韋莉 李霞 黃舒婷 Chanthaphoone KEOVONGKOD 何龍飛 詹潔 王愛勤 肖冬

摘?要：?BAK1是富含亮氨酸重復(fù)序列型類受體蛋白激酶，參與調(diào)控植物先天免疫反應(yīng)過程中的程序性細(xì)胞死亡過程。實(shí)驗(yàn)室已有的花生鋁脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)揭示AhBAK1為鋁脅迫響應(yīng)基因。為研究其在花生抗鋁機(jī)制中的作用，該文分析了鋁脅迫下AhBAK1在花生耐鋁品種‘99-1507和鋁敏感品種‘中花2號(hào)（‘ZH2）根尖中的轉(zhuǎn)錄變化，采用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增AhBAK1的完整CDS序列，并對(duì)序列特征進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：AhBAK1顯著響應(yīng)鋁處理，且在‘99-1507中有著更強(qiáng)的誘導(dǎo)表達(dá);AhBAK1包括625個(gè)氨基酸殘基， 屬富亮氨酸重復(fù)區(qū)類受體激酶，具跨膜域和蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域，不存在信號(hào)肽，預(yù)測(cè)定位于細(xì)胞質(zhì)膜;我們進(jìn)一步構(gòu)建了含有AhBAK1激酶域的pGEX-6p-1-AhBAK1-CD重組質(zhì)粒，體外誘導(dǎo)表達(dá)出約70 kD可溶性蛋白，經(jīng)凝膠親和層析純化，最終得到基于蛋白印跡實(shí)驗(yàn)（Western Blot）驗(yàn)證正確的重組蛋白。為進(jìn)一步研究AhBAK1的生物學(xué)功能和生化功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 花生， AhBAK1， 基因克隆， 原核表達(dá)， 蛋白純化

中圖分類號(hào)：?Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

文章編號(hào)：?1000-3142（2021）04-0573-11

Abstract：?BAK1， an LRR receptor-like protein kinase， interacts with other receptor-like protein kinase and mediates the programmed cell death in plant innate immune response. Previous transcriptome analysis had revealed that AhBAK1 was responded to aluminum stress. In order to explore the role of AhBAK1 in peanuts under Al stress， the?transcriptional changes of AhBAK1 between Al-tolerant cultivar ‘99-1507 and Al-sensitive cultivar ‘ZH2 under Al stress were analyzed.?Furthermore， the full-length CDS of AhBAK1 was amplified by RT-PCR and analyzed. The results were as follows： AhBAK1 responded significantly to aluminum treatment， with much higher induced level in ‘99-1507. Furthermore， the full-length ORF of AhBAK1 was cloned into pMD19T vector， encoding a protein with 625 amino acids and belonging to LRR receptor-like protein kinase family. It was predicted that AhBAK1 had transmembrane and protein kinase catalytic domains， and located in plasm membrane. The recombinant plasmid of pGEX-6p-1-AhBAK1-CD was further introduced into the Rosetta （DE3） to express a 70 kD soluble protein. The purified recombinant protein was verified by Western Blot analysis. The research set a foundation for further study on biological and biochemical functions of AhBAK1.

Key words： Arachis hypogaea， AhBAK1， cloning， prokaryotic expression， protein purification

鋁的化學(xué)形態(tài)依賴于pH值，在酸性土壤（pH<4.5）中，鋁主要以三價(jià)陽離子形式存在，是酸性土壤中植物生長(zhǎng)主要的限制因子之一。鋁對(duì)植物毒害最先影響到根的生長(zhǎng)，根長(zhǎng)會(huì)受到明顯抑制。在對(duì)擬南芥（Arabidopsis thaliana）根長(zhǎng)的抑制作用中發(fā)現(xiàn)鋁可通過細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素等信號(hào)途徑參與到根的抑制作用中（Yang et al.，2017）;鋁也會(huì)影響植株地上部分，多數(shù)植物類囊體和光合作用電子傳遞鏈會(huì)因鋁的影響受損，使光合作用明顯下降（Chen et al.， 2010）;鋁還會(huì)造成ROS迸發(fā)（Huang et al.，2014），改變植物體內(nèi)氧化還原狀態(tài)。鋁毒影響到植物的諸多方面，植物也對(duì)此做出應(yīng)答，細(xì)胞程序性死亡是植物應(yīng)對(duì)脅迫的防御機(jī)制，是生物體在適應(yīng)環(huán)境及進(jìn)行自身新陳代謝過程中正常的生理反應(yīng)。在煙草（Panda et al.，2008）、擬南芥（Huo et al.，2018）、小麥（Yank et al.，2017）和花生（Arachis hypogaea）（詹潔等，2008）等植物中均發(fā)現(xiàn)鋁脅迫會(huì)誘發(fā)PCD，引發(fā)基因水平、蛋白水平及代謝水平等的轉(zhuǎn)變。

在植物應(yīng)答脅迫過程中，信號(hào)的識(shí)別與傳遞至關(guān)重要。植物類受體蛋白激酶（receptor-like protein kinase， RLKs）在植物中普遍存在，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑過程中發(fā)揮重要作用，其中LRR型RLKs是植物中最大的類受體蛋白激酶家族，BAK1為其中研究較廣泛的一員，在油菜素內(nèi)酯信號(hào)途徑（Russinova et al.，2004）、植物先天免疫（Wang et al.，2012）、細(xì)胞死亡（Kemmerling et al.，2007）等方面起作用。前人研究表明BAK1由胞外域（負(fù)責(zé)感知信號(hào)）、跨膜域（負(fù)責(zé)胞外信號(hào)傳遞至胞內(nèi)）、胞內(nèi)激酶域組成（負(fù)責(zé)將信號(hào)傳遞至下游），信號(hào)傳遞過程中磷酸化是BAK1激酶發(fā)揮作用的重要方式，特異位點(diǎn)磷酸化導(dǎo)致下游不同的調(diào)控作用（衛(wèi)卓赟等和黎家，2017）。BAK1不是單獨(dú)起作用，是與其他組分相互作用，BAK1/AtSERK3及其他同源物在調(diào)控細(xì)胞死亡起共同作用（He et al.，2007）;BAK1作為BR11（另一類富含亮氨酸重復(fù)序列的受體激酶）在BR信號(hào)通路中的共受體，共同調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育（Tang et al.，2008）;植物BAK1可同時(shí)參加PTI和ETI兩種先天免疫反應(yīng)，不僅承擔(dān)共受體的作用，也是免疫反應(yīng)中許多效應(yīng)蛋白的靶蛋白（Wang et al.，2012）。

花生是重要的油料作物，產(chǎn)油率高達(dá)40%，且富含蛋白質(zhì)、脂肪、維生素及礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分。我國是世界花生生產(chǎn)、消費(fèi)和出口大國，2013—2014年中國花生及花生仁出口達(dá)到13萬t，金額達(dá)2億美元（劉行等，2017）?；ㄉ粌H營養(yǎng)價(jià)值高，而且具有廣闊的市場(chǎng)前景。在我國多個(gè)省份種植歷史悠久，北方省份種植花生，以榨油為主，南方以鮮食、加工為主?；ㄉ姆N植條件以雨水適中的沙土為主，但是南方土壤較多呈酸性土，富含游離鋁，對(duì)花生會(huì)造成部分毒害，故目前鋁毒機(jī)制在花生中的研究受到廣泛關(guān)注。BAK1參與誘導(dǎo)與植物超敏反應(yīng)有關(guān)的PCD過程，在植物的先天免疫響應(yīng)中發(fā)揮核心作用，是否在鋁誘導(dǎo)PCD信號(hào)事件中同樣存在類似于植物先天免疫響應(yīng)過程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模式，其在鋁誘導(dǎo)花生PCD過程中的作用尚不清楚。為此，本研究克隆得到AhBAK1完整開放閱讀框，對(duì)AhBAK1蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，探究不同鋁處理時(shí)間下的AhBAK1表達(dá)模式，并通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了AhBAK1的胞內(nèi)域純化蛋白，為發(fā)掘AhBAK1在花生鋁處理下的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物、菌株和載體?供試材料是實(shí)驗(yàn)室早期篩選得到并保存的鋁敏感花生品種‘中花2號(hào)（‘ZH2）和鋁耐受性花生品種‘99-1507。菌株Escherichia coli DH5α，Rosetta為實(shí)驗(yàn)室以甘油管形式于-80 ℃保存，感受態(tài)細(xì)胞自行制備保存;原核表達(dá)載體pGEX-6p-1為本實(shí)驗(yàn)室保存，pMD19-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 酶和試劑?RT-PCR反轉(zhuǎn)錄酶均購自Promega公司;TB Green Premix Ex Taq II，dNTP、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ購自寶生物工程（大連）有限公司;高保真酶、非連接酶依賴型單片段快速克隆試劑盒（ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit）購自南京諾唯贊生物科技有限公司;抗GST標(biāo)簽鼠單克隆抗體、山羊抗小鼠IgG（H+L）購自康為世紀(jì)生物科技有限公司;還原型谷腕甘肽購自生工生物工程有限公司、氨芐霉素、氯霉素購自北京Solarbio公司;蛋白純化的親和層析材料購自GE Healthcare公司;DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化試劑公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花生總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成?RNA提取及cDNA的合成參照Liu et al.（2010）的方法進(jìn)行。

1.2.2 AhBAK1基因克隆?以‘ZH2cDNA為模板，參照Takara LA酶說明書設(shè)置PCR體系和程序，以下列引物AhBAK1-F：ATGAGAATGAGGTTCTTTTG AhBAK1-R： TCTAGGACCAGAGAGTTCATC擴(kuò)增目的片段，挑選含目的片段的菌液進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，并將測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果正確的菌液保存于-80 ℃。

1.2.3 AhBAK1基因的生物信息學(xué)分析?在克隆得到AhBAK1基因完整開放閱讀框的前提下，利用在線軟件ExPASY （https：//web.expasy.org/compute_pi/）對(duì)AhBAK1蛋白進(jìn)行蛋白分子量及等電點(diǎn)的預(yù)測(cè);通過TMHMM2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）分別預(yù)測(cè)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)和疏水性;利用Signal4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線預(yù)測(cè)蛋白的信號(hào)肽有無，利用PSORT II（https：//wolfpsort.hgc.jp/）對(duì)AhBAK1進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析，SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa sopma.html）在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用SWISS-MOEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）在線軟件預(yù)測(cè)獲得AhBAK1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，利用MEGA5.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹;利用NCBI-BLAST （https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行AhBAK1蛋白激酶域的分析。

本文中提到的基因或蛋白質(zhì)的序列信息可在擬南芥數(shù)據(jù)庫（Arabidopsis Information Resource）或基因數(shù)據(jù)庫（GenBank/EMBL）中利用如下登記號(hào)找到：AhBAK1（XM_025783786.1），AtBAK1（NM_001203975）， BrLRRII5（JX073086）， GhBAK1（NM_001326866）， LjBAK1（KY131980），NaBAK1（XM_019377066）， OsBAK1（KT669690）。

1.2.4 AhBAK1基因在Al處理下的表達(dá)特性?以UBQ10R為內(nèi)標(biāo)基因，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析AhBAK1基因在不同Al處理時(shí)間（0、4、8、12、24 h）下的相對(duì)表達(dá)水平，前期材料培養(yǎng)參考詹潔等（2008） 的方法，略有改動(dòng);反應(yīng)體系及程序參考TB Green Premix Ex Taq II產(chǎn)品說明，實(shí)驗(yàn)做3次生物學(xué)重復(fù)，檢測(cè)引物于NCBI-Primer BLAST設(shè)計(jì)，序列如表1所示。

1.2.5 AhBAK1基因原核表達(dá)載體構(gòu)建?為獲得GST-AhBAK1-CD融合基因，以‘ZH2cDNA為模板，用引物AhBAK1-CD-EcoR I-F（CCCCTGGGATCCCCGGAATTCCGAAGAAGGAAACGTGCTGATT）和AhBAK1-CD-Xho I-R（GTCACGATGCGGCCGCTCGAGTCTAGGACCAGAGAGTTCATCTGCT）擴(kuò)增目的片段，將PCR產(chǎn)物純化回收，參照ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit試劑盒方法進(jìn)行回收產(chǎn)物與酶切載體重組反應(yīng)，熱激法轉(zhuǎn)化重組產(chǎn)物至DH5α感受態(tài)，挑選陽性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，將測(cè)序正確的陽性克隆體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株Rosetta，并以甘油管的形式保存于-80 ℃冰箱。

1.2.6 目的蛋白的表達(dá)和純化

1.2.6.1 誘導(dǎo)表達(dá)?將含有pGEX-6p-1-AhBAK1-CD質(zhì)粒的凍存Rosetta（DE3）菌株進(jìn)行活化，挑選單克隆于5 mL含抗生素（Amp 100 μg·mL-1，Chl 100 μg·mL-1） LB液體中;待菌液渾濁后，按照V（菌液）∶V（LB液體）=1∶100的比例加入至200 mL LB液體（Amp 100 μg·mL-1，Chl 100 μg·mL-1）中，37 ℃，220 r·min-1培養(yǎng)3～4 h，待OD600=0.5～0.8，取2 mL菌液作為未誘導(dǎo)樣品，于 8 000 r·min-1在4 ℃離心10 min保存沉淀待檢測(cè)。其余菌液加入IPTG使其終濃度為0.1 mmol·L-1，于16 ℃，100 r·min-1條件下培養(yǎng)15～16 h，取2 mL菌液作為誘導(dǎo)后總蛋白對(duì)照離心待檢測(cè)。剩余的菌液于8 000 r·min-1在4 ℃離心10 min，去上清液，按V（菌液）∶V（10 mmol·L-1 PBS）=10∶1加入PBS溶解沉淀，液氮速凍后加入PMSF使其終濃度為1 mmol·L-1，重懸菌液進(jìn)行超聲破碎10 min（超聲5 s，停5 s，功率30%），破碎結(jié)束后 8 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，分離上清和沉淀，沉淀用10 mmol·L-1 PBS（過濾除菌）重懸，取未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)后總蛋白的沉淀重懸液，與超聲后上清、沉淀重懸液各25 μL，分別加入75 μL 4×loading buffer，渦旋混勻，于100 ℃，變性10 min，取變性后蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳，分析蛋白是否被誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.6.2 蛋白純化?參考GE公司Glutathione Sepharose 4B填料說明手冊(cè)將誘導(dǎo)超聲后的蛋白上清液進(jìn)行純化，并用SDS-PAGE電泳分析蛋白純化效果。

2?結(jié)果與分析

2.1 AhBAK1基因在不同鋁處理時(shí)間表達(dá)分析

在對(duì)鋁處理下花生根尖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析中，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)預(yù)測(cè)編碼BAK1蛋白的基因（AhBAK1）受鋁脅迫誘導(dǎo)上調(diào)?；趯?shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，我們對(duì)AhBAK1分別在花生品種‘ZH2（鋁敏感型）和‘99-1507（鋁耐受型）中鋁處理下的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。如圖1所示，在100 μmmol·L-1鋁脅迫條件下，兩品種根尖AhBAK1基因的表達(dá)模式不同。鋁處理4 h時(shí)，‘ZH2根尖AhBAK1基因的表達(dá)與對(duì)照有顯著差異，明顯升高;隨著鋁處理時(shí)間的延長(zhǎng)，AhBAK1基因表達(dá)量會(huì)降低，但仍高于對(duì)照;鋁處理24 h后表達(dá)量又有所上升。鋁處理4、8、12 h均顯著提高了‘99-1507根尖AhBAK1基因的表達(dá)水平，但隨后基因表達(dá)下降，至鋁脅迫處理24 h時(shí)表達(dá)量會(huì)降低，但仍高于對(duì)照。

2.2 AhBAK1基因克隆

首先，將擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD19-T連接并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，然后進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，在約 2 000 bp處出現(xiàn)特異性條帶，與目的基因大小相符，將含目的片段的陽性菌株進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明擴(kuò)增的AhBAK1基因序列與蔓花生（Arachis duranensis）的同源性高達(dá)100%。

將克隆得到的核酸序列翻譯得到氨基酸序列，與部分已報(bào)道物種的BAK1氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，比對(duì)物種的BAK1序列在342～613 aa（STK_BAK1結(jié)構(gòu)域）之間保持高度一致，且在LRR區(qū)（64～230 aa）也較一致，鑒于克隆得到的AhBAK1序列含有STK_BAK1_結(jié)構(gòu)域保守的活性位點(diǎn)和富亮氨酸區(qū)域，故屬于花生BAK1家族（圖3）。

2.3 AhBAK1基因的生物信息學(xué)分析

2.3.1 AhBAK1蛋白理化性質(zhì)分析?AhBAK1基因序列完整開放閱讀框大小為 1 878 bp，編碼625個(gè)氨基酸。ExPASy在線預(yù)測(cè)AhBAK1蛋白分子量大小為69.10 kD，等電點(diǎn)為5.91，化學(xué)分子式為C3055H4860N842O918S32，正電荷殘基數(shù)為64，負(fù)電荷殘基數(shù)為72，亮氨酸含量最高（占比13.1%），色氨酸含量最低（占比1.3%），不穩(wěn)定系數(shù)為37.11%，指數(shù)較低為穩(wěn)定蛋白，半衰期為30 h，預(yù)測(cè)得到蛋白質(zhì)的平均親水系數(shù)是 -0.192，故此蛋白為疏水蛋白。

2.3.2 AhBAK1跨膜結(jié)構(gòu)與疏水性預(yù)測(cè)?TMHMM2.0可在線預(yù)測(cè)蛋白是否存在跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，AhBAK1為跨膜蛋白，跨膜區(qū)域氨基酸起始于13 aa，終止于30 aa，但據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果分析可知其可能是雙跨膜蛋白，在200～300 aa之間也可能存在跨膜區(qū)域。

利用ProtScale在線軟件預(yù)測(cè)AhBAK1蛋白的疏水性，結(jié)果分析表明在氨基酸序列的各位點(diǎn)預(yù)測(cè)分值均為正值，平均值大于0，表明AhBAK1為疏水蛋白（圖5）。

2.3.3 AhBAK1蛋白信號(hào)肽與亞細(xì)胞定位分析?信號(hào)肽是蛋白質(zhì)N端一段特異的氨基酸序列，輔助蛋白完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Signal4.1預(yù)測(cè)表明AhBAK1蛋白序列中不存在信號(hào)肽，且通過PSORT II預(yù)測(cè)AhBAK1可能的定位，發(fā)現(xiàn)AhBAK1定位于細(xì)胞質(zhì)膜的可能性最高，為71%，說明其編碼的蛋白質(zhì)很有可能定位在細(xì)胞質(zhì)膜上發(fā)揮作用（圖6）。

2.3.4 AhBAK1氨基酸序列比對(duì)與進(jìn)化樹構(gòu)建?通過NCBI-BLAST分析獲得部分物種與AhBAK1比較的氨基酸序列，并通過MEGA5.0構(gòu)建進(jìn)化樹（圖7）分析可知AhBAK1與大豆（Glycine max）和木豆（Cajanus cajan）等豆類的親緣關(guān)系較近，而與擬南芥及野大豆（Glycine soja）的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。通過DNAMAN序列比對(duì)分析可知多個(gè)富亮氨酸重復(fù)區(qū)域序列以及激酶域序列在各物種中相對(duì)保守，不保守區(qū)域主要集中在序列的N端區(qū)域，可能與部分差異功能執(zhí)行有關(guān)。

2.3.5 AhBAK1蛋白結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域分析預(yù)測(cè)?用SOPMA在線預(yù)測(cè)AhBAK1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明AhBAK1蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋（41.60%）、無規(guī)則卷曲（40.64%）和延伸鏈（13.76%）組成，且在NCBI網(wǎng)站工具中分析氨基酸序列發(fā)現(xiàn)AhBAK1蛋白含有蛋白激酶家族PKc-like 保守結(jié)構(gòu)域以及富亮氨酸激酶保守結(jié)構(gòu)域PLN00113或PLN0011（圖8）。

預(yù)測(cè)獲得的AhBAK1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖9）與二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果相符合，主要是由α螺旋、無規(guī)則卷曲和延伸鏈進(jìn)一步折疊組裝形成三級(jí)結(jié)構(gòu)，且與擬南芥BAK1預(yù)測(cè)得到的其中一個(gè)三級(jí)結(jié)構(gòu)符合，進(jìn)一步證明AhBAK1屬BAK1家族。

2.4 AhBAK1基因原核表達(dá)載體構(gòu)建

為了獲得可溶性重組蛋白，本研究基于TMHMM2.0預(yù)測(cè)蛋白跨膜域以及AhBAK1蛋白激酶域預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)（圖10），盡可能規(guī)避了跨膜區(qū)域的疏水氨基酸殘基，選擇預(yù)測(cè)的胞內(nèi)域中包括完整BAK1激酶域的787～1 875 bp做后續(xù)原核表達(dá)研究。采用同源克隆的方法，獲得陽性菌株（圖11）并進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)測(cè)序比對(duì)，獲得pGEX-6p-1-AhBAK1-CD重組表達(dá)質(zhì)粒。

2.5 重組蛋白的誘導(dǎo)與純化

2.5.1 重組蛋白的誘導(dǎo)?誘導(dǎo)表達(dá)后取變性蛋白SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果如圖12。從圖12可知，在4個(gè)不同IPTG濃度誘導(dǎo)下， 在70～100 kD之間均利用DNAMAN軟件對(duì)AhBAK1氨基酸序列與擬南芥（AtBAK1; AT4G33430）、油菜（BrLRRII5; AFO67895.1）、棉花（GhBAK1; NP_001313795.1）、日本百脈根（LjBAK1; ATV94829.1）、煙草（NaBAK1; XP_019232611.1）和水稻（OsBAK1; AJK31513.1）同源蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，箭頭代表BAK1同源蛋白的特征保守活性位點(diǎn)。

出現(xiàn)特異性條帶，與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的加了標(biāo)簽（GST）的蛋白分子量一致。

2.5.2 重組蛋白的純化與鑒定?AhBAK1-CD重組蛋白經(jīng)凝膠親和層析結(jié)果見圖13、圖14。結(jié)果表明，在70～100 kD之間均出現(xiàn)單一目的條帶，表明AhBAK1-CD重組蛋白純化成功，且經(jīng)Western Blot特異性抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有GST標(biāo)簽的特異性條帶，此純化蛋白可用于后續(xù)研究（圖13，圖14）。

3?討論

BAK1在油菜素內(nèi)酯（BR）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞死亡調(diào)控及抗菌方面發(fā)揮關(guān)鍵作用（衛(wèi)卓赟和黎家，2017）。前人研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥BAK1突變體表現(xiàn)為對(duì)病原菌過敏感，先天免疫響應(yīng)大大削弱，而提高BAK1的轉(zhuǎn)錄水平能減少壞死，抑制PCD的發(fā)生，表明BAK1具有負(fù)調(diào)控植物PCD的功能（Chinchilla et al.，2007;Kemmerling et al.，2007）。FLS2與BAK1在FLG22刺激后相互作用形成復(fù)合體，之后被激活的BAK1繼續(xù)磷酸化BIK1;BIK1是BAK1下游免疫信號(hào)的中樞，是多條免疫信號(hào)的重要節(jié)點(diǎn)，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)BIK1能直接催化質(zhì)膜蛋白NADPH氧化酶RbohD發(fā)生磷酸化，增強(qiáng)胞內(nèi)ROS水平（Lu et al.，2009;Lei et al. ，2014）。這些結(jié)果顯示，類受體蛋白激酶BAK1在先天免疫響應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)中起了核心作用。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)花生AhBAK1轉(zhuǎn)錄水平在未做鋁處理的花生根尖表達(dá)量較低，但在鋁處理?xiàng)l件下其轉(zhuǎn)錄水平迅速上調(diào)，且在檢測(cè)的兩個(gè)花生品種間存在差異。盡管AhBAK1在‘ZH2和‘99-1507中對(duì)鋁脅迫有著迅速（4 h）的響應(yīng)，但在‘99-1507中AhBAK1基因的表達(dá)量明顯要高于‘ZH2。詹潔等（2008）研究證明‘99-1507是耐鋁品種，‘ZH2是鋁敏感品種，這種差異暗示了AhBAK1對(duì)增強(qiáng)鋁耐受性的正向作用。

克隆花生AhBAK1基因，并獲得編碼其激酶域的重組蛋白，是研究AhBAK1的生物學(xué)功能和生化功能的前提條件。本研究中，我們獲得了AhBAK1基因編碼區(qū)全長(zhǎng)序列，氨基酸序列分析表明AhBAK1具有和擬南芥、油菜、水稻、煙草等已鑒定的BAK1一致的特征保守活性位點(diǎn);蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析表明，盡管在親緣關(guān)系上AhBAK1和AtBAK1相距較遠(yuǎn)，但二者有著高度相似的三維結(jié)構(gòu)，這些結(jié)果顯示AhBAK1具有和AtBAK1相似的功能。

生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)AhBAK1是一個(gè)膜定位蛋白;為了獲得可溶性的重組蛋白以檢測(cè)AhBAK1可能的激酶活性，本研究選擇避開跨膜區(qū)域的疏水氨基酸殘基，構(gòu)建了含有預(yù)測(cè)為激酶域序列的重組質(zhì)粒pGEX6p-1-AhBAK1-CD。由于重組蛋白的原核表達(dá)主要受溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間的影響（李晶等，2017），本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在37 ℃和18 ℃條件下，0.5 mmol·L-1 IPTG不能誘導(dǎo)表達(dá)AhBAK1-CD重組蛋白;在16 ℃條件下，在不同IPTG濃度誘導(dǎo)下，AhBAK1-CD均可成功表達(dá)，說明溫度是誘導(dǎo)表達(dá)AhBAK1-CD的關(guān)鍵。

4?結(jié)論

本研究揭示了AhBAK1響應(yīng)花生鋁脅迫上調(diào)表達(dá)，且在鋁耐受型花生品種中具有更強(qiáng)、更快速的上調(diào)反應(yīng)特點(diǎn)，暗示著該基因與花生抗鋁過程的正向關(guān)系。通過原核表達(dá)分析，本研究獲得了編碼AhBAK1激酶域的胞內(nèi)域蛋白片段，為后續(xù)開展AhBAK1蛋白相關(guān)生化功能研究奠定了基礎(chǔ)，為研究花生鋁脅迫誘導(dǎo)PCD的分子機(jī)制提供了新的思路。

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（責(zé)任編輯?何永艷）