李海霞，謝久鳳，孫金花

（河南農(nóng)業(yè)大學，河南 鄭州 450002）

玉米為重要的糧飼兼用作物，在國民經(jīng)濟中占有重要地位。利用分子生物學手段培育玉米新品種，對擴大玉米種植面積、提高玉米產(chǎn)量具有重要意義，因此，轉(zhuǎn)基因玉米研究也越來越受到重視。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育具有抗病、抗蟲、抗逆、抗除草劑、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因玉米品種已經(jīng)成為世界各國育種研究的主要任務(wù)[1]。1986年Fromm等[2]用電擊法將抗除草劑基因pat轉(zhuǎn)入玉米原生質(zhì)體中，獲得了轉(zhuǎn)化細胞；1988年Rhodes等[3]用電擊法獲得了轉(zhuǎn)基因玉米植株，為玉米轉(zhuǎn)基因研究翻開了新篇章。從首例玉米轉(zhuǎn)基因報道以來，人們不斷優(yōu)化玉米轉(zhuǎn)基因體系，盡管轉(zhuǎn)基因的方法多種多樣，但多年實踐表明，農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化以其獨特的優(yōu)點一直受到育種家和分子生物學家的重視。玉米幼胚是目前基因工程使用較多的外植體，已有報道將新鮮的幼胚（IE）或由幼胚[4，5]誘導形成的I型[6]和II型[7]愈傷組織作為玉米轉(zhuǎn)基因的受體材料。

以玉米雜交種昌7-2×HiⅡA和鄭22×87-1的幼胚誘導、繼代篩選出的良好Ⅱ型胚性愈傷組織為材料，用農(nóng)桿菌（LBA4404）介導法進行轉(zhuǎn)化，利用攜帶的GUS報告基因的表達載體p3301對轉(zhuǎn)化過程中抗菌素的抑制效果、農(nóng)桿菌的侵染時間、共培養(yǎng)的處理方法等條件進行優(yōu)化，旨為高效玉米轉(zhuǎn)化體系建立提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

轉(zhuǎn)化受體材料為鄭22×87-1、昌7-2×HiⅡA的幼胚誘導后進行1次繼代培養(yǎng)的胚性愈傷組織。

農(nóng)桿菌菌株為LBA4404，攜帶雙元質(zhì)粒載體pCAMBIA3301，由河南農(nóng)業(yè)大學小麥育種研究室提供，質(zhì)粒Cre-Loxp和BJ40由河南農(nóng)業(yè)大學作物遺傳育種實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌液制備 將-70℃保存下的農(nóng)桿菌在含有50 mg/L Kan的LB培養(yǎng)基平板上畫線培養(yǎng)2～3 d，從平板上挑取單菌落，接種于含50 mg/L Kan的600μL YEP液體培養(yǎng)基中，28℃下180 r/min振蕩過夜。將菌液按1∶100的比例轉(zhuǎn)接入40 mL YEP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～5 h，至OD600為0.3～0.5，然后4℃下5 000 r/min離心5 min，收集菌體。將菌體加入40 mL侵染液體培養(yǎng)基（YEP＋100μmol/L As，pH值5.2）重新懸浮，至OD600約為0.3時備用。

1.2.2 受體材料準備 轉(zhuǎn)化前3 d，挑選生長一致的優(yōu)良愈傷組織繼代培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)接1次，進行轉(zhuǎn)化前預培養(yǎng)。將預培養(yǎng)3 d的愈傷組織夾入三角瓶中，盡可能不帶培養(yǎng)基，倒入已制備好的菌液，完全浸沒愈傷組織。輕輕顛倒離心管15～20次，靜止離心管5～10 min，侵染完成后棄去菌液，用濾紙吸干愈傷組織表面的多余菌液，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基（N6＋2.0 mg/L 2，4-D＋700 mg/L脯氨酸＋500 mg/L水解酪蛋白＋30 g/L蔗糖）上，25℃暗培養(yǎng)3 d，然后用無菌水沖洗愈傷組織2～3次，再用含300 mg/L頭孢霉素（Cef）的液體繼代培養(yǎng)基清洗1次，置于濾紙上吸干，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基（N6＋2.0 mg/L 2，4-D＋700 mg/L脯氨酸＋500 mg/L水解酪蛋白＋30 g/L蔗糖）中，25℃暗培養(yǎng)1周，再轉(zhuǎn)入含200 mg/L Cef和50 mg/L Kan培養(yǎng)基（N6＋2.0 mg/L 2，4-D＋700 mg/L脯氨酸＋500 mg/L水解酪蛋白＋30 g/L蔗糖＋200 mg/L Cef＋50 mg/L Kan，pH值5.8）上避光篩選，每代15 d，連續(xù)篩選2代。

1.2.3 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化部分條件的優(yōu)化

1.2.3.1 Cef濃度對農(nóng)桿菌的抑制效果。從新鮮的平板上挑取農(nóng)桿菌單菌落，接種到含50 mg/L Kan的3 mL YEP培養(yǎng)基中，28℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)生長至OD600為0.5；按1∶100的比例均勻稀釋培養(yǎng)液，每管分裝5 mL，分別添加不同濃度的Cef，試驗Cef濃度設(shè)0（CK）、100、200、300、400、500和600 mg/L計7個處理，3次重復，在波長600 nm下測定OD600；并在28℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h，測定其OD600。計算3個重復樣品OD600的算術(shù)平均值。

1.2.3.2 影響玉米愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的因素條件篩選。

（1）侵染液類型對轉(zhuǎn)化的影響。以昌7-2×HiⅡA愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體，分別采用LB、N6、YEP培養(yǎng)基作為侵染液，28℃暗培養(yǎng)3 d后進行GUS染色，觀察染色結(jié)果。

（2）As對轉(zhuǎn)化的影響。以昌7-2×HiⅡA愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體，分別采用YEP和LB培養(yǎng)基作為侵染液，2種培養(yǎng)基均分別設(shè)侵染與共培養(yǎng)時不加As、侵染與共培養(yǎng)時加入100μmol/L As處理，28℃暗培養(yǎng)3 d后進行GUS染色，觀察染色結(jié)果。

（3）侵染時間對轉(zhuǎn)化的影響。分別以鄭22×87-1和昌7-2×HiⅡA愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體，侵染時間設(shè)5、10、15、20、25和30 min共6個處理，每處理200塊愈傷，侵染后25℃共培養(yǎng)3 d，2次繼代篩選后統(tǒng)計抗性愈傷數(shù)量，計算抗性愈傷率（抗性愈傷數(shù)/轉(zhuǎn)入篩選愈傷總數(shù)×100%）。

（4）共培養(yǎng)后處理方式對轉(zhuǎn)化的影響。對鄭22×87-1共培養(yǎng)的愈傷，進行5個不同的處理。對照（CK）：共培養(yǎng)后直接轉(zhuǎn)入延遲篩選培養(yǎng)基；A1處理：共培養(yǎng)后洗菌，用濾紙吸去多余水分，直接轉(zhuǎn)入延遲篩選培養(yǎng)基；A2處理：共培養(yǎng)后洗菌，用濾紙吸去多余水分，在超凈工作臺上小風吹2 h后轉(zhuǎn)入延遲篩選培養(yǎng)基；A3處理：共培養(yǎng)后洗菌，放在濾紙上吸水5 h，轉(zhuǎn)入延遲篩選培養(yǎng)基；D1處理：培養(yǎng)基上加1層濾紙共培養(yǎng)，共培養(yǎng)后不洗菌，直接轉(zhuǎn)入延遲篩選培養(yǎng)基；D2處理：培養(yǎng)基上加1層濾紙共培養(yǎng)，共培養(yǎng)后洗菌，濾紙吸去多余水分，轉(zhuǎn)入延遲篩選培養(yǎng)基。每處理100塊愈傷，25℃暗培養(yǎng)7 d，觀察愈傷狀態(tài)；然后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基，篩選培養(yǎng)2次，統(tǒng)計抗性愈傷數(shù)量，計算抗性愈傷率。

1.2.4 GUS組織化學染色 采用GUS組織化學染色法[8]，將待檢愈傷組織培養(yǎng)共培養(yǎng)后，置于X-Gluc染色液中染色，37℃恒溫過夜，加等量70%酒精停止反應(yīng)?？煞磸陀?0%或95%酒精浸泡，退掉組織綠色，使藍色更清楚。用實體顯微鏡（ZOOM 2000）檢測顏色反應(yīng)，并計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cef濃度對農(nóng)桿菌的抑制效果

Cef對導入不同質(zhì)粒的同一種農(nóng)桿菌的抑制效果完全一致，均可以明顯抑制農(nóng)桿菌繁殖，其中100 mg/L Cef處理能夠完全抑制農(nóng)桿菌的生長（圖1）。表明Cef對農(nóng)桿菌的抑菌效果不因外來質(zhì)粒的導入而有差異。

圖1 頭孢霉素對農(nóng)桿菌的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of cephalosporin on A.tumefaciens

2.2 影響玉米愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的因素條件篩選

2.2.1 侵染液類型對轉(zhuǎn)化的影響 分別用加入AS的3種侵染液進行侵染轉(zhuǎn)化，共培養(yǎng)后染色，結(jié)果（圖2）顯示，不同侵染液的區(qū)別不明顯。表明侵染液類型不是影響轉(zhuǎn)化率的決定因素。

2.2.2 As對轉(zhuǎn)化的影響 侵染與共培養(yǎng)時加入As，GUS染色率明顯提高，愈傷組織染色后呈藍色的數(shù)量多，且藍色較深（圖3）。不加As的LB和YEP培養(yǎng)基，染色率分別為10.0%和23.8%；加入As后，2種培養(yǎng)基的染色率分別為50.0%和57.1%。表明在玉米愈傷組織的轉(zhuǎn)化過程中加入As，可以明顯提高轉(zhuǎn)化效率。

圖2 侵染液類型對玉米愈傷組織轉(zhuǎn)化的影響Fig.2 Effects of different infection liquors on callus transformation of maize

圖3 As對玉米愈傷組織轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.3 Effects of AS on callus transformation efficiency of maize

2.2.3 侵染時間對轉(zhuǎn)化的影響 侵染時間是影響轉(zhuǎn)化效率的重要因素。侵染時間過長，在以后的培養(yǎng)過程中農(nóng)桿菌對愈傷組織傷害過大，對篩選抗性愈傷不利；侵染時間過短，農(nóng)桿菌與愈傷組織接觸不充分，也會導致轉(zhuǎn)化效率降低。隨著侵染時間的延長，抗性愈傷率呈先升高后降低的變化（圖4）。對于鄭22×87-1，侵染5、10、15 min經(jīng)2次篩選后抗性愈傷率分別為5.5%、9.0%和3.0%；侵染20、25、30 min經(jīng)2次篩選后愈傷逐漸褐化死亡，未得到抗性愈傷。對于昌7-2×HiⅡA，侵染5、10、15、20 min經(jīng)2次篩選后抗性愈傷率分別為8.0%、11.0%、4.5%和4.0%；侵染25、30 min經(jīng)2次篩選后未得到抗性愈傷。因此，侵染時間不宜超過15 min，以10 min最佳。

圖4 侵染時間對轉(zhuǎn)化的影響Fig.4 Effect of infection time on transformation

2.2.4 共培養(yǎng)后處理方式對轉(zhuǎn)化的影響 共培養(yǎng)后經(jīng)過不同處理，轉(zhuǎn)入延遲篩選培養(yǎng)基，1周后觀察結(jié)果（表1）顯示，愈傷組織生長慢，顏色發(fā)暗，其中A3、D1和D2處理有少量鮮黃愈傷。出現(xiàn)這種狀況的原因，除愈傷組織本身的差別外，農(nóng)桿菌對愈傷的傷害作用較大，農(nóng)桿菌在接觸培養(yǎng)基的地方生長較快，D1和D2處理在共培養(yǎng)時加入了1層濾紙，這樣大量繁殖的農(nóng)桿菌被濾紙吸附，愈傷組織上未見有大量農(nóng)桿菌，可見在后期培養(yǎng)過程中對愈傷的傷害較小，愈傷生長狀態(tài)較好（圖5）；且這樣處理后，洗菌與否轉(zhuǎn)化效果差異不大。而A1、A2和A3處理的洗菌效果不理想，原因是愈傷過多受水分影響，在后期培養(yǎng)過程中，愈傷整體生長狀態(tài)不好，有水漬化現(xiàn)象。因此，共培養(yǎng)時培養(yǎng)基上附加1層滅菌濾紙能減少農(nóng)桿菌對愈傷組織的傷害，既能起到共培養(yǎng)的作用，又能得到生長質(zhì)量好的抗性愈傷。

表1 鄭22×87-1共培養(yǎng)后不同處理方式對轉(zhuǎn)化的影響Table 1 Effect of different treatments after co-culture on transformation of Zheng 22×87-1

圖5 共培養(yǎng)后不同處理方式對愈傷生長的影響Fig.5 Effects of treatments after co-culture on the growth of callus

3 結(jié)論與討論

農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化是一個復雜的體系，影響轉(zhuǎn)化的因素較多，農(nóng)桿菌菌株類型及載體、受體材料生長狀態(tài)及基因型、培養(yǎng)基成分及附加物等都對轉(zhuǎn)化效率有很大影響。菌株和載體也對轉(zhuǎn)化起到很重要的作用，其中超雙無載體Psb131和pTOK233一般用LBA4404進行轉(zhuǎn)化[9，10]。

在農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化過程中，要使轉(zhuǎn)化最為有效，就要利用農(nóng)桿菌快速繁殖期（即對數(shù)生長期）的菌液轉(zhuǎn)化，這時農(nóng)桿菌具有很高的活性。本研究中對所保存的菌株進行多次活化，以使農(nóng)桿菌處于最好的侵染狀態(tài)，提高轉(zhuǎn)化成功率。受體材料保持旺盛分生狀態(tài)是農(nóng)桿菌侵染的必需條件[11]。研究表明，當植物細胞處于分裂旺盛期或DNA合成活躍時，轉(zhuǎn)化率最高。只有愈傷組織處于旺盛的分生狀態(tài)，才能提高農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率。因此，本研究在侵染前將優(yōu)良的胚性愈傷組織繼代預培養(yǎng)3 d，以使愈傷組織細胞處于活躍的分裂增殖狀態(tài)來接受外來基因的轉(zhuǎn)入，同時也增強愈傷組織對農(nóng)桿菌傷害的抵抗能力，確保轉(zhuǎn)化成活率。

在農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化中，外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，在表面及淺層組織中仍附著或共生有大量的農(nóng)桿菌。本研究結(jié)果表明，Cef可以明顯抑制農(nóng)桿菌繁殖，Cef濃度≥100 mg/L時能夠完全抑制農(nóng)桿菌生長。由于抗菌素加入固體培養(yǎng)基抑菌效果不如加入液體培養(yǎng)基直接，所以可適當提高抗菌素的濃度。綜合考慮，在農(nóng)桿菌介導的玉米遺傳轉(zhuǎn)化中，為盡快消除農(nóng)桿菌對愈傷組織的傷害，可在延遲篩選時選用200 mg/L的Cef快速抑菌；若在篩選時選用100 mg/L的Cef，根據(jù)抑菌情況，分化時可以進一步減少。做到既可以完全抑制農(nóng)桿菌的生長，又可以最大程度地降低對愈傷的傷害。

農(nóng)桿菌T-DNA轉(zhuǎn)移及整合到植物中，主要由Ti質(zhì)粒上的Vir基因編碼的功能蛋白完成，Vir基因需要一些誘導因子才能被活化，而植物受傷細胞分泌酚類化合物如As、苯乙酮及結(jié)構(gòu)類似物等是Vir基因的誘導因子。劉志明等[12]、Mathews等[13]和Godwin等[14]研究表明，農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化過程中，酚類化合物As和復合酚類化合物起到明顯的促進作用。Stachel等[15]和劉建光等[16]認為，酚類化合物As對農(nóng)桿菌Vir基因的誘導是必要的。因而酚類化合物被廣泛用于促進農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化。As是雙子葉植物細胞壁合成的前體，所以認為雙子葉植物是農(nóng)桿菌的天然受體。許多研究認為單子葉植物可能不產(chǎn)生酚類化合物或產(chǎn)生的量不足以作為信號誘導分子，因此添加一定量AS以促進根癌農(nóng)桿菌感染單子葉植物。本研究結(jié)果表明，As在不同侵染液中所起的作用有差異，其中LB培養(yǎng)中加入As時效果明顯，愈傷組織染色率較不加As處理明顯提高。

侵染時間對農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化有較大影響[17]。一定范圍內(nèi)，延長侵染時間可以提高GUS基因在愈傷組織中的表達水平，但是進一步提高侵染強度，GUS表達率未發(fā)生很大變化，可能是由于加大侵染強度會降低受體細胞活力，引起轉(zhuǎn)化效率降低[18]。本研究結(jié)果也表明，侵染時間對轉(zhuǎn)化后抗性愈傷的獲得有較大影響，侵染時間超過15 min基本上篩選不到抗性愈傷組織。較長的侵染時間可能會提高農(nóng)桿菌對受體材料的附著能力，在一定程度上提高轉(zhuǎn)化效率，但是大量的農(nóng)桿菌對受體材料產(chǎn)生了極大的傷害，即使基因轉(zhuǎn)化進入，也很難篩選到抗性愈傷組織。