孔淑貞，馮 敏，陳 剛

重慶工商大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院/重慶高校天然藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400067

γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyricacid，GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中非常重要的一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，GABA與受體結(jié)合后調(diào)節(jié)抑制性神經(jīng)傳遞[1-2]．在癲癇發(fā)作中，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)平衡被打破，使腦內(nèi)神經(jīng)元興奮性增加，從而導(dǎo)致放電頻率增加、幅度增高以及同步化放電，造成癲癇疾病的發(fā)生[3]．

崁烯氯噻嗪(Cyclothiazide，CTZ)不僅可以阻滯興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸AMPA受體的去敏感化作用[4-5]，而且也會對抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的釋放和受體表達(dá)有減少作用[6]，因此CTZ癲癇模型的雙機(jī)制特征使其優(yōu)于其他癲癇動物模型[7]．前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CTZ慢性癲癇模型中海馬結(jié)構(gòu)GABA能神經(jīng)元減少、GABA的合成酶GAD和轉(zhuǎn)運(yùn)酶GAT都有明顯減少[8]，但是對于海馬神經(jīng)元中GABA表達(dá)情況仍不清楚．本研究通過側(cè)腦室注射CTZ建立慢性癲癇動物模型，研究CTZ慢性癲癇大鼠海馬神經(jīng)元中GABA的表達(dá)情況，進(jìn)一步研究慢性自發(fā)性癲癇模型的發(fā)生發(fā)展機(jī)制．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

Sprague-Dawley大鼠，250～280 g，由騰鑫生物技術(shù)公司購入．標(biāo)準(zhǔn)動物房飼養(yǎng)，溫度23～26 ℃，12 h：12 h晝夜循環(huán)光照，自由飲食．適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)．

1.2 CTZ慢性癲癇大鼠模型建立

1.2.1 側(cè)腦室內(nèi)埋管

大鼠用3%戊巴比妥鈉麻醉后，剪掉頭皮和腦膜，雙氧水處理顱骨，以前囟為坐標(biāo)原點(diǎn)，在前囟后0.3 mm，中縫旁1.3 mm處鉆孔，將套管埋置進(jìn)左側(cè)腦室內(nèi)(深4.0 mm)，并用兩顆螺絲和牙托粉進(jìn)行固定．埋管后恢復(fù)1周進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)．

1.2.2 側(cè)腦室注射

恢復(fù)1周后進(jìn)行癲癇誘導(dǎo)及癲癇行為學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)．18只大鼠隨機(jī)分為兩組：CTZ癲癇模型組13只和二甲基亞砜(DMSO)對照組5只，分別通過微量注射器在側(cè)腦室內(nèi)注射CTZ和DMSO．大鼠置于鼠籠內(nèi)，自由活動，通過預(yù)埋置套管向側(cè)腦室內(nèi)注射CTZ(0.25 μmol，5 μL)，連續(xù)注射3 d，對照組大鼠側(cè)腦室內(nèi)連續(xù)3 d注射DMSO 5 μL．

1.2.3 癲癇行為觀察

在給藥后，每天給實(shí)驗(yàn)動物注射CTZ和DMSO后3 h觀察動物行為并記錄，按照Racine評分標(biāo)準(zhǔn)對癲癇發(fā)作程度將其行為分為0-V級：

0級：無任何異常行為，自然狀態(tài)；

Ⅰ級：咀嚼、眨眼、立須、耳動、流涎、面部抽搐；

Ⅱ級：點(diǎn)頭運(yùn)動、濕狗樣抖動、頸部抽搐；

Ⅲ級：單側(cè)肢體抽搐；

Ⅳ級：雙側(cè)肢體抽搐的同時伴隨出現(xiàn)站立、全身僵直；

Ⅴ級：在Ⅳ的基礎(chǔ)上失去平衡，出現(xiàn)摔倒、身體完全強(qiáng)直．

大鼠的癲癇行為評分達(dá)到了Ⅳ級及以上，可認(rèn)為是構(gòu)建癲癇模型成功[9]．成功的癲癇動物模型，進(jìn)一步通過錄像記錄實(shí)驗(yàn)動物注射CTZ或DMSO后6個月內(nèi)慢性癲癇行為的發(fā)作情況，其情況按照上述Racine評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行記錄分組．

1.3 組織學(xué)染色

在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有實(shí)驗(yàn)動物在3%戊巴比妥鈉麻醉后，4 ℃生理鹽水快速灌注沖出血液，4%多聚甲醛灌注進(jìn)行內(nèi)固定，之后斷頭取腦組織．4%多聚甲醛后固定24 h，梯度酒精脫水后，石蠟包埋，進(jìn)行石蠟切片，厚度為6 μm，每只大鼠間隔取4～6片進(jìn)行后續(xù)染色．

1.3.1 Nissl染色

切片進(jìn)入梯度酒精脫蠟后，蒸餾水潤洗5 min，0.1%硫瑾溶液染色10 min，蒸餾水快速潤洗幾秒鐘，95%鹽酸酒精分色2～10 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片．

1.3.2 免疫組化染色

二甲苯10 min，梯度酒精脫蠟，蒸餾水10 min，TBS緩沖液潤洗 5 min，3%雙氧水消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，0.125%的胰蛋白酶修復(fù)抗原活性，山羊血清封閉，加一抗anti-GABA(Abcam，濃度為1∶100)置4 ℃冰箱過夜．次日，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(SP-9001，北京中杉金橋生物技術(shù)公司)37 ℃水浴箱內(nèi)孵育1 h，最后DAB顯色．在每兩個過程中間均使用TBS緩沖液潤洗5 min，各3次．梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片．

1.3.3 圖片分析

每只大鼠取4～6片染色切片使用Nikon顯微鏡在200倍明場視野下拍照，對Nissl染色和免疫組化圖片中海馬CA1和CA3區(qū)中全部陽性神經(jīng)元進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和神經(jīng)元胞體染色進(jìn)行光密度分析，取每張切片平均值代表該大鼠海馬中陽性神經(jīng)元的分布情況．

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 CTZ癲癇模型建立

5只DMSO對照組大鼠只有洗臉等正常行為，無異常行為出現(xiàn)．13只CTZ癲癇模型組大鼠在注射CTZ后全部出現(xiàn)Ⅳ級及以上行為，癲癇模型建立成功．之后6個月觀察期中，10只大鼠出現(xiàn)自發(fā)性癲癇行為，其中6只達(dá)到Ⅳ級及以上行為．根據(jù)Racine分級法，大鼠的癲癇行為評分達(dá)到Ⅳ級及以上，可認(rèn)為是構(gòu)建癲癇模型成功[9]．因此在13只CTZ急性癲癇模型中，其中6只出現(xiàn)了Ⅳ級及以上癲癇行為的CTZ癲癇動物達(dá)到了慢性自發(fā)性癲癇模型標(biāo)準(zhǔn)，確定為慢性自發(fā)性癲癇動物模型，成功率為46%(圖1)．本文使用6只出現(xiàn)自發(fā)性癲癇行為發(fā)作的CTZ癲癇大鼠和5只DMSO對照組大鼠進(jìn)行后續(xù)組織學(xué)染色研究．

圖1 慢性期CTZ慢性癲癇動物模型成功率

2.2 CTZ慢性癲癇大鼠模型海馬中神經(jīng)元無明顯變化

Nissl染色是神經(jīng)元染色常用的一種方法，通過Nissl染色可以對神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及神經(jīng)元數(shù)目進(jìn)行檢測[10]．實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，海馬結(jié)構(gòu)中DMSO對照組和CTZ慢性癲癇模型組CA1和CA3區(qū)錐體神經(jīng)元被染成紫色(圖2)．兩組神經(jīng)元分布相似，CA1區(qū)錐體神經(jīng)元3到4排，CA3區(qū)錐體神經(jīng)元4到5排，排列整齊，僅少量神經(jīng)元結(jié)構(gòu)異常．對CA1區(qū)和CA3區(qū)Nissl染色神經(jīng)元進(jìn)行計數(shù)，DMSO對照組海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)目分別為331.04±29.38和169.73±7.21，CTZ慢性癲癇模型組海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)目分別為325.94±38.42和163.87±29.73，兩組神經(jīng)元數(shù)目差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)，CTZ慢性癲癇模型海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)并無明顯神經(jīng)元損傷和死亡．在既往研究中，KA致癇模型等模型動物海馬中會出現(xiàn)大量的神經(jīng)元凋亡[11，12]，但CTZ慢性癲癇模型盡管在慢性期出現(xiàn)了自發(fā)性癲癇發(fā)作，但海馬神經(jīng)元并未出現(xiàn)明顯的損傷和死亡，因此癲癇疾病發(fā)生機(jī)制不僅和神經(jīng)元損傷、死亡相關(guān)，還與其他機(jī)制有關(guān)．

圖2 CTZ慢性癲癇模型海馬Nissl染色

圖3 CTZ慢性癲癇模型海馬神經(jīng)元統(tǒng)計圖(Nissl染色)

2.3 CTZ慢性癲癇大鼠模型海馬神經(jīng)元中GABA減少

GABA能神經(jīng)元是海馬結(jié)構(gòu)中非常重要的抑制性神經(jīng)元，可以釋放抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元興奮性的發(fā)生．GABA釋放到突觸間隙后，與突觸后受體結(jié)合介導(dǎo)抑制性調(diào)節(jié)，因此海馬神經(jīng)元中GABA含量對于抑制性調(diào)節(jié)有著至關(guān)重要的作用[13]．圖4免疫組化染色顯示，DMSO對照組大鼠海馬CA1和CA3區(qū)GABA陽性神經(jīng)元被染成棕色，主要分布在海馬錐體細(xì)胞層，錐體細(xì)胞層各層中均有GABA陽性神經(jīng)元分布．棕色的GABA免疫陽性顆粒主要分布在錐體神經(jīng)元細(xì)胞漿中，說明在GABA能神經(jīng)元內(nèi)大量的GABA分泌儲存在胞漿中．在DMSO對照組大鼠海馬CA1和CA3區(qū)，GABA陽性染色除了分布在神經(jīng)元細(xì)胞漿中之外，分子層突起內(nèi)也有大量的GABA陽性染色，棕色染色的突起呈平行分布在分子層內(nèi)．CTZ慢性癲癇大鼠模型海馬CA1和CA3區(qū)也有大量GABA免疫陽性神經(jīng)元存在，GABA免疫陽性顆粒主要分布于神經(jīng)元的胞漿內(nèi)，但與DMSO對照組相比染色較淺，而且分子層內(nèi)突起無棕色GABA免疫陽性顆粒分布，說明CTZ慢性癲癇模型海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元胞漿和神經(jīng)元突起內(nèi)GABA含量下降．

圖4 CTZ慢性癲癇模型海馬GABA神經(jīng)元免疫組化染色

對海馬CA1和CA3區(qū)GABA免疫陽性染色進(jìn)行光密度分析(圖5)，結(jié)果顯示，DMSO對照組大鼠海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元胞體GABA免疫陽性光密度分別為661.40±17.65和625.07±7.39，說明在DMSO對照組大鼠海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元胞體內(nèi)有大量的GABA分布．對CTZ慢性癲癇模型大鼠海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元胞體進(jìn)行GABA免疫陽性光密度分析后結(jié)果分別為424.48±45.10和361.82±51.30，與DMSO對照組大鼠相比下降了35.82%和42.12%，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)．通過光密度分析可以看出，CTZ慢性癲癇模型中海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元胞體內(nèi)GABA含量急劇下降．

圖5 CTZ慢性癲癇模型海馬GABA神經(jīng)元免疫組化染色光密度統(tǒng)計圖

3 討論與結(jié)論

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)，共同調(diào)節(jié)大腦的興奮性傳遞等活動．一旦興奮性神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)功能增強(qiáng)或者抑制性神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)功能下降，都會引起平衡打破，大腦內(nèi)興奮性增強(qiáng)，引起癲癇的發(fā)生．在抑制性神經(jīng)元中，20%～30%的抑制性神經(jīng)元是GABA能神經(jīng)元[14]，其軸突末端可以通過谷氨酸脫羧酶將興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸脫羧形成抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA[15]．GABA釋放到突觸間隙后，突觸后受體結(jié)合增加突觸后神經(jīng)元Cl-的通透性誘發(fā)抑制性突觸后電位，或者與G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合介導(dǎo)抑制性神經(jīng)傳導(dǎo)作用[16]．因此，當(dāng)大腦內(nèi)GABA含量減少或者受體表達(dá)下調(diào)，都可能造成興奮性神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)占優(yōu)勢導(dǎo)致神經(jīng)元放電增加，引起癲癇發(fā)生．

本研究結(jié)果顯示，CTZ慢性癲癇模型組海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)Nissl染色神經(jīng)元與DMSO對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明CTZ慢性癲癇組神經(jīng)元并未出現(xiàn)明顯的損傷或死亡等情況，因此CTZ慢性癲癇模型組癲癇行為發(fā)生并非是由海馬內(nèi)神經(jīng)元損傷或神經(jīng)元丟失所致，很可能和神經(jīng)元釋放神經(jīng)遞質(zhì)及受體的改變有關(guān)．通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，CTZ慢性癲癇模型組大鼠海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元胞體和樹突內(nèi)GABA含量明顯下降，分別下降了35.82%和42.12%，因此會造成其介導(dǎo)的抑制功能大幅度下降，引起CTZ慢性癲癇模型慢性期明顯的癲癇行為反復(fù)性發(fā)作．

海馬神經(jīng)元中GABA的減少可能與谷氨酸脫羧酶含量或功能下降有關(guān)．谷氨酸脫羧酶將興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸脫羧形成抑制神經(jīng)遞質(zhì)GABA．谷氨酸脫羧酶含量減少或者功能下降，造成其脫羧過程效率降低，引起GABA合成減少．既往研究中發(fā)現(xiàn)，CTZ慢性癲癇模型中GAD陽性神經(jīng)元明顯減少，GAD含量降低[7]．由于海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)GAD含量減少，造成了CTZ慢性癲癇模型大鼠海馬內(nèi)神經(jīng)元GABA合成大幅度減少，與受體結(jié)合下降，造成突觸后抑制功能下降，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)功能占優(yōu)勢，海馬內(nèi)神經(jīng)元興奮性增加，造成慢性期CTZ慢性癲癇模型大鼠自發(fā)性、反復(fù)性癲癇行為發(fā)作．

本研究通過側(cè)腦室注射CTZ誘發(fā)癲癇行為發(fā)作，并觀察慢性期內(nèi)大鼠出現(xiàn)自發(fā)性癲癇行為發(fā)作，建立慢性癲癇動物模型．采用Nissl染色和免疫組化染色方法對海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)目和GABA表達(dá)情況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)CTZ慢性癲癇模型中GABA表達(dá)減少可能是造成自發(fā)性癲癇發(fā)作的重要原因之一．在治療癲癇的藥物研究中，有多種藥物是通過調(diào)節(jié)GABA遞質(zhì)系統(tǒng)的作用而發(fā)揮作用，如苯二氮卓類和巴比妥類藥物通過延長氯離子通道開放時間增強(qiáng)GABA的抑制作用[17]，地塞米松可以通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄增加GABA合成[18]，褪黑素對GABA有正向調(diào)節(jié)作用[19]，丙戊酸鈉通過GABA通路上調(diào)抑制性神經(jīng)元功能[20]，通過增加神經(jīng)元GABA合成或釋放，增加GABA與受體結(jié)合增強(qiáng)抑制性調(diào)節(jié)作用，減輕或阻止癲癇的發(fā)生，對癲癇疾病進(jìn)行治療．因此CTZ癲癇模型中GABA遞質(zhì)系統(tǒng)功能受損，尤其是GABA含量減少，對于促進(jìn)GABA合成和釋放藥物的開發(fā)為治療癲癇提供了重要的理論依據(jù)．