趙晟隆，張為遠(yuǎn)

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)部，北京100026)

唐氏綜合征是活產(chǎn)兒中最常見的非整倍體常染色體疾病，由第21號(hào)染色體的三倍體引起，表型累及身體多個(gè)系統(tǒng)，尤其是骨骼、肌肉和心血管系統(tǒng)，患者通常有身材矮小、肌張力低下、寰樞椎不穩(wěn)定、神經(jīng)元密度降低、腦發(fā)育不全、智力障礙和先天性心臟病(尤其是房室間隔缺損)等。唐氏綜合征患者還易并發(fā)甲狀腺功能減退、自身免疫性疾病、阻塞性睡眠呼吸暫停、癲癇、聽力和視力障礙、血液系統(tǒng)疾病(包括白血病)、復(fù)發(fā)感染、焦慮癥和早發(fā)性阿爾茨海默病等疾?。?－2］。全球唐氏綜合征患病率為7∶5 000;新生兒唐氏綜合征發(fā)病率為1∶1 000［3］;中國(guó)新生兒唐氏綜合征發(fā)病率為1∶800［4］。目前，唐氏綜合征的表型癥狀難以治愈，導(dǎo)致患病個(gè)體及其家庭的生活質(zhì)量受到嚴(yán)重影響。因此，明確的產(chǎn)前篩查結(jié)果是診斷胎兒唐氏綜合征的重要線索?，F(xiàn)對(duì)母血、羊水、胎盤和臍血中的蛋白質(zhì)組學(xué)研究及其在唐氏綜合征產(chǎn)前篩查中的應(yīng)用予以綜述。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)簡(jiǎn)介

染色體異常導(dǎo)致基因表達(dá)量和質(zhì)的差異，基因通過(guò)其所表達(dá)的蛋白質(zhì)發(fā)揮對(duì)生命體的調(diào)控功能，蛋白質(zhì)變化是生命功能失常的直接因素，隨著研究的不斷深入，蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)運(yùn)而生［5］。蛋白質(zhì)組學(xué)為“一種細(xì)胞、組織或有機(jī)體所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)”，已被作為研究胎兒狀況和妊娠相關(guān)疾病的平臺(tái)，如胎兒非整倍體、早產(chǎn)、子癇前期、宮內(nèi)感染和胎兒窘迫［6］。目前，需要通過(guò)一種更安全、更快速的替代有創(chuàng)羊膜腔穿刺術(shù)的非侵入性方法，并利用其獲得的生物樣本材料［如母體各種體液樣本(如血漿、血清、尿液、宮頸黏液、陰道分泌物、唾液和羊水)和胎兒樣本(如胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞、胎膜和臍血)］尋找妊娠相關(guān)病理標(biāo)志物［7］。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)的方法和技術(shù)

根據(jù)標(biāo)本的性質(zhì)進(jìn)行樣品分離、制備和破碎，且肽和蛋白質(zhì)水平的分離步驟可能有所不同。鑒定蛋白質(zhì)組學(xué)所使用的標(biāo)記策略和總體方法匯總見表1。

表1 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)及其功能

2.1 雙向凝膠電泳 雙向凝膠電泳是利用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子質(zhì)量?jī)身?xiàng)獨(dú)立的物理化學(xué)參數(shù)來(lái)分離復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物。等電聚焦是通過(guò)電流通過(guò)時(shí)形成電壓梯度的電解質(zhì)溶液來(lái)實(shí)現(xiàn)［8］。在電場(chǎng)的作用下，蛋白質(zhì)根據(jù)電荷遷移到pH值與蛋白質(zhì)等電點(diǎn)相匹配的電解質(zhì)區(qū)域。蛋白質(zhì)在第一個(gè)維度被電荷分離，而在第二個(gè)維度則根據(jù)它們的質(zhì)量不同而被分離，分子量分離是基于電場(chǎng)作用下蛋白質(zhì)遷移速率的差異，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠中的電泳來(lái)實(shí)現(xiàn)的［6］。

2.2 質(zhì)譜法 質(zhì)譜是研究蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一，適用于特定研究任務(wù)的高通量色譜－質(zhì)譜分析策略在蛋白質(zhì)形式研究方法中占據(jù)核心地位。根據(jù)研究目的將基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)方法分為適合篩選研究的鳥槍法以及用于分析特定蛋白質(zhì)形式的靶向性方法［9］。在典型的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，在質(zhì)譜前行色譜分離，其允許在一個(gè)由兩個(gè)接觸的非混合相組成的系統(tǒng)中分離多肽，其中一個(gè)相通常相對(duì)于另一個(gè)相是流動(dòng)的，即固定相移動(dòng)［10］。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA) ELISA是一種基于蛋白質(zhì)畸變定位的方法，被用來(lái)鑒定病理生理?xiàng)l件。通過(guò)固定在固體表面的抗原與添加酶偶聯(lián)抗體之間的相互作用來(lái)測(cè)量酶活性的波動(dòng)，酶活性的波動(dòng)與樣品中的抗原抗體濃度成正比。ELISA基于固定的蛋白質(zhì)(抗體)功能活性以及高度特異性的抗體－酶復(fù)合物相互作用兩個(gè)原則［11］。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選唐氏綜合征標(biāo)志物

胎兒發(fā)育異常反映在完整細(xì)胞、核酸(DNA和信使RNA)、多肽、蛋白質(zhì)和酶等方面，它們?cè)谠衅诒３种鴦?dòng)態(tài)平衡，以維持正常的生理功能;胎兒發(fā)育異常會(huì)破壞這種固有平衡，引起蛋白質(zhì)表達(dá)水平的改變［12］。既往有學(xué)者嘗試?yán)没蚪M學(xué)探索新的負(fù)責(zé)表達(dá)生理變異的基因，但由于人類蛋白質(zhì)組研究的復(fù)雜性，研究進(jìn)展并不令人滿意［13］。近年蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)才被用于妊娠研究，如通過(guò)識(shí)別正常胎兒和異常胎兒蛋白質(zhì)的差異可能揭示特定疾病的發(fā)生途徑，以加深對(duì)胎兒發(fā)育的認(rèn)識(shí)和了解［14］。

3.1 母血特異性蛋白的篩選 早在2007年，Nagalla等［15］采用多種互補(bǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)方法(包括熒光二維凝膠電泳、二維液相色譜－色譜聚焦、多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜多肽圖譜)對(duì)56例唐氏綜合征篩查陽(yáng)性孕婦［包括20例妊娠早期(孕11～13周)、36例妊娠中期(孕15～18周)］和56名正常妊娠女性的血清樣本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，妊娠早期和中期的母體血清學(xué)樣本中分別有28種和26種蛋白的表達(dá)水平存在差異，其中孕早期19種、孕中期16種，孕早期和孕中期共有的蛋白10種。

基于質(zhì)譜計(jì)數(shù)的多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)數(shù)據(jù)定量分析的蛋白有α1－酸性糖蛋白、血清淀粉樣蛋白A、內(nèi)α－胰蛋白酶抑制劑重鏈H4、血管緊張素原、載脂蛋白C－Ⅰ、纖維蛋白、血小板堿性蛋白、甲狀腺素運(yùn)載蛋白、載脂蛋白D和妊娠特異性糖蛋白。理論上，蛋白質(zhì)組學(xué)可以識(shí)別單一、高度選擇性的疾病生物標(biāo)志物。然而，經(jīng)目前反復(fù)研究證實(shí)，單個(gè)分子與特定疾病表型關(guān)聯(lián)的確定不足以詳細(xì)評(píng)估病理或有效預(yù)測(cè)疾病結(jié)果。相反，雖然覆蓋疾病復(fù)雜性的生物標(biāo)志物(橫切面或縱切面)組合對(duì)個(gè)體間的變化不敏感，但更適合描述或代表疾病情況［16］。蔣瀅等［17］對(duì)7份確診唐氏綜合征胎兒的孕中期(14～20周)母體血清和同期7份正常胎兒母體血清行二維凝膠電泳顯示，唐氏綜合征組母體血清中表達(dá)差異1.5倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)29個(gè)，其中19個(gè)表達(dá)上調(diào)、10個(gè)表達(dá)下調(diào);且經(jīng)質(zhì)譜分析有12個(gè)蛋白質(zhì)與差異表達(dá)2倍以上的8個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)匹配，該組蛋白可能與載脂肪蛋白類、絲氨酸蛋白酶類、β2糖蛋白類、激肽原類和補(bǔ)體C3類等有關(guān);經(jīng)蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，脫氧鳥苷三磷酸酶和β2糖蛋白1在唐氏綜合征胎兒孕中期母體血清中高表達(dá)。

由于雙向凝膠電泳的局限性，現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)研究大多采用電子噴霧質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，并主要依靠同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)進(jìn)行定量分析，現(xiàn)已證明該系統(tǒng)非常有效［18］。López Uriarte等［3］采用納米升級(jí)超高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析不同組別(10例未妊娠、10例正常妊娠、9例唐氏綜合征妊娠)女性血清標(biāo)本蛋白水平的差異發(fā)現(xiàn)，未妊娠女性血清標(biāo)本中有10種蛋白質(zhì)，正常妊娠女性血清標(biāo)本中有8種蛋白質(zhì)，而唐氏綜合征胎兒孕婦血清標(biāo)本有42種蛋白質(zhì)(包括C4b結(jié)合蛋白α鏈、間α－解密蛋白抑制劑重鏈H1、血液結(jié)合素、載脂蛋白E、激肽原1，亞型CRA－b、β2糖蛋白1、α1－酸性糖蛋白、補(bǔ)體因子H等);妊娠兩組女性血清中均含有大量的蛋白質(zhì)，其中35種蛋白質(zhì)一致。

基因調(diào)控是了解疾病機(jī)制的關(guān)鍵，因此利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量有助于同時(shí)鑒定和定量蛋白質(zhì)［19］。Zhao等［20］使用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)對(duì)10名未妊娠女性、10名正常妊娠女性和10例唐氏綜合征胎兒妊娠母體血清蛋白水平的變化進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，唐氏綜合征胎兒組和正常胎兒組的11種蛋白質(zhì)血清水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中6種蛋白質(zhì)水平上調(diào)、5種蛋白質(zhì)水平下調(diào)，4種蛋白質(zhì)(妊娠特異性β1糖蛋白、組織蛋白酶D、血清淀粉樣蛋白A2和血清淀粉樣蛋白A)可能與唐氏綜合征相關(guān)。

3.2 羊水標(biāo)志物的篩選 自20世紀(jì)50年代以來(lái)，羊水細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于胎兒畸形的產(chǎn)前診斷。妊娠中期的羊水細(xì)胞數(shù)量為10～1 000個(gè)/μL，其通過(guò)產(chǎn)生的多種因子(細(xì)胞因子、脂質(zhì)和前列腺素等)應(yīng)答來(lái)自自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌的信號(hào)［21］。由于上述內(nèi)分泌因子均在羊水中產(chǎn)生，羊水中含有大量根據(jù)基因型構(gòu)成和母胎調(diào)節(jié)而表達(dá)的蛋白質(zhì)，此類蛋白質(zhì)包括酶、結(jié)構(gòu)蛋白、熱激蛋白和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白等，其構(gòu)成的平衡是孕期胎兒健康發(fā)育所必需的，而蛋白質(zhì)構(gòu)成的不平衡可導(dǎo)致妊娠并發(fā)癥的發(fā)生，這為疾病研究提供了新的視角［22－23］。

目前唐氏綜合征主要通過(guò)測(cè)定甲胎蛋白、人絨毛膜促性腺激素和二聚體抑制素A水平進(jìn)行篩查，通常在妊娠15周左右進(jìn)行，假陰性率為22%～25%［24］。微陣列可在細(xì)胞水平上發(fā)現(xiàn)信使RNA表達(dá)的變化，但并不能提供關(guān)于細(xì)胞蛋白質(zhì)組的全面信息［25］。因此，需要更有效的直接測(cè)量蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)目前仍是測(cè)量蛋白質(zhì)表達(dá)的最有力工具［26－28］。但也有其他技術(shù)(如強(qiáng)陽(yáng)離子交換)用于唐氏綜合征的蛋白質(zhì)檢測(cè)和分析［29］。Liu等［30］對(duì)妊娠18～22周產(chǎn)前診斷高危唐氏綜合征者行羊膜穿刺術(shù)檢測(cè)羊水細(xì)胞中的蛋白質(zhì)水平，結(jié)果顯示，唐氏綜合征羊水細(xì)胞18例，染色體正常羊水細(xì)胞20例;并采用雙向凝膠電泳和電子噴霧質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了41個(gè)差異蛋白，在唐氏綜合征羊水細(xì)胞中有6種蛋白質(zhì)(鈣黏蛋白、核磷蛋白、延伸因子－1β、組織蛋白酶D、血小板活化因子乙酰水解酶IB亞基β和14－3－3蛋白β/α)表達(dá)水平顯著上調(diào)。免疫印跡法證實(shí)，核磷蛋白和組織蛋白酶D在唐氏綜合征羊水中高表達(dá);此外，基因劑量效應(yīng)是導(dǎo)致唐氏綜合征表型不同的原因之一，由于基因數(shù)量較大，很難清楚地了解位于第21號(hào)染色體上的基因與唐氏綜合征表型之間的聯(lián)系［31］。這些蛋白質(zhì)都不是由第21號(hào)染色體上的基因編碼，唐氏綜合征由減數(shù)分裂不分離(約占95%)和體細(xì)胞有絲分裂錯(cuò)誤(約占5%)所致［32］。

3.3 臍血特異性蛋白質(zhì)篩選 臍血由全血中的所有元素(紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血漿和血小板)組成。通常認(rèn)為，最接近疾病原發(fā)部位標(biāo)本(臍血和胎盤細(xì)胞、組織和體液)中的潛在生物標(biāo)志物水平最高，故通過(guò)臍血檢測(cè)可診斷多種妊娠期胎兒疾病。文錦麗等［33］應(yīng)用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)蛋白定量法篩選出506種唐氏綜合征胎兒臍血差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中24中蛋白質(zhì)的表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，16種蛋白質(zhì)表達(dá)水平上調(diào)，8種蛋白質(zhì)表達(dá)水平下調(diào)，以基質(zhì)蛋白－3、胸腺肽β10和骨橋蛋白變化最明顯。

臍血取材相對(duì)困難，但可直接反映胎兒蛋白表達(dá)的差異。Sui等［34］采用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)與基因本體論分析研究6例唐氏綜合征孕婦和11名健康孕婦臍血蛋白水平的變化，結(jié)果顯示，與唐氏綜合征相關(guān)的蛋白質(zhì)有19種，其中13種表達(dá)上調(diào)、6種表達(dá)下調(diào)，結(jié)合相關(guān)研究結(jié)論明確載脂蛋白E、補(bǔ)體因子B、淀粉樣蛋白P成分、Matrin－3和骨橋蛋白5種蛋白質(zhì)與唐氏綜合征相關(guān)，且前3種蛋白質(zhì)在唐氏綜合征中顯著上調(diào)。

3.4 尿液標(biāo)志物的篩選 尿液和尿多肽是潛在疾病生物標(biāo)志物的重要來(lái)源。目前可檢測(cè)到的尿液蛋白質(zhì)和多肽數(shù)量超過(guò)10萬(wàn)，且仍在增多［35］。在健康人中，70%的尿多肽/蛋白來(lái)自腎臟和尿路，其余30%的尿多肽/蛋白由腎小球血液超濾產(chǎn)生［36］，因此，尿液不僅能反映泌尿生殖系統(tǒng)的信息，還可能反映遠(yuǎn)處器官的信息。Iles等［37］運(yùn)用電子噴霧質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)，唐氏綜合征組尿液在11 000～12 000質(zhì)譜掃描范圍(m/z)存在一個(gè)額外質(zhì)譜峰，而6 000～8 000 m/z的質(zhì)譜強(qiáng)度降低。根據(jù)上述特點(diǎn)，可辨別妊娠12～14周8例唐氏綜合征樣本與39例正常樣本，但其對(duì)妊娠15～17周時(shí)唐氏綜合征樣本的辨別力較差，僅辨別出10個(gè)唐氏綜合征樣本中的7個(gè)?？梢?，應(yīng)用尿液樣本篩查唐氏綜合征的檢出率較高，假陽(yáng)性率較低。Shan等［38］用弱陽(yáng)離子交換磁珠對(duì)23例唐氏綜合征孕婦和30名核型正常孕婦的尿液進(jìn)行電子噴霧質(zhì)譜分析，兩組6種多肽的水平發(fā)生了顯著變化，其質(zhì)譜掃描范圍分別為1 022.1、1 032.1、1 099.5、1 155.9、1 306.6和2 365.6 m/z;以上述候選多肽為基礎(chǔ)，建立唐氏綜合征與對(duì)照組分類模型的靈敏度為95.7%，特異度為70.0%，受試者工作特征曲線下面積為0.909(95%CI 0.835～0.984)。1 099.5 m/z和1 155.9 m/z的多肽峰分別為α1抗胰蛋白酶和熱激蛋白β1的部分序列，為胎兒唐氏綜合征產(chǎn)前篩查無(wú)創(chuàng)性生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)提供了可能的方向。

3.5 胎盤特異性蛋白質(zhì)的篩選 胎盤是妊娠期間多種蛋白質(zhì)和細(xì)胞因子變化的來(lái)源，對(duì)于胎盤組織蛋白質(zhì)表達(dá)情況的研究既基礎(chǔ)又直觀，并可避免母體外周血細(xì)胞對(duì)研究結(jié)果的干擾。閆麗宇等［39］采用二維熒光差異凝膠電泳技術(shù)在10例唐氏綜合征孕婦胎盤組織中發(fā)現(xiàn)352個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白質(zhì)點(diǎn)為56個(gè)，對(duì)其三維豐度比值在1.5倍以上的17個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)行質(zhì)譜鑒定，其中12個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)上調(diào)，5個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)下調(diào);最終確定10種蛋白質(zhì)可匹配，其中差異表達(dá)最明顯的4種蛋白質(zhì)為銅鋅超氧化物歧化酶1、熱激蛋白27、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶29、過(guò)氧化物酶6。

4 小 結(jié)

基于質(zhì)譜和生物信息學(xué)技術(shù)，蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物的有力平臺(tái)。新的生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)有助于疾病診斷，并有望用于唐氏綜合征產(chǎn)前篩查和診斷。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)方法仍存在局限性，其所發(fā)現(xiàn)的候選標(biāo)記的性能在不同研究或?qū)嶒?yàn)室不能重現(xiàn)，且驗(yàn)證候選標(biāo)志物有效性的進(jìn)一步研究有限。未來(lái)仍需要通過(guò)建立生物樣本處理的標(biāo)準(zhǔn)化程序、利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)提高重復(fù)性、結(jié)合生物信息學(xué)分析選擇最佳的生物標(biāo)志物、擴(kuò)大臨床驗(yàn)證研究并加強(qiáng)多中心合作等方式對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用進(jìn)行深入研究。