姜東，樊東升，王繼宏

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院手足顯微II科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030)

0 引言

拇外翻(hallux valgus，HV)，通常被稱為大腳骨。據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計拇外翻是足部患病率較高的疾病之一，1950年Hardy和Clapham等學(xué)者在拇外翻的隊列研究中發(fā)現(xiàn)拇外翻具有遺傳傾向[1]。隨后美國哈佛大學(xué)Marian T.Hannan教授也證實，拇外翻具有高度的遺傳性，并強調(diào)繼續(xù)探究引起拇外翻畸形的遺傳易感性對于拇外翻防治的重要性[2]。近來Yi-Hsiang Hsu等學(xué)者用全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法來分析和鑒定拇外翻常見的基因變異位點，研究結(jié)果顯示軸抑制蛋白2(Axis Inhibitory protein 2，AXIN2)基因的rs9675316位點變異會增加美國白種男性患拇外翻的風(fēng)險，脂酶D(Esterase D，ESD)基因的rs7996797位點變異會增加美國白種女性患拇外翻的風(fēng)險和馬斯GPR家族3(MAS related GPR family member X3，MRGPRX3)基因的rs1563374位點變異會減低美國白種女性患拇外翻的風(fēng)險，但會增加美國白種男性患拇外翻的風(fēng)險[3]。

在研究其它一些疾病的遺傳易感性關(guān)聯(lián)分析后，我們發(fā)現(xiàn)在不同地域的人群中，基因的變異位點在疾病發(fā)生發(fā)展的過程中所起的作用程度不甚相同，甚至作用相反[3]。不同人群中出現(xiàn)的差異多研究證實為單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)。我們的研究在參考國內(nèi)外類似研究的基礎(chǔ)上，隨機選取一些SNPs在中國呼和浩特市人群中進(jìn)行相應(yīng)的實驗論證。建立地區(qū)拇外翻SNPs數(shù)據(jù)庫。為地區(qū)性拇外翻畸形提供確切的預(yù)防方法及治療手段。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

在2014年10月至2016年12月間從內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院手足顯微外科和內(nèi)蒙古天瑞體檢中心招募各項客觀條件滿足我們納入標(biāo)準(zhǔn)的拇外翻患者113名及271名健康對照人群。在詳細(xì)與研究對象講解我們的實驗?zāi)康暮?，在口頭同意的前提下，抽取每位志愿者5mL外周靜脈血置于紫色美國BD公司的EDTA抗凝管中，冷凍于海爾-80攝氏度冰箱。

1.2 實驗主要試劑及儀器

全血基因組DNA提取試劑盒(西安金磁納米生物技術(shù)有限公司)：微磁粒，絲氨酸蛋白酶溶液，紅細(xì)胞裂解液，白細(xì)胞裂解液，結(jié)合液BC，洗脫液ES，清洗液(BW-I，BW-II)。iPLEX? Gold試劑盒(美國Sequenom股份有限公司)：色譜純水，PCR 緩沖液(10×)，氯化鎂(25mM)，Hotstar Taq(5U/ul)，SAP緩 沖 液(10×)，SAP酶(1.7U/ul)，dNTP mix(25mM)，iPLEX 緩 沖 液(10×)，iPLEX酶，Termination mix，SpectroCLEAN樹脂。

1.3 DNA提取

將事先整理好的血液樣本從-80℃冰箱中取出，在常溫下解凍后(若解凍后血液中有凝塊需用漩渦混勻儀震蕩混勻)移入50mL離心管中，遵循西安金磁公司全血DNA純化試劑盒說明書提取全血白細(xì)胞DNA。

1.4 引物設(shè)計與定制

我們選用Sequenom MassARRY Assay Design 3.0軟件對我們篩選的拇外翻SNPs進(jìn)行引物及單堿基延伸引物設(shè)計。將設(shè)計好的延伸和擴增的引物序列送至上海華大基因科技有限公司進(jìn)行合成。

1.5 PCR反應(yīng)實驗

將未經(jīng)任何污染的96孔板按照實際樣本數(shù)量編號。為滿足每一個樣本的體積和終密度相同，通過公式Ca×Va=Cb×Vb計算出單個樣本應(yīng)提取的體積。

將1.8μL進(jìn) 口 水、0.4μL氯 化 鎂、1μL Primer Mix、0.5μL 10×PCR緩沖液、0.1μL dNTP Mix及0.2μL Hotstar Taq酶混勻，制備成PCR Mix。以 4μLPCR Mix和1μLDNA為一個孔單位，依次加入384孔板，置孔板于PCR儀中。

1.6 SAP純化反應(yīng)

將1.53μL進(jìn) 口 水、0.3μL SAP酶、0.17μL SAP緩 沖 液制備成SAP Mix后在漩渦混勻儀上混勻5sec，置離心機5000rpm，10sec，向PCR擴增反應(yīng)后的孔板每個孔加入2μL。完成上述實驗過程后，置孔板于PCR儀中。

1.7 單堿基引物延伸反應(yīng)

將0.619μL進(jìn) 口 水、0.2μL Termination Mix、0.041μL iPLEX酶、0.2μL iPLEX混合液(10)、0.94μL UEP Mix混勻后向孔板中每個孔加入2μL。完成上述實驗過程后，置孔板于PCR儀中。

1.8 樹脂純化、點樣及質(zhì)譜分析

將384孔板每個空中加入純凈水16μL和樹脂6mg混勻，置入離心機(4000rpm，5min)。此步反應(yīng)的目的是去除反應(yīng)體系中的陽性離子。用點樣儀將樹脂純化后的產(chǎn)物(25nl)點到基因芯片上(具體操作遵循操作說明)我們選用Sequenom MassARRAY RS1000 Software[3]，對完成上述操作的基因芯片進(jìn)行SNP分型。質(zhì)譜儀我們選用美國Sequenom 公司生產(chǎn)產(chǎn)品。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

我們篩選的SNPs要在健康的對照組中檢測其是否滿足HWE，即PHWE要大于5%。Microsoft Office Excel 2010 Software和SPSS 12.0被用于Chi-square 檢驗和 Fisher精確檢驗[4]。拇外翻的病例組和健康對照組的基因型和等位基因分布差異用Pχ2和PFisher衡量。所有獲得的P值均為雙側(cè)，P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。我們會在顯性模型，隱性模型及加性模型下用比值比(Odds Ratios，OR)和95%可信區(qū)間(Confidence Intervals，CI)評估每一個SNP和拇外翻的患病風(fēng)險。年齡和性別信息被用來進(jìn)行校正[5]。

2 結(jié)果

2.1 樣本的臨床資料

我們共收集的113名拇外翻患者的血樣和271名健康對照人群的血樣。拇外翻組的平均年齡是48.7歲，健康對照組的平均年齡是49.3歲，兩組經(jīng)過Chi-square檢驗，P值小于0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異。病例組中有男性13名，女性100名，對照組中有男性98名，女性173名，經(jīng)過Chi-square 檢驗，P值小于0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異。詳細(xì)信息見表1。

表1 拇外翻病人和對照的基本信息

2.2 Chi-square分析結(jié)果

我們共選擇了21個SNP基因分型，其中rs28628238和rs1563374的基因型單一，故這兩個位點的運算結(jié)果都沒有意義。位于ESD基因上的rs7996797在等位基因的模型下與我們的對照組存在差異P＜0.05。在等位基因模型下13號染色體上的rs7996797的最小等位基因“G”，OR=1.36，95%CI=1.03-1.94，P=0.04，如表2顯示了我們篩選的21個SNPs基本信息。

表2 候選基因位點的基本信息

2.3 邏輯回歸分型結(jié)果

我們所測得數(shù)據(jù)經(jīng)邏輯回歸分析，并用性別和年齡校正后發(fā)現(xiàn)，在AIC和BIC最小值時，ESD基因rs1923880在隱性模型下能增加拇外翻發(fā)病的風(fēng)險(OR=2.08，95%CI=1.05-4.11，P=0.038)，AXIN2基因rs9915936在隱性模型下能增加拇外翻發(fā)病的風(fēng)險(OR=3.28，95%CI=1.06-10.19，P=0.038)，見表3、4。

表3 1rs1923880位點與拇外翻風(fēng)險的相關(guān)關(guān)系

3 討論

AXIN2基因位于17號染色體，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道該基因能抑制細(xì)胞增殖和抑制成骨細(xì)胞的分化，進(jìn)而干擾骨組織的正常代謝。AXIN2基因編碼的主骨架蛋白在Wnt/β-catenin信號通路和TGF-β信號通路參與骨骼的發(fā)育[3]，在Wnt信號缺失時，AXIN2會結(jié)合GSK-3β和β-連環(huán)蛋白，促進(jìn)在GSK-3β介導(dǎo)下的β-連環(huán)蛋白磷酸化，誘導(dǎo)蛋白的泛素化和蛋白酶體的降解[4]。當(dāng)β-連環(huán)蛋白磷酸化時，AXIN2蛋白就會保持穩(wěn)定。當(dāng) Wnt信號存在時，AXIN2會與LRP5/LRP6結(jié)合后去磷酸化。包含AXIN2在內(nèi)形成的蛋白復(fù)合物是不穩(wěn)定的，因此當(dāng)β-連環(huán)蛋白積累到一定數(shù)量后被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，通過TCF和LEF轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄[3]。Debbie Y.Dao等學(xué)者在敲除掉 AXIN2基因的小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，AXIN2基因在小鼠骨骼發(fā)育過程中扮演著十分重要的角色[5-8]。美國紐約羅切斯特大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)者Ying Yan和他的團隊在研究成年鼠的Wnt-β-連環(huán)蛋白信號時發(fā)現(xiàn)AXIN2在成年小鼠骨骼重建的過程中起著非常關(guān)鍵的負(fù)調(diào)節(jié)作用，而且還能通過調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白-BMP2/4-Osx信號通路參與成骨細(xì)胞分化[9]。在2016年美國斯坦福大學(xué)的Ransom教授也在研究中發(fā)現(xiàn)小鼠骨骼受損后AXIN2-Wnt-β-連環(huán)蛋白通路會被激活，參與骨骼的修復(fù)與重建[6]。我們實驗結(jié)果也證實AXIN2基因的突變會增加拇外翻的患病風(fēng)險，這與Yi-Hsiang Hsu學(xué)者研究的結(jié)果一致[3]。rs9915936位于基因的編碼區(qū)，該位點的突變影響蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，以至于最終影響AXIN2蛋白質(zhì)的功能，進(jìn)而使Wnt/β-catenin信號通路發(fā)生紊亂，導(dǎo)致骨組織代謝的失調(diào)，誘發(fā)拇外翻的形成。目前，具體的病理機制和過程還需要我們進(jìn)一步研究。

表4 rs9915936位點與拇外翻風(fēng)險的相關(guān)關(guān)系

ESD基因編碼一種絲氨酸水解酶，參與唾液酸的回收與利用[11]。但增加血清唾液酸水平會引起原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎患者抗氧化水平降低[12]。研究證實拇外翻與ESD基因有關(guān)聯(lián)，拇外翻的形成與原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎所引起的第一跖趾關(guān)節(jié)功能異常有關(guān)，所以由ESD基因相關(guān)的拇外翻形成的機制可能與原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎相似[3]。rs1923880位于ESD基因的內(nèi)區(qū)，該位點的A到G的變異增加了拇外翻的發(fā)病風(fēng)險，其原因可能是在遺傳信息轉(zhuǎn)錄后在剪切的過程受到影響，進(jìn)而使ESD基因表達(dá)異常。我們的實驗結(jié)果和美國的Josephine Hoh教授的GWAS結(jié)果相同，進(jìn)一步證明rs1923880位點的變異與拇外翻風(fēng)險的相關(guān)性[13,14]。

雖然我們在MRGPRX3基因、AXIN1基因和BBS9基因所篩選的SNPs沒有顯示出與拇外翻的關(guān)聯(lián)性，但是由于我們的實驗樣本的限制，并不能證明它們之間就沒有相關(guān)性。

MRGPRX3蛋白是MAS相關(guān)/ G蛋白偶聯(lián)受體的感覺神經(jīng)元特異性亞家族，當(dāng)前人們對MRGPRX3基因研究甚少，在2005年該基因被日本Kaisho教授首次報道，證明該基因的過表達(dá)將導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生白內(nèi)障和皮膚病[15]。最新的研究表明該基因編碼的蛋白可能參與了感覺神經(jīng)元的調(diào)節(jié)和痛覺和/或瘙癢的調(diào)節(jié)[3]，以及該基因某個位點的變異將會導(dǎo)致拇外翻的發(fā)生[16]。目前該基因的功能上不完全清楚，僅僅根據(jù)Yi-Hsiang Hsu學(xué)者的研究，猜測該基因可能與骨骼代謝有關(guān)。

AXIN1蛋白也叫膜聯(lián)蛋白I，屬于Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，是合成有效的炎性介質(zhì)、前列腺素及白三烯所必須的蛋白之一，AXIN1蛋白可能有潛在的抗炎活性。炎癥眾所周知的與原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)[17]。Yi-Hsiang Hsu學(xué)者也證實AXIN1基因的中的SNPs會增加女性患拇外翻的風(fēng)險[3]。其與AXIN2基因共同參與Wnt/β-catenin信號通路和TGF-β信號通路，影響拇外翻發(fā)生和發(fā)展的過程相類似。

BBS9基因位于7號基因編碼鏈上長度約為476.82kb，從33168857到33645680，根據(jù)目前Pubmed所有關(guān)于BBS6基因研究成果顯示，成骨細(xì)胞中的甲狀旁腺激素會下調(diào)該基因的表達(dá)，因此被認(rèn)為其參與甲狀旁腺激素在骨骼中的代謝，但目前該基因功能尚未確定(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research)。根據(jù)美國國家人類基因研究所的GWAS研究顯示，BBS9基因的易感位點和新生兒的顱骨矢狀縫閉合時間具有密切的相關(guān)性，這表明BBS9基因可能在骨骼發(fā)育中發(fā)揮重要的作用[18]。另外BBS9基因?qū)τ谀赐夥挠绊懣赡芘c足部骨骼和周圍的軟組織受到的長期復(fù)雜的過程有關(guān)[3]。

我們的實驗采用的候選基因的策略，共篩選了21個SNPs在中國呼和浩特漢族人群中進(jìn)行驗證，探究了不同人群相關(guān)SNPs與拇外翻易感人群上的差異。通過我們的實驗研究，可以得到以下結(jié)論：

(1)ESD基因和AXIN2基因可能與呼和浩特人群拇外翻的發(fā)病風(fēng)險有關(guān)。

(2)ESD基因中的單體型“G”比野生單體型增加拇外翻的風(fēng)險。