夏銘澤 張雨 余靜雅 張發(fā)起

摘?要：?多裂駱駝蓬為西北荒漠地區(qū)常見(jiàn)植物，具有抗風(fēng)固沙、防止水土流失、抑菌殺蟲(chóng)和抗腫瘤等功效。為了增加駱駝蓬屬植物開(kāi)發(fā)利用的強(qiáng)度，彌補(bǔ)其基因功能、代謝通路等分子生物學(xué)研究層面的空缺，該文利用Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)多裂駱駝蓬葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)拼接、功能注釋、序列水平和表達(dá)水平等分析。結(jié)果表明：共獲得7 723 653 900 bp核苷酸序列信息，拼接組裝得到78 641條Unigene，預(yù)測(cè)出55 535條CDS序列。與多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比后，獲得33 184個(gè)NR數(shù)據(jù)庫(kù)注釋信息;31 835個(gè)GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋信息;17 206個(gè)KOG數(shù)據(jù)庫(kù)Unigene功能分類信息;7 617個(gè)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)代謝通路注釋信息。對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)和微衛(wèi)星信息進(jìn)行檢測(cè)分析，共發(fā)現(xiàn)86 113個(gè)SNP位點(diǎn)，6 987個(gè)SSR信息。該研究首次獲得并分析了多裂駱駝蓬的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過(guò)基因比對(duì)、CDS預(yù)測(cè)、通路注釋、SNP檢測(cè)和SSR檢測(cè)等方法，對(duì)該植物的基因、通路以及分子標(biāo)記等方面有了初步的認(rèn)識(shí)，為本種植物后續(xù)研究及資源的開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 多裂駱駝蓬， 轉(zhuǎn)錄組分析， 基因注釋， SNP， SSR

中圖分類號(hào)：?Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

文章編號(hào)：?1000-3142（2021）04-0503-11

Abstract：?Peganum multisectum is a common plant in arid-desert areas of Northwest China， which has the effects of resisting wind and sand fixation， preventing soil erosion， inhibiting bacteria and insects， and resisting tumor. But the lack of molecular biology research on this plant， such as gene function and metabolic pathway， leads to its underutilization. Here in this study， the transcriptomes of P. multisectum leaves were sequenced by the platform of Illumina. According to the sequencing results， we analyzed splicing， functional annotation， sequence level and expression level of the transcriptome data. Then we obtained a total of 7 723 653 900 bp nucleotide sequence information， assembled 78 641 Unigene sequences and predicted 55 535 CDS sequences. After comparing with several databases， 33 184 NR database annotation information， 31 835 GO database annotation information， 17 206 KOG database Unigene functional classification information and 7 617 KEGG database metabolic pathway annotation information were obtained. In addition， we detected a total of 86 113 single nucleotide polymorphism sites and 6 987 microsatellite information. In this study， transcriptome data of P. multisectum were obtained and analyzed for the first time. These analyses not only shed light on the molecular information of P. multisectum， but also provide a certain reference for the post research， development and utilization of this plant.

Key words： ?Peganum multisectum， transcriptome analysis， gene annotation， SNP， SSR

1753年植物學(xué)家林奈（Carl Linnaeus）以駱駝蓬（Peganum harmala）為模式種建立了駱駝蓬屬（Peganum L.）（徐朗然和黃成就，1993）。該屬在《中國(guó)植物志》中屬于蒺藜科（Zygophyllaceae）（徐朗然和黃成就，1993），在Flora of China中屬于駱駝蓬科（Peganaceae），在APG Ⅳ系統(tǒng)中屬于白刺科（Nitrariaceae）駱駝蓬亞科（Subfam. Peganoideae Engl.）（Angiosperm Phylogeny Group et al.，2016）。駱駝蓬屬植物為多年生草本，全世界共6種，中國(guó)有3種，即駱駝?shì)铮≒eganum nigellastrum）、駱駝蓬（P. harmala）和多裂駱駝蓬（P. multisectum），主要分布于新疆、寧夏、青海、甘肅和內(nèi)蒙古的荒漠或半荒漠地區(qū)（徐朗然和黃成就，1993）。多裂駱駝蓬是中國(guó)特有種（段金廒等，1998），該植物對(duì)各種生境的適應(yīng)力強(qiáng)于駱駝?shì)锖婉橊勁睿▌k心，1995），具有旱生植物的典型特征，如根系發(fā)達(dá)，葉片深裂且裂片較細(xì)，有較強(qiáng)的耐旱特性。此外，多裂駱駝蓬植物體生長(zhǎng)繁茂，在改善西北荒漠環(huán)境中發(fā)揮著抗風(fēng)固沙和防止水土流失的重要作用（馬驥和王勛陵，1998;程琳等，2018）。該種資源豐富，僅甘肅省年產(chǎn)量超過(guò)1億Kg（樊崢嶸和姚新生，1992）。近年來(lái)的研究表明，駱駝蓬屬植物具有抑菌殺蟲(chóng)（薛林貴等，2005）、抗腫瘤（陳豫等，2015）等多種藥理學(xué)活性;提取物和生物堿對(duì)多種植物種子的萌發(fā)有抑制作用（劉建新，2003;劉建新等，2008）。段金廒等（1998）從多裂駱駝蓬中分離并鑒定了22種化合物，劉建新等（2011）研究顯示外源一氧化氮可以保護(hù)鹽脅迫下多裂駱駝蓬幼苗的光合系統(tǒng)。目前，對(duì)多裂駱駝蓬的研究主要集中在藥理活性、種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)方面。已報(bào)道的分子序列僅見(jiàn)于Zhao等（2011）利用trnL-F片段和psbA-trnH片段對(duì)駱駝蓬屬植物的鑒定，基因注釋信息亦不完善，阻滯了與藥物活性成分合成相關(guān)的代謝通路的研究。因此，亟需利用基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)拓展分子生物學(xué)信息。

轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）是指生物體的細(xì)胞或組織在特定時(shí)空條件下轉(zhuǎn)錄出的RNA的總和（張春蘭等，2012）。較基因組而言，轉(zhuǎn)錄組僅涉及被轉(zhuǎn)錄的基因，可以更有效地針對(duì)功能基因及其代謝通路進(jìn)行研究（周華等，2012）。隨著近年來(lái)高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，其測(cè)序時(shí)間和測(cè)序成本大大降低（Shendure & Ji，2008），越來(lái)越多的學(xué)者將高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用到轉(zhuǎn)錄組研究中，從而獲得來(lái)自不同基因的海量RNA序列數(shù)據(jù)。如葉興狀等（2019）對(duì)瀕危珍稀植物半楓荷（Semiliquidambar cathayensis）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)了控制藥效合成的轉(zhuǎn)錄因子家族;Zhang et al.（2014）對(duì)青藏高原特有植物唐古紅景天（Rhodiola tangutica）植物進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析，為解釋該植物可用于預(yù)防高原反應(yīng)的機(jī)制提供了分子水平的依據(jù);李彥等（2018）分析了山地虎耳草（Saxifraga sinomontana）的轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星位點(diǎn)信息，為該物種遺傳多樣性研究提供了理論依據(jù);付蘇宏等（2019）研究了菊葉香藜（Dysphania schraderilana）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中的FPPS基因，對(duì)該植物倍半萜類化合物的生物合成奠定了基礎(chǔ)。目前，已有部分具藥用價(jià)值的植物完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作，如人參（Panax ginseny）（鄒麗秋等，2016）、三七（P. notoginseng）（黃勛等，2017）、甘草（Glycyrrhiza uralensis）（張春榮等，2015）、烏頭（Aconitum carmichaelii）（張大燕等，2017）和金鐵鎖（Psammosilene tunicoides）（孟文俊，2019）等，為進(jìn)一步研究藥用植物的功能基因及代謝通路提供了分子基礎(chǔ)。

駱駝蓬屬植物資源豐富，為增加本屬植物開(kāi)發(fā)利用的強(qiáng)度，應(yīng)對(duì)其基因功能、代謝通路等進(jìn)行深入研究。因此，本文選取多裂駱駝蓬葉片為研究材料，利用Illumina Hiseq 2500高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)其進(jìn)行首次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，建立該物種轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)Unigene進(jìn)行功能注釋、代謝途徑及SSR檢測(cè)等分析，挖掘多裂駱駝蓬具有藥效和抗干旱作用的功能基因，為進(jìn)一步研究該植物代謝通路和遺傳多樣性奠定基礎(chǔ)，也為今后本屬植物的開(kāi)發(fā)利用和保護(hù)提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1 材料

多裂駱駝蓬植株采自青海省共和縣鐵蓋鄉(xiāng)（36°06′56.61″ N、100°41′41.74″ E， 2 594 m）。將采集的成熟植物葉片放入液氮中快速冷凍，返回實(shí)驗(yàn)室后放入-80 ℃超低溫冰箱保存。憑證標(biāo)本（Zhang2018013）存放在中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所青藏高原生物標(biāo)本館（HNWP）中。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取?從多裂駱駝蓬的葉片材料中提取總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的降解程度以及是否有污染;用Nanodrop 2000初步檢測(cè)RNA的純度（A260/A280應(yīng)在1.9～2.0范圍內(nèi)）;使用Agilent 2100測(cè)定樣品的RIN值以確定RNA完整性。

1.2.2 拼接組裝?利用Illumina Hiseq 2500高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，得到的原始圖像數(shù)據(jù)由CASAVA堿基識(shí)別（base calling）后轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序數(shù)據(jù)（Raw reads）。該數(shù)據(jù)文件包含測(cè)序得到的堿基序列（reads）信息及其對(duì)應(yīng)的堿基測(cè)序質(zhì)量信息。質(zhì)量評(píng)估后對(duì)所得的原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾：去除接頭（adapter）序列;去除含有未知堿基的序列;從序列兩端起始，去除低質(zhì)量的堿基。過(guò)濾后的測(cè)序數(shù)據(jù)為Clean reads，使用軟件Trinity（Grabherr et al.，2011）（版本為2.4.0;參數(shù)設(shè)置為min_kmer_cov=2，其余為默認(rèn)設(shè)置）將該數(shù)據(jù)組裝成轉(zhuǎn)錄本，并取每條基因中最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本作為Unigene，以此作為后續(xù)分析的參考序列。

1.2.3 功能注釋?使用NCBI BLAST+（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）將Unigene序列與CDD、KOG、COG、NR、NT、PFAM、Swissprot和TrEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得基因的功能注釋信息。首先根據(jù)Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)和TrEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)的蛋白注釋結(jié)果，結(jié)合Uniprot（UniProt，2018）的注釋信息得到GO注釋。使用軟件KAAS（KEGG Automatic Annotation Server）（Moriya，2007）將Unigene序列與KEGG基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST或GHOST比較，以此來(lái)獲得基因的功能注釋信息。首先根據(jù)NR、Swissprot、TrEMBL的最佳比對(duì)結(jié)果按其優(yōu)先級(jí)順序確定Unigene的ORF讀碼框;然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)密碼子表確定其CDS序列（Coding Sequence，氨基酸序列），同時(shí)將未比對(duì)上的Unigene通過(guò)TransDecoder軟件預(yù)測(cè)其CDS序列。

1.2.4 SNP和SSR的篩選與統(tǒng)計(jì)?以組裝好的Unigene作為參考序列，使用BCFtools（版本為2.4.3）（Quinlan，2010）找出其中的SNP位點(diǎn)，參數(shù)為質(zhì)量值大于20且覆蓋度大于8，對(duì)篩選出的SNP突變類型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用MISA（版本為1.0.1）（Thiel，2003）檢測(cè)Unigene序列中的SSR信息，檢測(cè)的類型包括完美型（perfect）及復(fù)合型（compound）的SSR。微衛(wèi)星各重復(fù)單元的篩選標(biāo)準(zhǔn)為二核苷酸SSR至少重復(fù)6次，三核苷酸SSR至少重復(fù)5次，四核苷酸至少重復(fù)5次，五核苷酸至少重復(fù)5次，六核苷酸至少重復(fù)5次。使用Excle（版本為Microsoft Office 2016）軟件對(duì)SSR的類型、數(shù)量等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2?結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝及Unigene獲取

對(duì)多裂駱駝蓬葉片mRNA進(jìn)行測(cè)序，共獲得51 491 026條Raw reads，包含7 723 653 900 bp的核苷酸序列信息，平均每條read的長(zhǎng)度為150 bp，長(zhǎng)度大于30 bp序列的占比為93.76%，GC百分比為47.65%。對(duì)Raw reads進(jìn)行過(guò)濾，獲得50 104 364條Clean reads，包含7 257 449 296 bp的核苷酸序列信息，平均每條read的長(zhǎng)度為144.85 bp，長(zhǎng)度大于30 bp序列的占比為95.06%，GC百分比為47.46%。

用Trinity軟件對(duì)Clean reads進(jìn)行de novo組裝后獲得148 317個(gè)Transcript，去冗余后獲得78 641條Unigene，其總的核苷酸數(shù)分別為117 421 439、52 289 971個(gè)（表1）。Unigene長(zhǎng)度在200～300 nt之間的有31 316條，占比39.82%;在300～2 000 nt之間的有42 524條，占比54.07%;長(zhǎng)度超過(guò)2 000 nt的有4 801條，占比6.10%（圖1：A）。同時(shí)，對(duì)多裂駱駝蓬Unigene的編碼序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，共獲得55 535條CDS序列。CDS序列長(zhǎng)度在100～200 nt之間的有12 541條，占比22.58%;在200～300 nt之間的有15 311條，占比27.57%;在300～2 000 nt之間的有 26 416 條，占比47.57%;長(zhǎng)度超過(guò)2 000 nt的有1 267條，占比2.28%（圖1：B）。

2.2 轉(zhuǎn)錄組基因功能注釋

將Unigene分別與CDD、KOG、NR、NT、PFAM、Swissprot、 TrEMBL、 GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)并注釋基因功能（表2）。其中，注釋到NR數(shù)據(jù)庫(kù)、TrEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)和GO數(shù)據(jù)庫(kù)的基因數(shù)目最多，分別有33 184、32 887、31 835個(gè)，占總基因數(shù)目的42.2%、41.82%、40.48%;注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的基因數(shù)目最少，為3 875個(gè)，僅占總基因數(shù)目的2.97%。總體而言，共有38 598個(gè)Unigene基因經(jīng)過(guò)多數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后成功注釋，仍有40 043個(gè)Unigene基因未能獲取注釋信息。

2.3 NR數(shù)據(jù)庫(kù)Unigene近似物種比對(duì)

將Unigene與NR數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示有33 184個(gè)Unigene獲得注釋信息，占Unigene總數(shù)的42.2%。通過(guò)與NR庫(kù)的比對(duì)，揭示了多裂駱駝蓬轉(zhuǎn)錄組序列與庫(kù)中物種的近似情況，結(jié)果顯示該物種與甜橙（Citrus sinensis）的相似序列最多，有7 078條，占NR庫(kù)注釋的Unigene總數(shù)的21.33%;其次為克萊門(mén)柚（C. clementina），有4 827條，占NR庫(kù)注釋的Unigene總數(shù)的14.55%。此外，部分物種還與多裂駱駝蓬有大量基因序列相類似，如可可（Theobroma cacao）、葡萄（Vitis vinifera）、麻瘋樹(shù)（Jatropha curcas）、蓖麻（Ricinus communis）、 棗（Ziziphus jujuba）、 毛果楊 （Populus trichocarpa）、雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）和大麥（Hordeum vulgare），這些物種與多裂駱駝蓬相似的基因序列共有7 218條，共占NR庫(kù)注釋的Unigene總數(shù)的21.75%。其余42.37%的注釋Unigene分布于其他561個(gè)物種中（圖2）。

2.4 Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)Unigene功能分析

在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)駱駝蓬轉(zhuǎn)錄組Unigene，有31 835條Unigene獲得210 748條注釋信息。所有注釋信息分為三大類，即生物學(xué)過(guò)程（biological process）、細(xì)胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function）。所有大類可細(xì)分為67個(gè)二級(jí)分類。對(duì)Unigene在二級(jí)分類中的分布情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示細(xì)胞（cell）和細(xì)胞部分（cell part）類型的Unigene最多，分別為23 443、23 399個(gè)，分別占GO注釋信息總數(shù)的73.64%、73.50%。此外，細(xì)胞過(guò)程（cellular process）、連接（binding）、細(xì)胞器（organelle）、代謝過(guò)程（metabolic process）和細(xì)胞膜（membrane）類型的Unigene也較多，分別有21 154（66.45%）、18 776（58.98%）、18 689（58.71%）、18 477（58.04%）和10 999（34.55%）條注釋信息?；瘜W(xué)引誘劑活性（chemoattractant activity）、生物相（biological phase）和形態(tài)發(fā)生素（morphogen activity）類型的注釋信息較少（圖3）。

2.5 KOG數(shù)據(jù)庫(kù)Unigene功能分類

在KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)駱駝蓬轉(zhuǎn)錄組Unigene，結(jié)果顯示共17 206條Unigene獲得注釋信息，被分為25類（圖4）。其中，一般功能預(yù)測(cè)基因（general function prediction only）、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊和分子伴侶（posttranslational modification， protein turnover， chaperones）、信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制（signal transduction mechanisms）獲得注釋最多，分別有2 179、2 049和1 871條。細(xì)胞活性（cell motility）獲得注釋最少，僅6條（圖4）。

2.6 KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)Unigene代謝通路分析

使用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)Unigene序列進(jìn)行比對(duì)注釋，代謝通路分析結(jié)果顯示多裂駱駝蓬轉(zhuǎn)錄組中共有3 875個(gè)Unigene獲得7 617條代謝通路注釋信息。這些通路信息可分為四大類，分別為細(xì)胞進(jìn)程（cellular processes）、環(huán)境信息處理（environmental information processing）、遺傳信息處理（genetic information processing）和新陳代謝（metabolism）。這四大類可進(jìn)一步分為23個(gè)小類（圖5）。其中，翻譯（translation）和信號(hào)傳導(dǎo)（signal transduction）獲得注釋信息最多，分別有662條和590條;信號(hào)分子和相互作用（signaling molecules and interaction）及膜運(yùn)輸（membrane transport）的注釋最少，有2條和21條。

所有注釋的代謝通路信息中，共有240個(gè)Unigene與藥物活性成分合成相關(guān)。其中，51個(gè)Unigene參與了萜類骨架生物合成通路（KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)通路ID：ko00900），5個(gè)Unigene參與了單萜類生物合成通路（KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)通路ID：ko00902），9個(gè)Unigene參與了二萜類生物合成通路（KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)通路ID：ko00904），9個(gè)Unigene參與了倍半萜類和三萜類生物合成通路（KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)通路ID：ko00909），這些通路均與萜類物質(zhì)合成相關(guān)。有62個(gè)Unigene參與了苯丙烷類生物合成通路（KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)通路ID：ko00940），這與苯丙素類物質(zhì)合成相關(guān)。此外，還有13個(gè)Unigene參與了黃酮類生物合成通路（KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)通路ID：ko00941），16個(gè)Unigene參與了易喹啉生物堿生物合成通路（KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)通路ID：ko00950），31個(gè)Unigene參與了泛醌和其他萜類醌生物合成通路（KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)通路ID：ko00130），19個(gè)Unigene參與了花生四烯酸類生物合成通路（KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)通路ID：ko00590）。

多裂駱駝蓬在干旱生境下仍有較強(qiáng)的適應(yīng)力（劉媖心，1995）。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，多裂駱駝蓬葉片轉(zhuǎn)錄信息包含有多個(gè)脫落酸（abscisic acid， ABA）合成相關(guān)基因，即ZEP（zeaxanthin epoxidase）基因、AAO3（abscisic-aldehyde oxidase）基因和PYL（abscisic acid receptor）基因。此外，還有茉莉酸 （jasmonic acid， JA）合成相關(guān)基因，即LOX（lipoxygenase）基因、TGA（transcription factor）基因、JAR1（jasmonic acid-amino synthetase）基因、AOS（hydroperoxide dehydratase）基因和MYC2（transcription factor）基因。已有研究表明，脫落酸和茉莉酸的合成可以增加植物的抗逆能力（張春榮等，2015）。

2.7 多裂駱駝蓬Unigene序列單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)分析

對(duì)多裂駱駝蓬Unigene序列進(jìn)行檢測(cè)，共發(fā)現(xiàn)86 113個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP，single nucleotide polymorphsims）位點(diǎn)。對(duì)這些SNP位點(diǎn)進(jìn)行類型統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)換突變類型的SNP有58 486個(gè)（占67.92%），顛換突變類型的SNP有27 627個(gè)（占32.08%）。在轉(zhuǎn)換突變類型中，由鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)換為腺嘌呤的突變最多（15 042個(gè)），其次為胞嘧啶轉(zhuǎn)換為胸腺嘧啶的突變（15 000個(gè)），表明G→A和C→T二者發(fā)生頻率相差不大。在顛換突變類型中，由腺嘌呤顛換為胸腺嘧啶的突變最多（4 136個(gè)），而鳥(niǎo)嘌呤顛換為胞嘧啶的突變最少（2 700個(gè)）（圖6）。

2.8 多裂駱駝蓬Unigene序列微衛(wèi)星信息分析

利用軟件MISA對(duì)多裂駱駝蓬Unigene進(jìn)行微衛(wèi)星位點(diǎn)（SSR，simple sequence repeat）進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)出3 399個(gè)SSR。對(duì)SSR類型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示復(fù)合型（compound）SSR和完美型（perfect）SSR分別有442個(gè)和2 957個(gè)，其發(fā)生頻率為4.32%（檢測(cè)出的SSR數(shù)量與總序列數(shù)目的比值）。從分布情況來(lái)看，多裂駱駝蓬轉(zhuǎn)錄組序列中平均每15.38 kb（序列總長(zhǎng)度與SSR總數(shù)目的比值）出現(xiàn)一個(gè)SSR，表明該物種轉(zhuǎn)錄組SSR數(shù)量較為豐富。在完全型SSR中，三核苷酸重復(fù)占45.01%;二核苷酸重復(fù)次之，占38.22%;四核苷酸重復(fù)、五核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)分別占2.53%、0.65%和0.59%。

3?討論與結(jié)論

多裂駱駝蓬是西北荒漠地區(qū)的常見(jiàn)植物，因其根系發(fā)達(dá)，具有良好的水土保持作用（馬驥和王勛陵，1998），且該植物作為維族、蒙古族和藏族的常用草藥（徐小平等，2008;李凱等，2015）已有長(zhǎng)久的歷史。多裂駱駝蓬在西北地區(qū)資源量巨大，為了合理有效地利用這一植物資源，我們通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的手段以獲取其序列信息及基因表達(dá)特征。

本研究通過(guò)對(duì)多裂駱駝蓬葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得了51 491 026條Raw reads和50 104 364條Clean reads。拼接組裝得到78 641條Unigene，N50長(zhǎng)度為1 154，平均長(zhǎng)度為664.92 bp，比半楓荷（葉興狀等，2019）、胡盧巴（Trigonella foenum-graecum）（Patel et al.，2014）、川芎（Ligusticum chuanxiong）（袁燦等，2017）、狼毒（Stellera chamaejasme）（楊艷芳等，2017）和東北紅豆杉（Taxus cuspidata）（吳瓊等，2012）Unigene的平均長(zhǎng)度更長(zhǎng)，說(shuō)明本研究拼接所得長(zhǎng)序列Unigene較多，并對(duì)Unigene的編碼序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，共獲得55 535條CDS序列。所得長(zhǎng)序列Unigene的增多可能與測(cè)序物種的差異有關(guān)。

將Unigene序列與CDD、KOG、COG、NR、NT、PFAM、Swissprot、TrEMBL、GO和KEGG共10個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，共有38 598條（49.08%）序列經(jīng)過(guò)多數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后成功注釋，但仍有40 043條（50.92%）未得到準(zhǔn)確定位，這一現(xiàn)象在許多物種的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中均有出現(xiàn)，如樟樹(shù)（Cinnamomum camphora）（江香梅等，2014）、黃秋葵（Abelmoschus esculentus）（Schafleitner et al.，2013）和紫背天葵（Begonia fimbristipula）（張少平等，2016）。這可能與某些Unigene片段長(zhǎng)度太短、相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)基因注釋信息不完善或者該物種存在新基因等因素有關(guān)。通過(guò)與NR庫(kù)的比對(duì)，顯示多裂駱駝蓬與甜橙、克萊門(mén)柚、可可和葡萄等物種具有大量相似基因序列。多裂駱駝蓬與四個(gè)同科植物僅有14條相似基因序列，分別為白刺（Nitraria tangutorum）7條、N. retusa 4條、駱駝蓬2條和小果白刺（N. sibirica）1條，或與白刺科植物基因組、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)嚴(yán)重缺乏有關(guān)。通過(guò)比對(duì)GO數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得31 835條Unigene的210 748個(gè)功能分類信息，通過(guò)比對(duì)KOG數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得17 206個(gè)Unigene注釋信息，因此對(duì)多裂駱駝蓬Unigene的功能分布狀況有了初步的了解。此外，對(duì)拼接組裝的78 641條Unigene進(jìn)行代謝通路分析，通過(guò)比對(duì)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)最終獲得3 875條（4.93%）Unigene的7 617條代謝通路注釋信息，注釋類別可分為四大類，其中定位到新陳代謝相關(guān)通路的基因數(shù)最多，占總注釋量的47.15%，表明多裂駱駝蓬代謝活動(dòng)能力較強(qiáng)，之后這四大類可細(xì)分為23個(gè)小類，其中翻譯和信號(hào)傳導(dǎo)獲得注釋信息最多。將注釋基因映射到藥物合成相關(guān)通路，發(fā)現(xiàn)有240個(gè)Unigene與藥物合成通路相關(guān)，參與合成的次生代謝產(chǎn)物類型有萜類、苯丙素類、黃酮類、生物堿類等，這為后續(xù)多裂駱駝蓬藥用活性成分的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。此外，在多裂駱駝蓬轉(zhuǎn)錄組中還發(fā)現(xiàn)多個(gè)脫落酸和茉莉酸的合成相關(guān)基因，甘草（張春榮等，2015）的干旱脅迫研究表明此類基因與抗干旱脅迫作用相關(guān)，推測(cè)此類基因與多裂駱駝蓬適應(yīng)西北干旱環(huán)境的特性有關(guān)。

多裂駱駝蓬轉(zhuǎn)錄組SSR的發(fā)生頻率為4.32%，與檢索條件相同（即不包含單核苷酸SSR）的其他物種相比，高于馬尾松（Pinus massoniana）（2.22%）（杜明鳳和丁貴杰，2018）、冷蒿（Artemisia frigida）（2.61%）（岳春江等，2016）、杜仲（Eucommia ulmoides）（2.91%）（黃海燕等，2013）和杉木（Cunninghamia lanceolata）（3.16%）（吳夏雷等，2018），與紅松（P. koraiensis）（4.24%）（張振等，2015）和燈盞花（Erigeron breviscapus）（4.79%）（陳茵等，2014）相差較小，明顯低于半夏（Pinellia ternata）（16.24%）（王森等，2014）和刺梨（Rosa roxburghii）（20.37%）（鄢秀芹等，2015）。這種差異可能是與物種選擇、組裝方法或篩選軟件的不同有關(guān)。此外，該物種轉(zhuǎn)錄組SSR的優(yōu)勢(shì)基元為三核苷酸重復(fù)，這與馬尾松（杜明鳳和丁貴杰，2018）、杉木（吳夏雷等，2018）、刺梨（鄢秀芹等，2015）等研究結(jié)果相一致。有研究表明，轉(zhuǎn)錄區(qū)的三核苷酸重復(fù)在面對(duì)自然選擇時(shí)表現(xiàn)出積極響應(yīng)的作用，且該基序是在編碼區(qū)受到重大突變壓力時(shí)而存在的一種豐富的核苷酸重復(fù)基序（李彥等，2018），即當(dāng)植物表現(xiàn)出某些抗逆性時(shí)三核苷酸重復(fù)分布較為豐富，多裂駱駝蓬具有較強(qiáng)的耐干旱能力進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)論。此外，我們推測(cè)，隨著干旱環(huán)境的脅迫，該物種產(chǎn)生了相應(yīng)的抵御和適應(yīng)機(jī)制，并逐漸形成了豐富的三核苷酸重復(fù)結(jié)構(gòu)。通過(guò)分析和挖掘多裂駱駝蓬轉(zhuǎn)錄組SSR信息，可為今后該物種SSR分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及其遺傳多樣性研究提供生物信息學(xué)基礎(chǔ)。

本研究首次獲得了多裂駱駝蓬的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過(guò)生物信息學(xué)的方法對(duì)該數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，內(nèi)容涵蓋基因比對(duì)、CDS預(yù)測(cè)、通路注釋、SNP檢測(cè)和SSR檢測(cè)，對(duì)該植物的基因、通路以及分子標(biāo)記等方面有了初步的認(rèn)識(shí)，彌補(bǔ)了本植物在分子數(shù)據(jù)方面的空缺，也進(jìn)一步豐富了白刺科植物的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，同時(shí)也為多裂駱駝蓬的物種分化研究、譜系地理學(xué)研究、遺傳多樣性研究和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究提供了數(shù)據(jù)保障，為本種植物資源的開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯?蔣巧媛）