘辛尼斯等10個(gè)鑒別品種對來自不同區(qū)域的菌株進(jìn)行了鑒定[9];1963年菲律賓通過對11個(gè)美國鑒別品種、12個(gè)日本鑒別品種、16個(gè)我國臺灣鑒別品種以及東南亞和南亞等地的品種進(jìn)行鑒別能力篩選，篩選出了由‘克拉羅西等12個(gè)品種組成的菲律賓鑒別品種[10];1963年-1965年由日、美學(xué)者協(xié)作篩選出了‘拉米納德Str.3等8個(gè)品種組成的國際鑒別品種[11];1976年我國建立了全國稻瘟病生理小種聯(lián)合試驗(yàn)組，利用全國21個(gè)省、市、區(qū)的1 739個(gè)單孢分離物對212個(gè)水稻品種進(jìn)行篩選測定，從中選出‘特特勃‘珍龍13‘四豐43‘東農(nóng)363‘關(guān)東51‘合江18和‘麗江新團(tuán)黑谷7個(gè)品種作為中國鑒別品種[12];20世紀(jì)80年代中期，國際水稻研究所育成4個(gè)近等基因系[13];Ling等以普感品種‘麗江新團(tuán)黑谷為輪回親本，選育出6個(gè)單基因近等基因系[14]; 國際水稻所與日本學(xué)者合作，分別于2000年將24個(gè)稻瘟病抗性基因?qū)氲健惤聢F(tuán)黑谷背景中育成31個(gè)單基因系，于2010年將11個(gè)抗性基因通過連續(xù)回交導(dǎo)入‘麗江新團(tuán)黑谷中育成了20個(gè)近等基因系，于2011年將14個(gè)抗性基因通過連續(xù)回交導(dǎo)入到‘CO39中育成了27個(gè)CO39-ML[1517];2015年印度學(xué)者以印度香米‘Pusa Basmati 1為背景通過回交導(dǎo)入7個(gè)抗性基因，育成了36個(gè)近等基因系，包含14個(gè)單基因系，16個(gè)雙重基因堆疊系（two-gene pyramids），6個(gè)三重基因堆疊系（three-gene pyramids）[18]。

為理清隨州地區(qū)稻瘟病菌種群結(jié)構(gòu)，2018年至2019年間筆者使用95個(gè)自選資源材料和7個(gè)中國鑒別品種對湖北隨州稻瘟病大發(fā)生期間采集的菌株進(jìn)行致病型鑒定。利用傳統(tǒng)生理小種種群劃分方法，并探索性地使用近鄰傳播聚類法對菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。本文是對隨州地區(qū)稻瘟病菌種群結(jié)構(gòu)調(diào)查的首次報(bào)道，試驗(yàn)結(jié)果對隨州地區(qū)以及江漢平原抗稻瘟病育種和水稻品種布局具有重要參考意義。

1 材料與方法

1.1 參試菌株

參試稻瘟病菌單孢菌株76個(gè)（表1），從隨州市何店鎮(zhèn)諶家?guī)X村、何店鎮(zhèn)王店村、厲山鎮(zhèn)、萬店鎮(zhèn)夾子溝村、新街鎮(zhèn)劉家崗村等5處地點(diǎn)采集的43份標(biāo)樣中分離得到，標(biāo)樣采集時(shí)間為2014年至2015年，單孢分離時(shí)間為2018年。

1.2 鑒別材料

鑒別材料共102個(gè)，包括7個(gè)中國鑒別品種和95個(gè)自選資源材料。7個(gè)中國鑒別品種分別為：‘特特勃‘珍龍13‘四豐43‘東農(nóng)363‘關(guān)東51‘合江18和‘麗江新團(tuán)黑谷。95個(gè)自選資源材料為恩施自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥所經(jīng)30余年收集改良篩選出的稻瘟病監(jiān)測材料。

1.3 育苗與接種

試驗(yàn)采用苗期孢子懸浮液人工噴霧接種，接種、隔離、誘導(dǎo)發(fā)病均在恩施自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物病害鑒定大棚內(nèi)進(jìn)行，具體操作如下：

在1.5 m×1.5 m×0.25 m的育秧池內(nèi)育苗，池內(nèi)填充肥沃菜園土，灌水整平。每個(gè)育秧池內(nèi)條播3行‘麗江新團(tuán)黑谷分廂，同時(shí)作為誘發(fā)品種和指示品種。廂內(nèi)每個(gè)鑒別材料播種1行，每行5粒種子，株距2.5 cm，行距5 cm。秧苗生長期間酌情增施氮肥，保持葉片嫩綠。秧齡達(dá)到三葉一心至四葉期時(shí)擇陰雨天傍晚進(jìn)行接種。

菌株誘導(dǎo)產(chǎn)孢[19]，用0.02% 吐溫-20溶液洗脫孢子，孢子懸浮液濃度為100倍顯微鏡視野下10個(gè)以上。接種至調(diào)查結(jié)束，整個(gè)時(shí)間段均用自制白色無紡布罩將育秧池罩住，保持各育秧池之間嚴(yán)格隔離。用自制文丘里噴頭連接空氣壓縮機(jī)噴霧，一個(gè)菌株接種一個(gè)育秧池，每個(gè)育秧池內(nèi)接種300 mL菌液，接種完畢后遮光處理48 h，后期適時(shí)噴霧降溫保濕，維持大棚溫濕度相對恒定。

1.4 調(diào)查與分級

接種10 d后開始調(diào)查，分級標(biāo)準(zhǔn)參考《水稻品種試驗(yàn)稻瘟病抗性鑒定與評價(jià)技術(shù)規(guī)程（NY/T 2646-2014）》[20]，發(fā)病等級由輕到重分為0～9共10個(gè)等級。調(diào)查2次，間隔7 d。最終統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)取兩次調(diào)查值的最高值。0級至3級定義為抗病，記為“R”，4級至9級定義為感病，記為“S”。

1.5 種菌結(jié)構(gòu)及多樣性分析

根據(jù)鑒別品種的反應(yīng)類型，“S”記為1，“R”記為0;中國小種的劃分方法參照全國稻瘟病菌生理小種聯(lián)合試驗(yàn)組的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[12]。

近鄰傳播聚類算法是將全部樣本看作網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)，然后通過網(wǎng)絡(luò)中各條邊的消息傳遞計(jì)算出各樣本的聚類中心。聚類過程中，共有兩種消息在各節(jié)點(diǎn)間傳遞，分別是吸引度（responsibility）和歸屬度（availability）。近鄰傳播聚類算法通過迭代過程不斷更新每一個(gè)點(diǎn)的吸引度和歸屬度值，直到產(chǎn)生m個(gè)高質(zhì)量的exemplar（類似于質(zhì)心），同時(shí)將其余的數(shù)據(jù)點(diǎn)分配到相應(yīng)的聚類中[21]。統(tǒng)計(jì)分析及作圖軟件使用R-3.5.1。

1.6 生態(tài)模式菌群的構(gòu)建

稻瘟病生態(tài)模式菌群是指在特定生態(tài)稻區(qū)內(nèi)通過稻瘟病單孢致病型監(jiān)測及其相關(guān)數(shù)據(jù)分析，選擇代表該生態(tài)稻區(qū)稻瘟病菌種群綜合致病力的不同致病型菌株組成的群體。

篩選原則是：首先找出致病譜最廣的菌株A，觀察菌株A不能侵染的品種，將其作為監(jiān)測品種，從剩余菌株中找出能侵染這些監(jiān)測品種個(gè)數(shù)最多的菌株B，若有多個(gè)菌株侵染個(gè)數(shù)相同，則比較它們的總致病率，總致病率最高的菌株入選;然后再把菌株A和B都不能侵染的品種作為監(jiān)測品種，從剩余菌株中找出能侵染這些監(jiān)測品種個(gè)數(shù)最多的菌株C，依次類推，直到組合菌株不能侵染的監(jiān)測品種也不能被剩余的所有菌株侵染為止。

2 結(jié)果與分析

2.1 中國小種劃分

76個(gè)單孢菌株在7個(gè)中國鑒別品種上進(jìn)行鑒定，按鑒別品種發(fā)病表現(xiàn)可將菌株分為6個(gè)菌群，14個(gè)中國小種（表2）。ZA群出現(xiàn)頻率為3.95%，包括ZA01、ZA11、ZA15等3個(gè)小種，出現(xiàn)頻率均為1.32%;ZB群出現(xiàn)頻率為65.79%，包括ZB09、ZB11、ZB15、ZB31等4個(gè)小種，出現(xiàn)頻率分別為1.32%、1.32%、6053%、2.63%;ZC群出現(xiàn)頻率為5.26%，包括ZC05和ZC15兩個(gè)小種，出現(xiàn)頻率分別為1.32%和3.95%;ZD群出現(xiàn)頻率為5.26%，有ZD01、ZD05、ZD07等3個(gè)小種，出現(xiàn)頻率分別為1.32%、1.32%、2.63%;ZE群出現(xiàn)頻率為2.63%，有ZE011個(gè)小種;ZG群出現(xiàn)頻率為17.11%，有ZG011個(gè)小種。

其中ZB菌群為優(yōu)勢種群，占比65.79%;其次為ZG菌群，占比17.11%;出現(xiàn)頻率較低的是ZA、ZC、ZD、ZE菌群，合占17.11%;ZF種群未出現(xiàn);ZB15生理小種占絕對優(yōu)勢，所占比例達(dá)到60.53%，ZG01生理小種其次，所占比例為17.11%。

2.2 近鄰傳播聚類法劃分菌群

76個(gè)菌株在95個(gè)自選資源材料上的反應(yīng)類型經(jīng)過近鄰傳播聚類法分析，結(jié)果表明，最佳聚類組數(shù)為14個(gè)，每個(gè)聚類組均給出一個(gè)具有代表性樣例的菌株。Cluster 1、Cluster 3、Cluster 4、Cluster 9、Cluster 10、Cluster 11、Cluster 12、Cluster 13、Cluster 14等9個(gè)聚類組均只含有單個(gè)菌株，所占比例均為1.32%，致病率分別為1.05%、13.68%、15.79%、35.79%、35.79%、35.79%、38.95%、38.95%、40.00%。Cluster 2、Cluster 5、Cluster 6、Cluster 7、Cluster 8為多菌株聚類組，所含菌株數(shù)量分別為14、8、15、17、13個(gè)，所占比例分別為18.42%、10.53%、19.74%、22.37%、17.11%，致病率范圍分別為7.37%～12.63%、14.74%～22.11%、15.79%～25.26%、23.16%～32.63%、30.53%～35.79%（表3）。從圖1中可以看出，EBSN205-2、EBSN175-2、EBSW157-2、EBSN195-4、EBSN181-1、EBSN170-2、EBSL154-2、EBSN205-4、EBSN184-1與其他菌株的交叉點(diǎn)顏色均較深，差異較大。在聚類樹上這9個(gè)菌株處在相似水平最低的位置，而它們之中又以EBSN205-2具有最低的相似水平。這9個(gè)菌株各自單獨(dú)形成聚類組，分別對應(yīng)Cluster 12、Cluster 14、Cluster 13、Cluster 11、Cluster 1、Cluster 9、 Cluster 10、 Cluster 3、Cluster 4。其他多菌株聚類組內(nèi)菌株之間矩陣交叉點(diǎn)顏色較淺，相似度較高。此外，可以看出Cluster 6、Cluster 7、Cluster 8雖然被分為3個(gè)聚類組，但它們處在同一分支下，菌株之間矩陣交叉區(qū)域顏色較淺，相似度較高。Cluster 2和Cluster 5雖然也處于同一分支，但該分支在聚類樹上處于相似水平較低的位置，聚類組間菌株矩陣交叉點(diǎn)顏色也相應(yīng)較深，相似度較低。

由此可見，Cluster 2、 Cluster 6、 Cluster 7、 Cluster 8在隨州地區(qū)為優(yōu)勢菌群，Cluster 6、Cluster 7和Cluster 8具有較高致病力，且相似水平較高。EBSN175-2為最強(qiáng)致病力菌株，所在的Cluster 14菌株數(shù)量少，暫未形成規(guī)模暴發(fā)。

2.3 兩種菌群劃分方法比較

76個(gè)菌株在7個(gè)中國鑒別品種上被分為6個(gè)菌群，而在95個(gè)自選常規(guī)水稻品種上被分為14個(gè)菌群。雖然兩種方法劃分的菌群沒有出現(xiàn)嚴(yán)格的一一對應(yīng)的關(guān)系，但通過觀察可以發(fā)現(xiàn)，兩種方法的劃分趨勢是一致的，如ZG01對應(yīng)Cluster 2，ZB15主要對應(yīng)Cluster 6、Cluster 7和Cluster 8，僅個(gè)別聚類組與生理小種劃分對應(yīng)關(guān)系不明顯，如Cluster 5聚類組中的菌株無規(guī)律地分散于ZB、ZC、ZD、ZE、ZG等多個(gè)生理小種菌群中（表4）。結(jié)果表明，利用95個(gè)自選資源材料結(jié)合近鄰傳播聚類法對稻瘟病菌株進(jìn)行聚類分析劃分菌群較傳統(tǒng)生理小種劃分具有更高的分辨率，且劃分趨勢相同，用于致病型分析是可行的。

2.4隨州生態(tài)模式菌群

分析76個(gè)隨州稻瘟病菌單孢分離物在102個(gè)鑒別材料上的反應(yīng)，最終從中篩選出了1個(gè)“隨州生態(tài)模式菌群”，該模式菌群致病譜與76個(gè)隨州稻瘟病菌單孢分離物的總致病譜相同，總致病率均為76.47%。模式菌群包含有12個(gè)菌株，致病率從15.69%至44.12%，分屬于ZA、ZB、ZC、ZE等4個(gè)生理小種群或Cluster 3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14等11個(gè)聚類群（表5）。

3 結(jié)論與討論

水稻品種的抗感表現(xiàn)是由稻瘟病菌的致病力、環(huán)境適應(yīng)性、寄主的抗病力及敏感生育期等多種遺傳特性以及特定的環(huán)境因素共同決定的，因此利用稻瘟病菌和水稻品種之間的相互關(guān)系來分析稻瘟病菌致病型和評價(jià)抗病品種抗病力是符合實(shí)際生產(chǎn)規(guī)律的。

本研究利用7個(gè)中國鑒別品種和95個(gè)自選資源材料，對2014年至2015年采自隨州的76個(gè)稻瘟病菌單孢菌株進(jìn)行了致病型分析。76個(gè)稻瘟病菌菌株被分為6個(gè)菌群，14個(gè)中國小種，ZB為優(yōu)勢種群，ZB15和ZG01為優(yōu)勢生理小種，且出現(xiàn)頻率遠(yuǎn)高于其他小種。20世紀(jì)80年代末和90年代初有報(bào)道稱，湖北省生理小種優(yōu)勢種群主要是ZB和ZG[2224]，此后較長時(shí)間研究報(bào)道湖北省生理小種優(yōu)勢種群轉(zhuǎn)變?yōu)閆A[2528]，但2009年后相關(guān)報(bào)道認(rèn)為，ZB出現(xiàn)頻率增加，又逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榇蝺?yōu)勢種群和優(yōu)勢種群[19， 2930]。本研究也進(jìn)一步指向了這一變化趨勢，由此推斷近年來隨州地區(qū)乃至江漢平原稻瘟病大暴發(fā)的現(xiàn)象極有可能是由于南方秈型菌群ZB大量增殖所造成。

本研究探索性地在植物病原致病型分類領(lǐng)域使用了近鄰傳播聚類分析法，76個(gè)稻瘟病菌被自動劃分為14個(gè)菌群。近鄰傳播聚類分析法和傳統(tǒng)生理小種種群劃分法得到的劃分趨勢相對一致，且近鄰傳播聚類分析法具有相對較高的分辨率。傳統(tǒng)生理小種種群劃分方法的鑒別品種固定為7個(gè)，根據(jù)相應(yīng)劃分方法，不同來源菌株最多可劃分為ZA至ZH共8個(gè)菌群，鑒別能力有一定局限性。相較通常使用的非加權(quán)組平均法（UPGMA），近鄰傳播聚類分析法無需通過指定特定相似水平來確定聚類數(shù)，對使用者的經(jīng)驗(yàn)要求較低。由此可見利用近鄰傳播聚類分析法結(jié)合自選資源材料分析稻區(qū)稻瘟病菌種群是可行的。但值得注意的是本研究使用的自選資源材料所含抗性基因不明確，因此暫無法弄清楚湖北隨州稻瘟病菌無毒基因型分布結(jié)構(gòu)，今后有必要通過分子生物學(xué)手段探明這95個(gè)自選資源材料遺傳背景，進(jìn)一步刪減補(bǔ)充優(yōu)化，以期建立一套適合湖北及周邊省市的稻瘟病鑒別材料。

通過分析76個(gè)隨州稻瘟病單孢菌株在102個(gè)鑒別材料上的反應(yīng)，本研究篩選出了1個(gè)由12個(gè)稻瘟病菌株組成的“隨州生態(tài)模式菌群”。該模式菌群致病率與76個(gè)參試菌株總致病率完全一致，在一定程度上能夠代表隨州地區(qū)的稻瘟病菌致病力。另外值得注意的是，該菌群致病率僅為76.47%，部分抗性較強(qiáng)的鑒別品種未發(fā)現(xiàn)感病，因此推測可能試驗(yàn)所采用的菌株樣本在時(shí)空上對調(diào)查區(qū)域覆蓋相對較窄，群體較小。在今后的試驗(yàn)中，我們將擴(kuò)大調(diào)查群體，在更大區(qū)域內(nèi)持續(xù)動態(tài)監(jiān)測隨州地區(qū)稻瘟病菌種群結(jié)構(gòu)，對這一觀點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，對該菌群加以更新完善，提高其總致病率。今后若將這套菌株運(yùn)用于檢測隨州及江漢平原水稻主栽品種抗稻瘟病能力，將對該區(qū)域水稻品種布局和抗病品種選育具有極大的參考價(jià)值。

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（責(zé)任編輯：田 喆）