付 鵬余曉玲袁小淋*陳凌云

（1.云南中醫(yī)藥大學，云南 昆明 650500；2.云南省高校外用給藥系統(tǒng)與制劑技術研究重點實驗室，云南昆明 650500；3.昆明市中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650500）

上呼吸道感染是以咳嗽、咽痛、發(fā)熱等為主要癥狀，與細菌或病毒感染有關的疾?。?]，目前臨床大上多采用廣譜抗病毒藥物進行治療，但效果一般，并存在一定的不良反應［2]。復方臭靈丹合劑由臭靈丹、魚腥草、西青果、滇柴胡、桔梗5 味中藥組成，具有清熱解毒、祛痰止咳等功效，方中臭靈丹主要含洋艾素等黃酮類成分［3]，魚腥草中金絲桃苷具有抑菌等作用［4]，西青果主要含有的多酚具有抗炎、抗菌作用［5]，滇柴胡、桔梗有效成分也對細菌、病毒有抑制作用［6-7]。

控制復方臭靈丹合劑中主要活性成分的提取率是中藥制劑質量的關鍵步驟［8-11]，其變化與臨床療效密不可分［12]，同時多指標的綜合評價對最優(yōu)工藝參數(shù)有直接影響［13]。因此，本實驗將通過Box-Benhnken 響應面法結合信息熵對復方臭靈丹合劑中沒食子酸、金絲桃苷、槲皮素、異鼠李素、洋艾素、綠原酸提取工藝進行優(yōu)化，并以沒食子酸為內標，建立一種快速簡便的一測多評法來測定各成分含量［14-15]，以期為該方質量控制的標準化和現(xiàn)代研究提供科學依據(jù)。

1 材料

Agilent 1100 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；15-LC 高效液相色譜儀（日本島津公司）；AB265-S 電子分析天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；SK2200HP 超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（北京永光明醫(yī)療儀器廠）。

沒食子酸（批號110756-201512，純度≥98%）、綠原酸（批號110809-201205，純度≥98%）、金絲桃苷（批號111521-201204，純度≥93.9%）、槲皮素（批號112345-20190930，純度≥98%）、異鼠李素（批號110860-201611，純度≥99.8%）、洋艾素（批號111879-201102，純度≥97.2%）對照品（中國食品藥品檢定研究院）。復方臭靈丹合劑（昆明市中醫(yī)醫(yī)院）。乙腈、甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 HPLC 測定6 種成分含量

2.1.1 對照品溶液制備 取沒食子酸、金絲桃苷、槲皮素、異鼠李素、洋艾素、綠原酸對照品適量，甲醇溶解定容至刻度，即得（各成分質量濃度分別為408.5、300.7、152.0、20.1、70.5、604.0 μg/mL）。

2.1.2 供試品溶液制備 精密吸取復方臭靈丹合劑25 mL，在固定料液比下用固定體積分數(shù)甲醇超聲提取固定時間，水浴蒸干，甲醇定容至5 mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 DIKMA Diamonsil-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～8 min，2%～3%A；8～10 min，3%～10%A；10～20 min，10%～16%A；20～25 min，16%～18%A；25～30 min，18%～20%A；30～40 min，20%～39%A；40～60 min，39%～60%A；60～65 min，60%～65% A；65～72 min，65%～73%A）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長360 nm（金絲桃苷、槲皮素、異鼠李素、洋艾素）、325 nm（綠原酸）、270 nm（沒食子酸）；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.4 線性關系考察 吸取“2.1.1”項下對照品溶液，逐步稀釋，在“2.1.3”項色譜條件下各進樣10 μL 測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.1.5 精密度試驗 精密吸取“2.1.1”對照品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定6 次，測得沒食子酸、金絲桃苷、槲皮素、異鼠李素、洋艾素、綠原酸峰面積RSD 分別為0.33%、0.41%、0.37%、0.66%、0.14%、0.54%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、金絲桃苷、槲皮素、異鼠李素、洋艾素、綠原酸峰面積RSD 分別為1.19%、1.45%、1.77%、1.41%、0.79%、1.02%，表明溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復性試驗 取同一批合劑，按“2.1.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、金絲桃苷、槲皮素、異鼠李素、洋艾素、綠原酸峰面積RSD 分 別 為 0.52%、0.47%、1.26%、1.25%、1.06%、1.26%，表明該方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的同一批合劑，精密加入等量對照品溶液，按“2.1.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，沒食子酸、金絲桃苷、槲皮素、異鼠李素、洋艾素、綠原酸平均加樣回收率分別為101.42%、10.2.23%、101.12%、99.58%、101.21%、102.33%，RSD 分別為0.23%、1.77%、1.68%、1.51%、1.27%、1.51%。

2.2 單因素試驗 參考文獻［16-17] 報道，固定提取時間10 min、甲醇體積分數(shù)50%，考察料液比（1∶4、1∶6、1∶8、1∶10）對提取工藝的影響，再依次考察不同提取時間（10、15、30、45 min）、甲醇體積分數(shù)（50%、60%、80%、100%）。結果，最優(yōu)提取工藝為料液比1∶8，提取時間30 min，甲醇體積分數(shù)80%。

2.3 Box-Behnken 響應面法 以料液比（A）、提取時間（B）、甲醇體積分數(shù)（C）為影響因素，沒食子酸、金絲桃苷、槲皮素、異鼠李素、洋艾素、綠原酸含量的綜合評分為評價指標，Box-Behnken響應面法優(yōu)化提取工藝，因素水平見表2，結果見表3。

表2 因素水平Tab.2 Factors and levels

表3 試驗設計與結果Tab.3 Design and results of tests

以沒食子酸、金絲桃苷、槲皮素、異鼠李素、洋艾素、綠原酸含量為評價指標，用公式Pij=對表3 數(shù)據(jù)進行處理，建立概率矩陣（Pij）mn，再分別用公式計算各指標信息熵Hij=［0.999 1，0.987 5，0.995 9，0.992 6，0.993 1，0.997 5]、權重系數(shù)Wi=［2.52%，36.68%，11.84%，21.54%，20.20%，7.22%]，最后計算綜合評分M，公式為M=（沒食子酸含量/最大值）×W1+（金絲桃苷含量/最大值）×W2+（槲皮素含量/最大值）×W3+（異鼠李素含量/最大值）×W4+（洋艾素含量/最大值）×W5+（綠原酸含量/最大值）×W6。

通過Design-Expert 8.0.6 軟件對表3 數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合分析，得方程為M=92.19+4.56A+3.74B+4.90C+3.96AB+6.87AC+5.79BC-8.50A2-17.80B2-8.42C2（R2=0.954 0），方差分析見表4，可知模型P＜0.05，失擬項P=0.709 8＞0.05，表明模型有效；因素A、C、AC、BC、A2、B2、C2對綜合評分有明顯影響（P＜0.05），響應面分析見圖2。最終確定，最優(yōu)提取工藝為料液比1∶9，提取時間34 min，甲醇體積分數(shù)92%，綜合評分為95.54 分。

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

圖2 各因素響應面圖Fig.2 Response surface plots for various factors

按優(yōu)化工藝進行3 批驗證實驗，結果見表5，可知該工藝穩(wěn)定可行。

表5 驗證試驗結果（n=3）Tab.5 Results of verification tests（n=3）

2.4 一測多評法測定6 種成分含量

2.4.1 相對校正因子計算 由于沒食子酸含量較高、色譜峰穩(wěn)定，故選擇其作為內標，計算其他5種成分的相對校正因子f，計算公式為f=fk/fs=（CkAs）/（CsAk），其中Ck為其他成分含量，Ak為其他成分峰面積，Cs為內標含量，As為內標峰面積，結果見表6。

表6 各成分相對校正因子Tab.6 Relative correction factors of various constituents

2.4.2 耐用性考察

2.4.2.1 儀器、色譜柱 本實驗考察了Agilent 1100、島津15LC 色譜儀，以及Agilent XDB-C18、DIKMA Diamonsil-C18、OMNI Zinger-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）對相對校正因子的影響，結果見表7，可知均無明顯影響（RSD＜5%）。

表7 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響Tab.7 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.4.2.2 柱溫 固定其他色譜條件不變，本實驗考察了柱溫20、25、30、35、40、45 ℃對相對校正因子的影響，結果見表8，可知均無明顯影響（RSD＜5%）。

表8 不同柱溫對相對校正因子的影響Tab.8 Effects of different column temperatures on relative correction factors

2.4.2.3 體積流量 固定其他色譜條件不變，本實驗考察了體積流量0.5、0.7、0.8、1.0、1.1、1.2 mL/min 對相對校正因子的影響，結果見表9，可知均無明顯影響（RSD＜5%）。

表9 不同體積流量對相對校正因子的影響Tab.9 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

2.4.3 色譜峰定位 采用相對保留時間法，分別考察內標、其他成分在不同儀器、色譜柱、柱溫、體積流量下的相對保留時間，發(fā)現(xiàn)均無明顯差異（RSD＜5.0%）。

2.4.4 樣品含量測定 取10 批合劑，分別采用一測多評法、外標法計算各成分含量，結果見表10，可知2 種方法無明顯差異（RSD＜5.0%）。

表10 各成分含量測定結果（%，n=3）Tab.10 Results of content determination of various constituents（%，n=3）

3 討論

本實驗首次采用Box-Benhnken 響應面法結合信息熵對復方臭靈丹合劑中6 種成分提取工藝進行優(yōu)化，有利于兼顧各指標之間的協(xié)同效應，符合中藥復方多成分、多靶點的特點及中醫(yī)用藥的整體觀。然后通過信息熵來評價各指標權重系數(shù)，在保持其穩(wěn)定性的同時可更好地區(qū)分數(shù)據(jù)信息，進而篩選出最佳工藝，提高了實驗結果的嚴謹性和科學性。

沒食子酸、綠原酸分別在270、325 nm 波長處有最大吸收，而金絲桃苷、槲皮素、異鼠李素、洋艾素在360 nm 波長處有最大吸收。本實驗比較了上述3 個波長處的色譜圖，發(fā)現(xiàn)270 nm 下只能檢測到?jīng)]食子酸，325 nm 下只能檢測到綠原酸，360 nm下只能檢測到金絲桃苷、槲皮素、異鼠李素、洋艾素，故最終采用多波長同時掃描。

一測多評法依據(jù)中藥有效成分之間存在某些內在關系的特性，只需測定某一內標即可計算其他成分含量［18]。由于沒食子酸化學性質穩(wěn)定，含量高，價格低廉，相對校正因子穩(wěn)定，故本實驗選擇其作為內標來準確測定其他成分含量，體現(xiàn)了一測多評法的特點。