謝韻 張麗娟 帕麗達(dá)·阿布利孜

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，烏魯木齊 830011)

自二十世紀(jì)八十年代以來(lái)，隨著免疫缺陷患者數(shù)量的增加、病原真菌檢測(cè)和鑒定技術(shù)的進(jìn)步，侵襲性真菌感染(invasive fungal infections，IFI)的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)逐年上升[1]。以往IFI最常見的病原體是酵母菌，特別是念珠菌屬和隱球菌屬。近幾十年來(lái)，曲霉已成為IFI的主要病原之一[2]，主要由煙曲霉引起[3]。但是，近年來(lái)一些新發(fā)現(xiàn)的曲霉菌也導(dǎo)致嚴(yán)重的IFI,這些新發(fā)現(xiàn)的曲霉菌與煙曲霉表型相似，在遺傳和形態(tài)學(xué)上難以區(qū)分[4-5]。其中有一種于2005年首次被描述,因其產(chǎn)孢速度慢被命名為A.lentulus[6]。文獻(xiàn)報(bào)道[7-9]，至今為止全世界共有19例A.lentulus感染的報(bào)道，絕大多數(shù)被感染者是因腫瘤接受化療的免疫功能受損的患者。該菌在48℃不能生長(zhǎng)，體外抗真菌藥物敏感試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對(duì)多個(gè)抗真菌藥具有高的MIC(最低抑菌濃度)，尤其是唑類[10-12]。本研究A.lentulus臨床株分離于長(zhǎng)期用糖皮質(zhì)激素的慢性阻塞性肺疾病患者痰液，患者被診斷IFI后積極抗真菌治療，但最終死亡。本課題組關(guān)注該菌感染的死亡率高是否與毒力高有關(guān)。文獻(xiàn)復(fù)習(xí)未發(fā)現(xiàn)關(guān)于A.lentulus的毒力相關(guān)研究，本研究設(shè)以大蠟螟為感染模型[13-15]，通過(guò)生存時(shí)間、組織病理、真菌負(fù)載量等綜合評(píng)價(jià)A.lentulus的毒力。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)菌株Aspergilluslentulus臨床株(編號(hào)：XYZ 10198)、A.lentulus標(biāo)準(zhǔn)株(菌號(hào)：XYZ 10200)、煙曲霉(菌號(hào)：XYZ10186)、白念珠菌(茵號(hào)：XYZ9013)來(lái)自新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科真菌室。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 蠟螟5齡幼蟲125只，平均重量300 mg，長(zhǎng)度2.5 cm，顏色呈乳白色無(wú)黑點(diǎn)，購(gòu)自天津惠裕德生物科技有限公司。

實(shí)驗(yàn)試劑 沙堡弱葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)購(gòu)自美國(guó)BD公司；蘇木素-伊紅染液購(gòu)自華普泰克生物科技有限公司；真菌熒光染色液購(gòu)自南京漢瑞生物科技有限公司。

1.2 方法

構(gòu)建蠟螟感染模型 分組：將125只蠟螟隨機(jī)分成5組，即煙曲霉組(A.fu)、白念珠菌組(Ca)、A.lentulus臨床組、A.lentulus標(biāo)準(zhǔn)組和PBS組。每組15只觀察生存時(shí)間，其余解剖。將上述4組真菌分別接種于SDA上37 ℃培養(yǎng)。其中白念珠菌培養(yǎng)3 d，煙曲霉及A.lentulus培養(yǎng)7 d。用無(wú)菌的PBS將各個(gè)菌落洗脫，制成相對(duì)應(yīng)1.0×106CFU/mL孢子懸液，蠟螟左下腹尾足處注入40 μL。PBS組注射40 μL無(wú)菌PBS作為對(duì)照。放入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)并制作生存曲線。

制作蠟螟腸道組織病理切片及形態(tài)學(xué)觀察 取感染24 h的各組蠟螟幼蟲，在尾足處左下腹注入10%甲醛溶液，4%多聚甲醛溶液浸泡3～7 d，取其腸道組織進(jìn)行常規(guī)脫水、包埋、切片并進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色。

測(cè)定真菌逆培養(yǎng)陽(yáng)性率及蠟螟腸道真菌載量無(wú)菌條件下，將感染的蠟螟腸道組織分成3段接種于SDA試管中，于37℃恒溫箱培養(yǎng)1周，觀察試管中真菌菌落。同時(shí)將蠟螟腸道組織勻漿后，按照倍比稀釋法將蟲體體液稀釋，取100 μL蟲體液均勻涂布在SDA培養(yǎng)基上，于37℃ 培養(yǎng)48 h計(jì)數(shù)菌落。

真菌熒光染色各組真菌形態(tài) 將上述SDA試管中真菌菌落，用無(wú)菌接種環(huán)刮取少許在載玻片上，將染液均勻滴在菌落上，靜置1 min后熒光顯微鏡下拍攝真菌形態(tài)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Graphpad prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件，繪制生存曲線，采用log-rank檢驗(yàn)；應(yīng)用SPSS 22軟件，蠟螟腸道真菌載量的比較采用雙因素重復(fù)測(cè)量方差分析；P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 蠟螟感染各組真菌后的生存情況(見表1、圖1)

表1 各組不同時(shí)點(diǎn)蠟螟幼蟲存活數(shù)

圖1 蠟螟在不同時(shí)間段的生存率

同一時(shí)間點(diǎn)，A.L臨床組與A.L標(biāo)準(zhǔn)組蠟螟幼蟲存活數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Ca組與A.fu組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。A.L臨床組與A.L標(biāo)準(zhǔn)組分別與Ca組或A.fu組同一時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。表中結(jié)論及生存曲線走勢(shì)得出，注射A.L臨床組與A.L標(biāo)準(zhǔn)組的蠟螟存活數(shù)比Ca組與A.fu組多。

2.2 病理組織切片結(jié)果(見圖2)

不同菌種感染的蠟螟腸道。A.L臨床組(見圖2A)與A.L標(biāo)準(zhǔn)組(見圖2B)：腸壁結(jié)構(gòu)大致正常，局部可見腸壁水腫，腸腔內(nèi)可見少量淋巴組織細(xì)胞； A.fu組(見圖2C)：腸上皮黏膜內(nèi)可見大量淋巴組織細(xì)胞及孢子，少量嗜中性粒細(xì)胞，未見正常絨毛樣結(jié)構(gòu)； Ca組(見圖2D)：腸壁結(jié)構(gòu)破壞，腸上皮結(jié)構(gòu)紊亂，腸腔內(nèi)可見大量孢子及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖2 注射不同組真菌蠟螟腸道損傷情況(HE×200).A. 感染A. lentulus臨床株的蠟螟腸道；B. 感染A. lentulus標(biāo)準(zhǔn)株的蠟螟腸道；C. 感染煙曲霉的蠟螟腸道;D. 感染白念珠菌的蠟螟腸道. a. 輕度水腫；b. 孢子及菌絲 圖3 各組真菌逆培養(yǎng)菌落形態(tài). A. A.L臨床組; B. A.L標(biāo)準(zhǔn)組; C. 煙曲霉組; D. 白念珠菌組; E. PBS組

2.3 蠟螟真菌逆培養(yǎng)陽(yáng)性率及腸道真菌載量

A.L臨床組、A.L標(biāo)準(zhǔn)組、煙曲霉組、白念珠菌組均可見菌落生長(zhǎng)，PBS組未見菌落生長(zhǎng)(見圖3)。

A.L臨床組和A.L標(biāo)準(zhǔn)組感染蠟螟幼蟲，在24 h內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的腸道真菌負(fù)載量大致相同(見圖4)。兩組分別與Ca組和A.fu組比較，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表2，P<0.05)。隨著時(shí)間的不斷增加，各組真菌載菌量有不同程度的增加，其中Ca組最為迅速，其次為A.fu組，最后為A.L臨床組和A.L標(biāo)準(zhǔn)組。其中A.L臨床組分別與Ca組、A.fu組，以第12 h和第18 h差異最為明顯。

圖4 蠟螟腸道各時(shí)間點(diǎn)真菌負(fù)載量曲線

表2 蠟螟腸道組織各時(shí)間點(diǎn)真菌負(fù)載量

2.4 真菌熒光染色結(jié)果

刮取SDA試管中菌落于載玻片上染上色進(jìn)行觀察(見圖5)。A.lentulus臨床株、標(biāo)準(zhǔn)株，菌絲較多，孢子較少且發(fā)育緩慢，少見曲霉頭。白念珠菌孢子較多。煙曲霉，孢子多，可見曲霉頭。

圖5 熒光顯微鏡下各真菌形態(tài)(×400). A. A. lentulus臨床株；B. A. lentulus標(biāo)準(zhǔn)株；C. 白念珠菌；D. 煙曲霉. A、B. 菌絲為主；C、D. 孢子為主

3 討 論

小鼠感染模型通常被視為真菌毒力研究的金標(biāo)準(zhǔn)，因經(jīng)濟(jì)和倫理的高要求哺乳動(dòng)物在感染動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的使用受到了限制，特別是需要做大規(guī)模菌株動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)費(fèi)用高。鑒于以上問(wèn)題，微型宿主模型，主要是無(wú)脊椎動(dòng)物，已被探索作為真菌感染的替代模型。這些模型包括阿米巴、線蟲、黑腹果蠅和大蠟螟幼蟲等[16-18]。大蠟螟的幼蟲已被廣泛用于評(píng)估微生物病原體的毒力和抗菌藥物療效的替代模型[18-19]。在念珠菌屬[19-20]、曲霉屬[21]、新生隱球菌[22]等致病真菌研究中是被認(rèn)可的模型動(dòng)物，蠟螟模型實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與小鼠模型實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有較強(qiáng)的相關(guān)性[23]。與其他非哺乳動(dòng)物模型相比，大蠟螟感染模型具有以下優(yōu)勢(shì)：價(jià)格低廉，不受倫理限制，幼蟲體積較大，能準(zhǔn)確注射病原菌接種量，37℃的高溫能存活，相當(dāng)于哺乳動(dòng)物宿主的溫度。此外，幼蟲的免疫系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物的先天免疫系統(tǒng)相似，其血細(xì)胞采取與人類中性粒細(xì)胞相似的機(jī)制來(lái)識(shí)別真菌細(xì)胞，主要作用包括病原體識(shí)別受體、吞噬作用和氧化爆發(fā)途徑中超氧化物的產(chǎn)生[17,24,25]。不同劑量感染后的蠟螟死亡率或LD50的測(cè)定通常被用作評(píng)估微生物毒力的主要參數(shù)，并用來(lái)對(duì)菌株的相對(duì)毒力進(jìn)行排序[17]。在沒(méi)有死亡率的情況下，真菌負(fù)荷可用于比較菌株之間的毒力[18]。因此，大蠟螟的幼蟲越來(lái)越多地被用作微生物感染的模型也就不足為奇了。

A.lentulus感染好發(fā)于接受免疫抑制治療或免疫功能受損的患者，侵襲性曲霉病最常見于呼吸道的感染，患者易發(fā)生播散性曲霉病，并伴有心臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、腸道和其他器官的受累[26]。本課題組前期對(duì)蠟螟幼蟲生存率、體表黑色素化及活動(dòng)度研究顯示A.lentulus的毒力比煙曲霉和白念珠菌等重要醫(yī)學(xué)真菌弱[29]。本研究的毒力實(shí)驗(yàn)使用存活曲線、組織病理學(xué)和真菌負(fù)載量進(jìn)一步驗(yàn)證了以往的研究結(jié)果。用106CFU/mL的不同真菌活化孢子菌懸液感染蠟螟幼蟲，結(jié)果顯示A.lentulus臨床株和標(biāo)準(zhǔn)株毒力比白念珠菌和煙曲霉弱。幼蟲腸道組織損傷在接種前兩者的幼蟲中較不明顯，表現(xiàn)為腸道結(jié)構(gòu)大致正常，局部輕度水腫伴少量菌絲、孢子及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；后兩者表現(xiàn)為大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)伴隨真菌孢子堆積，導(dǎo)致腸道組織結(jié)構(gòu)紊亂。與對(duì)照菌株相比，A.lentulus臨床株和標(biāo)準(zhǔn)株的低真菌負(fù)載量顯示出較低的感染程度。本研究中白念珠菌的真菌負(fù)載量比煙曲霉多，可能是因?yàn)樵谝欢〞r(shí)間內(nèi)，白念珠菌較煙曲霉生長(zhǎng)快，并不代表白念珠菌毒力比煙曲霉強(qiáng)。

真菌毒力的增強(qiáng)或減弱由若干復(fù)雜因素決定，如真菌形態(tài)發(fā)生、表面抗原物質(zhì)(β-葡聚糖，幾丁質(zhì)，甘露聚糖等)、黏附因素、色素、細(xì)胞因子，次生代謝產(chǎn)物及調(diào)控基因等，因此，真菌毒力研究及致病性被研究者關(guān)注。真菌的毒力和宿主的免疫狀態(tài)共同決定了是否發(fā)生真菌感染以及真菌感染的嚴(yán)重程度[15,25,27]。當(dāng)機(jī)體受到外來(lái)微生物感染時(shí)，便會(huì)啟動(dòng)先天性免疫系統(tǒng)通過(guò)其表面的模式識(shí)別受體或感應(yīng)系統(tǒng)激活炎癥反應(yīng)，促進(jìn)炎癥因子IL-1β，IL-18 等釋放[28]。本研究初步探究了A.lentulus的毒力,結(jié)果顯示為低毒力菌株，與現(xiàn)存臨床病例報(bào)道的高死亡率相矛盾。我們推測(cè)造成患者死亡的原因不是該菌的毒力，而是對(duì)多種抗真菌藥物不敏感，死亡率高是否與該菌的耐藥基因相關(guān)有待進(jìn)一步研究。