解盛 李國旗 宋立肖 謝博勛 王雅芳 劉星

摘?要：?植物體中纖維素是細(xì)胞壁形成的主要成分，不僅參與細(xì)胞形態(tài)的建成，調(diào)控細(xì)胞發(fā)育，還參與細(xì)胞內(nèi)多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進(jìn)而影響植物體的生長發(fā)育。纖維素合酶是植物體合成纖維素的主要酶類。為了探究CesA基因家族對羅布麻生長發(fā)育及纖維素合成的調(diào)控機(jī)理，該文通過生物信息學(xué)分析方法，從基因家族鑒定、結(jié)構(gòu)分析、蛋白理化性質(zhì)與多級結(jié)構(gòu)預(yù)測、亞細(xì)胞定位、信號肽、進(jìn)化關(guān)系和順式作用元件等方面，對羅布麻CesA基因家族進(jìn)行系統(tǒng)鑒定和分子特征分析。結(jié)果表明：基于全基因組測序，羅布麻CesA基因家族鑒定含有15個(gè)成員，分布在羅布麻11條染色體中的8條上，其編碼蛋白的氨基酸數(shù)量為730～1 158，相對分子質(zhì)量81 280.81～130 123.18 kDa，理論等電點(diǎn)6.18～8.83。除了AvCesA3、AvCesA5、AvCesA7、AvCesA10和AvCesA11蛋白為穩(wěn)定蛋白，其余成員均為不穩(wěn)定蛋白;除了AvCesA12蛋白為疏水性蛋白，其余成員均為親水性蛋白。該家族成員包含3～14個(gè)外顯子，8～15個(gè)保守基序。編碼蛋白主要分布于質(zhì)膜與高爾基體上，無信號肽，二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲與α-螺旋為主要構(gòu)成元件。AvCesA15蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和三級結(jié)構(gòu)與其他成員存在顯著不同。羅布麻CesA基因進(jìn)化時(shí)主要受純化選擇作用。對上游1 500 bp區(qū)域順式作用元件分析，結(jié)果顯示羅布麻CesA基因受到光、溫度、水分、氧氣等環(huán)境因子及生長素、赤霉素、脫落酸、乙烯、水楊酸等植物激素調(diào)控。該研究為進(jìn)一步探究羅布麻CesA基因家族的生物學(xué)功能、提高纖維品質(zhì)與品種改良奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 羅布麻， 纖維發(fā)育， 生物信息學(xué)分析， CesA基因家族， 生長發(fā)育

中圖分類號：?Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：?A

文章編號：?1000-3142（2021）04-0522-13

Abstract：?Cellulose is the main component of the cell wall in plants. It is not only participates in cell morphology and development， but also participates in various cellular signaling transduction pathways in cells， so as to affect the growth and development of plants. Cellulose synthase is the main enzyme used to?synthesize cellulose in plants. Here， we explore the regulatory mechanism of the CesA gene family for cellulose synthesis， growth and development in Apocynum venetum. Using bioinformatic methods， we conducted systematic identification and molecular characterization of A. venetum CesA gene family which include gene family member identification， structural analysis， protein physicochemical properties and multi-level structure prediction， subcellular localization， signal peptides， evolutionary relationships， cis-acting elements. The results were as follows： Based on whole-genome sequencing， the A. venetum CesA gene family contained 15 members， which were distributed on 8 of the 11 A. venetum chromosomes. These family proteins were encoded by 730-1 158 amino acids， with the molecular weight at 81 280.81-130 123.18 kDa and theoretical isoelectric point at 6.18-8.83. Among these proteins， AvCesA3， AvCesA5， AvCesA7， AvCesA10 and AvCesA11 proteins were stable proteins， the rest of the members were unstable proteins. Except for AvCesA12 protein as a hydrophobic protein， the remaining members were hydropathicity proteins. Members of this family contained 3-14 exons and 8-15 conserved motifs. The encoded proteins were mainly distributed on the plasma membrane and the Golgi apparatus， without a clear signal peptide. The secondary structure was mainly composed of random coils and α-helices. The transmembrane domained and tertiary structure of AvCesA15 protein were significantly different from other members. Evolutionary selection of A. venetum CesA gene was mainly affected by purification selection. The analysis of cis-acting elements in the upstream 1 500 bp region showed that these gene might be regulated by environmental factors such as light， temperature， water， oxygen and plant hormones such as auxin， gibberellin， abscisic acid， ethylene， salicylic acid， and so on. This study lays a theoretical foundation for further exploring the biological function of CesA gene family and improving fiber quality and variety of A. venetum.

Key words： Apocynum venetum， fiber development， bioinformatics analysis， CesA gene family， growth and development

羅布麻（Apocynum venetum）屬夾竹桃科（Apocynaceae）羅布麻屬（Apocynum）多年生宿根草本植物，具有耐旱、耐寒、耐堿、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)（王東清等，2012;劉克彪和姜生秀，2018）。隨著研究的深入，羅布麻的多種經(jīng)濟(jì)價(jià)值被挖掘，主要體現(xiàn)在纖維的紡織利用（徐宗昌等，2018），黃酮類、槲皮素等化學(xué)成分的藥用價(jià)值（侯晉軍等，2006），茶飲保健功能（錢學(xué)射等，2005）等。自20世紀(jì)50年代，對擁有“野生纖維之王”美譽(yù)的羅布麻的研究從未間斷，但其分子層次的研究還比較薄弱。纖維素合酶基因（CesA）編碼纖維素合酶亞基，是廣泛參與陸地植物纖維素生物合成的多基因家族（Yin et al.， 2014）。因此，對纖維素合酶的研究是一個(gè)有價(jià)值的研究課題。通過在羅布麻基因組中系統(tǒng)鑒定CesA基因家族成員，并對其基因結(jié)構(gòu)、蛋白理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)預(yù)測、進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，對進(jìn)一步認(rèn)識羅布麻纖維發(fā)育過程及培育改良羅布麻品種具有重要意義。

纖維素由24～36個(gè)經(jīng)β-1，4糖苷鍵連接的葡聚糖殘基（500～14 000個(gè)單體）鏈組成，這些殘基通過氫鍵相互連接，形成規(guī)則的晶體結(jié)構(gòu)，變成穩(wěn)定體。纖維素是植物細(xì)胞壁的主要組成成分，也是地球上最豐富的生物聚合體和可再生碳源（Andrew & Specht， 2011）。Cantarel et al.（2009）研究顯示，2-型糖基轉(zhuǎn)移酶（GT2）廣泛分布在植物界，而纖維素合成酶屬于2-型糖基轉(zhuǎn)移酶合成酶家族中的一個(gè)超基因家族。纖維素合成酶CesA基因編碼的蛋白能夠在質(zhì)膜上以復(fù)合體的形式合成纖維素（ Taylor et al.， 2000;Robyn， 2001）。纖維素做為植物細(xì)胞壁的重要組成之一，不僅參與細(xì)胞形態(tài)的建成，控制細(xì)胞生長，而且還能參與到多種生物、非生物脅迫的信號應(yīng)答調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（Burton et al.， 2010）。因此，CesA基因在植物的生長發(fā)育過程中起著非常重要的作用。第一個(gè)在植物中報(bào)道的CesA基因是從棉花（陸地棉）纖維中根據(jù)其與細(xì)菌CesA基因序列的高相似性鑒定出來的（Pear et al.， 1996），后續(xù)學(xué)者在模式生物擬南芥中鑒定出了10個(gè)CesA基因，命名為CesA1、CesA2……CesA10（Farrokhi et al.， 2006），其中CesA1、CesA3和CesA6-like（CesA2，CesA5，CesA6或CesA9）成員之一的蛋白質(zhì)產(chǎn)物形成具有18～24個(gè)CesA異構(gòu)體的異三聚體構(gòu)型的CesA復(fù)合物（CSCs），并合成初生細(xì)胞壁纖維素的成分（Desprez et al.， 2007;Persson et al.， 2007;Mcfarlane et al.， 2014）。通過免疫沉淀和突變體分析，CesA4、CesA7和CesA8在次生細(xì)胞壁形成過程中直接相互作用，是合成纖維素所必須的（Somerville， 1997;Taylor et al.， 2003）。此外，在植物生長過程中，每個(gè)重要基因的突變，造成的結(jié)果都是致命性的（例如CesA1、CesA3基因）（Persson et al.， 2007）。有研究結(jié)果顯示，每個(gè)CesA6-like基因之間存在部分功能冗余，在此基礎(chǔ)上有學(xué)者提議將CesA6-like基因列為一個(gè)單獨(dú)的亞家族，雖然一個(gè)CesA基因可以替代另一個(gè)，但又不能完全取代，所以推斷每一個(gè)CesA6-like基因可能具有專門的功能（Ruprecht et al.， 2017; Hu et al.， 2018）。除模式生物外，CesA基因家族也在其他植物中被鑒定，如大麥（Hordeum vulgare）（Burton et al.， 2004）、火炬松（Pinus taeda）（Naim & Haselkorn， 2005）、玉米（Zea mays）（Appenzeller et al.， 2004;張曉榕等，2019）、水稻（Oryza sativa）（Yin et al.， 2009）等。CesA基因家族成員在不同植物中具有相似功能，但由于環(huán)境和物種的差異，不同植物在進(jìn)化過程中的不同選擇，CesA基因家族成員在不同物種中均有不同程度的分化。本實(shí)驗(yàn)室通過對羅布麻進(jìn)行全基因組測序（結(jié)果未發(fā)表），為其進(jìn)化和研究相關(guān)基因的功能關(guān)系奠定理論基礎(chǔ)，而CesA基因家族在羅布麻基因組中并未進(jìn)行深入分析和比較分析。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)鑒定羅布麻CesA基因家族，并系統(tǒng)分析其在基因組中的基因結(jié)構(gòu)、分布、進(jìn)化特征，為闡述羅布麻CesA基因家族分化歷程及生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

材料為采自寧夏石嘴山市平羅縣羅布麻實(shí)驗(yàn)基地的羅布麻。實(shí)驗(yàn)于2018—2019年在寧夏大學(xué)西北土地退化與生態(tài)恢復(fù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 羅布麻CesA基因家族成員的鑒定

本研究主要基于羅布麻全基因組測序進(jìn)行系統(tǒng)分析，同時(shí)利用引自美國華盛頓州艾倫斯堡（Washington Ellensburg）的大麻狀羅布麻基因組測序結(jié)果進(jìn)行比較分析。研究中使用的羅布麻基因組數(shù)據(jù)來自實(shí)驗(yàn)室前期測序所得。利用現(xiàn)有羅布麻注釋基因的蛋白序列，與從擬南芥數(shù)據(jù)庫（TAIR）（https：//www.arabidopsis.org/）中檢索得到的10個(gè)CesA基因家族成員蛋白序列進(jìn)行BLASTP比對，E-value<1e-10，Identity>40%，輸出最優(yōu)比對結(jié)果，篩選羅布麻候選CesA基因。利用Pfam（http：//pfam.sanger.ac.uk/search）及 SMART（http：//smart.emblheidelberg. de/）進(jìn)行驗(yàn)證分析，刪除缺失結(jié)構(gòu)域的序列，最終獲得羅布麻CesA基因家族候選基因。

1.2 羅布麻CesA基因家族成員染色體定位

由羅布麻全基因組注釋文件中，獲取CesA基因在染色體上的位置信息，利用在線工具M(jìn)G2C（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）繪制染色體定位圖。

1.3 羅布麻CesA基因家族成員分析

利用 ExPASy中的ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）工具對羅布麻CesA蛋白基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析，包含氨基酸長度、理論等電點(diǎn)、相對分子質(zhì)量、親水性總平均值、不穩(wěn)定系數(shù)和脂溶指數(shù)等指標(biāo)。

1.4 羅布麻CesA基因家族成員結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

CesA基因的外顯子和內(nèi)含子位置信息參考羅布麻基因組注釋信息GFF3文件，利用在線工具GSDS（Hu et al.， 2015）（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）對羅布麻CesA基因家族成員進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。應(yīng)用在線工具M(jìn)EME（http：//meme-suite.org/tools/meme）預(yù)測分析CesA蛋白序列的結(jié)構(gòu)域，搜尋 motif 值設(shè)置為15，其他設(shè)定為默認(rèn)參數(shù)。通過 TBtools軟件繪制出 MEME 結(jié)構(gòu)。

1.5 羅布麻CesA基因家族成員蛋白結(jié)構(gòu)與亞細(xì)胞定位分析

利用在線平臺(tái)SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/ npsa_seccons.html）分析AvCesA蛋白二級結(jié)構(gòu)。同時(shí)利用SignalP-5.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對羅布麻CesA蛋白進(jìn)行信號肽分析。應(yīng)用在線工具ProtComp Version 9.0（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml？group=programs&subgroup= proloc&topic=protcomppl）對羅布麻CesA蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。

1.6 羅布麻CesA基因家族成員蛋白跨膜螺旋與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）工具對羅布麻CesA蛋白跨膜螺旋進(jìn)行預(yù)測。利用Phyre2（Kelley et al.， 2015）（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/ phyre2/ html/page.cgi？id=index）對羅布麻CesA蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，并通過Jmol進(jìn)行展示。

1.7 羅布麻CesA基因家族成員共線性與進(jìn)化選擇壓力分析

利用MCScanX軟件對羅布麻CesA基因家族與雙子葉模式生物擬南芥和單子葉模式生物水稻進(jìn)行共線性分析。通過BLAST建庫和KaKs_ Calculator 2.0（Wang et al.， 2010）對羅布麻CesA基因核苷酸的非同義替換率（Ka）與同義替換率（Ks）進(jìn)行計(jì)算，獲取基因的Ka/Ks比率，進(jìn)行選擇壓力分析。

1.8 羅布麻CesA基因家族成員系統(tǒng)進(jìn)化分析

將檢索得到的擬南芥（Arabidopsis thaliana）、亞麻（Linum usitatissimum）、水稻（Oryza sativa）與羅布麻（Apocynum venetum）的CesA蛋白的氨基酸序列通過Clustal X進(jìn)行蛋白序列比對，并通過鄰接法（Neighbour-Joining，NJ）在MEGA-X（Kumar et al.， 2018）中構(gòu)建CesA基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹，自展值（Bootstrap）設(shè)定為1 000，其他參數(shù)為系統(tǒng)默認(rèn)值。使用EvolView（https：// evolgenius.info//evolview-v2/#login）工具展示系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.9 羅布麻CesA基因家族成員順式作用元件分析

利用TBtools軟件（Chen et al.， 2018）獲得CesA基因上游1 500 bp序列，利用在線網(wǎng)站PlantCARE（http：//bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對獲得的基因上游序列進(jìn)行預(yù)測，利用在線工具GSDS進(jìn)行繪圖展示，并對主要的順勢作用元件進(jìn)行探討。

2?結(jié)果與分析

2.1 羅布麻CesA基因家族成員的鑒定

從羅布麻全基因組中共篩選到35個(gè)擬南芥CesA的同源蛋白序列，將篩選結(jié)果輸入到Pfam 數(shù)據(jù)庫與SMART數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，刪除Cellulose-synt保守結(jié)構(gòu)域缺失的序列，最終獲得15條羅布麻CesA序列，依次命名為AvCesA1、AvCesA2……AvCesA15。

2.2 羅布麻CesA基因家族成員染色體定位與基因復(fù)制分析

根據(jù)CesA基因染色體定位分析，15條CesA基因不均勻地分布在8條染色體上（圖1）。其中，11號染色體上分布的基因最多，達(dá)到4條，1、9和10號染色體上只分布1條基因，其余染色體上各含有2條基因。基因間無串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象，推斷羅布麻CesA基因家族成員間存在功能分化。

2.3 羅布麻CesA基因家族成員蛋白理化性質(zhì)分析

對羅布麻CesA家族蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明羅布麻CesA蛋白長度在730～1 158 aa之間，相對分子質(zhì)量在81 280.81～130 123.18 kDa之間，理論等電點(diǎn)在6.18～8.83之間，編碼氨基酸序列最長的是AvCesA4，其相對分子質(zhì)量最大，為130 123.18 kDa;編碼氨基酸序列最小的是AvCesA15，其相對分子質(zhì)量也最小，為81 280.81 kDa。當(dāng)?shù)鞍撞环€(wěn)定系數(shù)>40判斷其為不穩(wěn)定蛋白，AvCesA3、AvCesA5、AvCesA7、AvCesA10和AvCesA11蛋白不穩(wěn)定系數(shù)均小于40，為穩(wěn)定蛋白，AvCesA3蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)最小，為37.84;其余家族成員蛋白不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，為不穩(wěn)定蛋白，AvCesA15蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)最大，為50.6。羅布麻CesA蛋白脂肪族氨基酸指數(shù)為66.96～93.32，親水性總平均值在-0.556～0.016之間。除AvCesA12蛋白親水性總平均值為0.016（大于0），為疏水性蛋白;其余成員蛋白親水性總平均值均小于0，為親水性蛋白。

2.4 羅布麻CesA基因家族成員基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

利用在線工具GSDS對15條羅布麻CesA基因家族成員進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，CesA基因家族外顯子數(shù)量主要分布在3～14之間。利用MEME對15條羅布麻CesA蛋白序列進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3。由圖3可知， 共鑒定獲得15個(gè)保守基序（motif）， 除AvCesA12與AvCesA15外，其他家族成員均含有15個(gè)motif，且分布相對比較均勻，其分布的數(shù)量與位置也基本相同，說明具有高度的保守性，由此推斷這部分羅布麻CesA基因家族成員的結(jié)構(gòu)域和功能單位基本相似。AvCesA15所含基序最少，僅含有8個(gè)，AvCesA12所含基序?yàn)?2個(gè)，說明AvCesA12和AvCesA15與其他羅布麻CesA家族成員可能存在功能上的差異。

2.5 羅布麻CesA基因家族成員蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、亞細(xì)胞定位與信號肽分析

對15條羅布麻CesA蛋白的二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果見表2。由表2可知，CesA蛋白均由α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲四部分組成。其中CesA蛋白的無規(guī)則卷曲比例最高，α-螺旋次之，而β-轉(zhuǎn)角比例最小。根據(jù)亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果顯示羅布麻CesA基因家族主要定位在質(zhì)膜與高爾基體上，這可能與基因的生物學(xué)功能相關(guān)聯(lián)。信號肽分析結(jié)果顯示，羅布麻CesA基因家族成員均不含有信號肽。

2.6 羅布麻CesA基因家族成員蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

跨膜結(jié)構(gòu)一般由20個(gè)左右的疏水氨基酸殘基形成α-螺旋，是蛋白質(zhì)與膜內(nèi)蛋白的靜電相互作用和氫鍵鍵合作用與膜結(jié)合的一段氨基酸片段。跨膜結(jié)構(gòu)域是膜中蛋白與生物膜脂質(zhì)雙分子相結(jié)合的主要部位， 固著于細(xì)胞膜上起“錨定”作用。通過對跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測和分析，有助于了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能以及在細(xì)胞中的作用位點(diǎn)等。通過前人研究結(jié)果可知，當(dāng)前的基因組數(shù)據(jù)中，有20%～30%的基因產(chǎn)物被預(yù)測為膜蛋白（Taylor et al.， 2000），具備多種生物學(xué)功能。利用TMHMM對羅布麻CesA基因家族成員蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，除AvCesA12與AvCesA15蛋白外，其余成員蛋白在C端均含有6個(gè)完整的跨膜結(jié)構(gòu)域，且每個(gè)組成跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸數(shù)量與位置均相似，推斷其可能有相同的結(jié)構(gòu)和功能。AvCesA12與AvCesA15可能因?yàn)榘l(fā)生突變，相應(yīng)功能發(fā)生變化，從而導(dǎo)致跨膜結(jié)構(gòu)缺失。除AvCesA2、AvCesA3、AvCesA4、AvCesA10、AvCesA13與AvCesA14蛋白外，其余成員蛋白在近N端均含有2個(gè)完整的跨膜結(jié)構(gòu)域。

通過Phyre2對羅布麻CesA蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果見圖5。由圖5可知，除AvCesA15蛋白外，其余成員蛋白三級結(jié)構(gòu)在空間結(jié)構(gòu)上相似度很高，推斷其可能具有相似的生物學(xué)功能，而AvCesA15結(jié)構(gòu)差異較大，可能發(fā)生變異，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生改變。

2.7 羅布麻CesA基因家族成員共線性與進(jìn)化選擇壓力分析

利用MCScanX將羅布麻分別與雙子葉模式生物擬南芥和單子葉模式生物水稻建立2組CesA基因家族的共線性比較圖譜（圖 6）。共線性關(guān)系（同源基因?qū)Γ┰跀M南芥CesA中有11對，水稻CesA中有4對。其中AvCesA4與AvCesA8在兩個(gè)圖譜中都存在共線性關(guān)系。相較于雙子葉植物，羅布麻CesA基因家族與單子葉植物存在共線性關(guān)系的基因較少，其原因可能是植物起源基因組不同而造成的。根據(jù)Abrouk et al.（2010）的研究，雙子葉植物基因組可能源于7條古染色體，單子葉植物基因組可能源于5條古染色體。由此，我們推斷AvCesA4與AvCesA8在進(jìn)化過程中高度保守，其功能有待發(fā)掘。

非同義替換率（Ka）與同義替換率（Ks）的比值可以判斷是否有選擇壓力作用于這個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，從而反映生物進(jìn)化的過程中所受到的選擇壓力。對來源于羅布麻CesA基因家族成員間親緣關(guān)系最近的8條基因序列進(jìn)行Ka/Ks分析，結(jié)果見表3。由表3可知，基因?qū)χg的Ka/Ks的比值均小于1，顯示羅布麻CesA基因在進(jìn)化時(shí)主要受純化選擇作用。

2.8 羅布麻CesA基因家族成員系統(tǒng)進(jìn)化分析

為進(jìn)一步了解羅布麻CesA基因家族進(jìn)化關(guān)系，通過MEGA-X對羅布麻（15條）、擬南芥（10條）、亞麻（14條）、水稻（11條）共50條CesA蛋白序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖7）。由圖7可知，聚類樹分為5個(gè)亞族，羅布麻CesA基因在每一亞族中均有分布，表明各物種間CesA基因家族具有明顯的同源關(guān)系。

2.9 羅布麻CesA基因家族成員順式作用元件分析

通過對羅布麻CesA基因上游1 500 bp序列進(jìn)行分析，預(yù)測基因的順式作用元件，結(jié)果見圖8。從圖8可以看出，將CesA基因家族順式作用元件劃分為基礎(chǔ)元件、植物激素調(diào)控元件、逆境脅迫相關(guān)元件、光反應(yīng)元件、生長發(fā)育調(diào)控元件等5大類?；A(chǔ)元件包括TATA-box和CAAT-box等，數(shù)量最多。光反應(yīng)元件包括Sp1、MRE、GT1-motif、G-Box、G-box、3-AF1 binding site、ACE、ATC-motif、ACA-motif、TCT-motif等，數(shù)量排第2位。植物激素調(diào)控元件包含生長素響應(yīng)元件TGA-element、AuxRR-core，赤霉素響應(yīng)元件P-box、F-Box、GARE-motif、CARE，乙烯應(yīng)答元件ERE，脫落酸響應(yīng)元件ABRE、ABRE4，水楊酸響應(yīng)元件TCA-element，參與到茉莉酸甲酯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的TGACG-motif、CGTCA-motif，茉莉酮酸酯和激發(fā)子應(yīng)答元件JERE。逆境脅迫相關(guān)元件包含損傷誘導(dǎo)元件WRE3、WUN-motif，損傷與病原響應(yīng)元件W-box，防御與應(yīng)激反應(yīng)元件TC-rich repeats，低溫調(diào)控元件TCA、LTR，脅迫響應(yīng)元件STRE，干旱響應(yīng)元件MBS，缺氧特異性誘導(dǎo)GC-motif，干旱和滲透脅迫誘導(dǎo)元件DRE1，厭氧誘導(dǎo)調(diào)控元件ARE。生長發(fā)育調(diào)控元件包含胚乳表達(dá)所需元件GCN4_motif，玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控中的調(diào)控元件O2-site，參與種子特異性調(diào)控的順式作用調(diào)控元件RY-element，葉肉細(xì)胞分化的相關(guān)元件HD-Zip1，參與細(xì)胞周期調(diào)控的順式作用元件MSA-like，與分生組織特異性激活相關(guān)的順式調(diào)控元件CCGTCC-box，與分生組織表達(dá)相關(guān)的順式作用調(diào)控元件CCGTCC motif 、CAT-box，參與晝夜節(jié)律調(diào)控的順式調(diào)控元件circadian，根特異表達(dá)順式作用調(diào)控元件as-1。羅布麻CesA基因可能受到光、溫度、水分、氧氣等環(huán)境因子及內(nèi)源激素調(diào)控，并且這些順式作用元件有可能參與到羅布麻抗逆機(jī)制中，在植物生長發(fā)育過程中起到防御與保護(hù)作用。除此之外，該段序列富含參與植株生長發(fā)育的順式作用元件，在植株的生長與纖維素合成中有重大作用。

3?討論與結(jié)論

對羅布麻、亞麻、擬南芥、水稻CesA基因家族構(gòu)建進(jìn)化樹，由聚類分析可知， AvCesA2與AvCesA3與擬南芥中參與初生細(xì)胞壁纖維素合成基因AtCesA1、AtCesA3（Desprez et al.， 2007）聚類在同一分支，推斷這些羅布麻CesA基因可能參與初生細(xì)胞壁纖維素的合成。AvCesA5、AvCesA8、AvCesA10分別與擬南芥中參與次生細(xì)胞壁纖維素合成基因AtCesA7、AtCesA4、AtCesA8（Arioli et al.， 1998）的親緣關(guān)系較近，因此推斷這些AvCesA基因也可能參與次生細(xì)胞壁纖維素的合成。AvCesA1、AvCesA4、AvCesA6、AvCesA9、AvCesA11、AvCesA12、AvCesA15聚類在同一分支，同緣關(guān)系顯著，可知這些基因可能具有類似的生物功能。

擬南芥CesA基因家族蛋白在N端都含有一個(gè)保守的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，該保守域能在CesA蛋白形成蛋白復(fù)合體時(shí)進(jìn)行蛋白之間的相互識別（周曉馥等，2002）。通過對羅布麻CesA基因家族蛋白保守基序分析顯示，多數(shù)成員包含的保守結(jié)構(gòu)域基本一致，具有高度的保守性，這說明蛋白功能表達(dá)方面存在相似性。AvCesA12 與AvCesA15相比較，缺失部分保守結(jié)構(gòu)域，可能是基因序列發(fā)生突變引起，從而使蛋白執(zhí)行功能發(fā)生變化，這一現(xiàn)象在跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測和蛋白三級結(jié)構(gòu)中均有體現(xiàn)。AvCesA12蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測中C端第六個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)缺失，AvCesA15蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測中C端無跨膜結(jié)構(gòu)，并且三級構(gòu)象發(fā)生明顯變化。在羅布麻CesA蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測中發(fā)現(xiàn)最多包含8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，與Nawaz et al.（2019）的總結(jié)一致，在植物CesA蛋白中最多存在8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。徐昌宗等（2017）的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，普通煙草CesA蛋白跨膜結(jié)構(gòu)數(shù)量差異與該基因參與初生細(xì)胞壁或者次生細(xì)胞壁纖維素合成間存在一定關(guān)系。羅布麻CesA蛋白跨膜結(jié)構(gòu)數(shù)量存在差異，以此為思路有助于探究羅布麻CesA基因的功能。

順式作用元件能被特定的轉(zhuǎn)錄因子識別，對下游基因的特異性表達(dá)起調(diào)控作用。對羅布麻CesA基因上游1 500 bp區(qū)域進(jìn)行順式作用元件分析，該區(qū)域包含多種順式作用元件，在植物生長發(fā)育過程中可能存在重要作用。水楊酸是參與植物光敏反應(yīng)和系統(tǒng)獲得抗性反應(yīng)的重要信號分子（陳沖等， 2018），茉莉酸甲酯在植物受到病原侵害、創(chuàng)傷或者脅迫時(shí)誘導(dǎo)防御基因表達(dá)的信號分子，且在植株生命周期的各個(gè)階段也發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用（Titarenko et al.， 1997）。除此之外，多種激素與環(huán)境因素可以影響CesA基因的表達(dá)。魏凱莉等（2017）的研究顯示，赤霉素處理下楊樹次生壁CesA基因表達(dá)量明顯上調(diào)，而生長素與乙烯處理下楊樹次生壁CesA基因表達(dá)量下調(diào)，影響細(xì)胞壁中纖維素含量。油菜素甾醇和光照可以促進(jìn)擬南芥下胚軸伸長和初生壁CesA基因轉(zhuǎn)錄，促使擬南芥株形增高（Xie et al.， 2011;Leivar & Quail， 2011）。在水稻中，赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以促進(jìn)纖維素的合成，影響水稻植株節(jié)間的發(fā)育（Huang et al.， 2015）。擬南芥AtCesA8突變體植株，抗旱性顯著增強(qiáng)（Chen et al.， 2005）。龍眼DiCesA基因被脫落酸處理表達(dá)量下調(diào)，可能參與脫落酸對干旱脅迫的調(diào)控，通過對MeJA處理下DiCesA基因表達(dá)量下調(diào)，證實(shí)DiCesA參與龍眼對干旱脅迫的調(diào)控（朱永靜等，2020）。玉米CesA基因在種子生長階段參與抵御干旱脅迫的調(diào)控（張曉榕等，2019）。在羅布麻AvCesA基因家族成員的啟動(dòng)子區(qū)域都包含多種激素響應(yīng)元件，并且80%以上包含防御與逆境響應(yīng)元件，60%以上包含了干旱脅迫以及光響應(yīng)MYB結(jié)合位點(diǎn)。由此可見，CesA基因家族包含的大量光響應(yīng)、脅迫響應(yīng)、激素響應(yīng)等元件，在植株生長發(fā)育與抗逆防御方面發(fā)揮著巨大作用。

在羅布麻纖維發(fā)育有關(guān)的CesA類基因家族中，被報(bào)道的基因數(shù)目很少，并且大多數(shù)基因的功能還不清楚。本研究通過生物信息學(xué)方法分析了羅布麻基因組中的CesA基因家族的鑒定、基因結(jié)構(gòu)、蛋白特性及順式作用元件分析等，對于發(fā)掘新的與植物纖維發(fā)育相關(guān)的基因，加快羅布麻纖維發(fā)育分子機(jī)制的研究具有十分重要的意義，也為羅布麻培育高質(zhì)量纖維育種研究奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯?何永艷）