光合作用放氧反應＊

2021-06-25 08:40張純喜

自然雜志 2021年3期

張純喜

中國科學院化學研究所光化學實驗室，北京 100190

光合作用放氧反應是植物光系統(tǒng)II(PSII)的特有功能，它是地球上最重要的能量和物質轉換過程之一[1-4]。通過光合放氧反應，植物源源不斷地從水中獲取電子、質子，同時釋放出氧氣。對光合放氧反應微觀本質的研究不僅具有重要的科學意義，同時也對探索人工高效利用太陽能，解決人類面臨的能源危機、環(huán)境污染和溫室效應問題具有潛在的應用價值[5-6]。

1 光系統(tǒng)II結構和光能轉換

光合放氧的自然現象早在250年前就被英國科學家發(fā)現，經過生物學家、化學家和物理學家的長期努力，目前人們對光合放氧的認識已經從宏觀進入到微觀分子-原子層次[7-8]。在21世紀初，得益于使用嗜熱藍藻的PSII生物樣品，人們在PSII放氧復合體的晶體學方面取得了突破[9-13]。2001年Zouni等人[9]首次報道了從嗜熱藍藻中分離的PSII放氧復合體的3.8 ?分辨率的晶體結構；2004年Ferreira等人[10]報道了3.5 ?分辨率的PSII晶體結構，解析出PSII中大部分蛋白和色素分子的空間結構，并辨別出光合作用放氧中心(OEC)是一個Mn4CaO4簇合物。2011年Umena等人[11]報道了1.9 ?高分辨率的PSII晶體結構(圖1(a))，首次揭示出OEC的詳細結構，該工作是半個世紀以來光合放氧研究領域中最重要的進展。

PSII通常以二聚體形式存在，每個單體擁有20多個蛋白質亞基(如D1、D2、CP43、CP47、PsbO等)，其整體結構如圖1(a)所示[11,14]。PSII核心含有4個葉綠素分子、2個去鎂葉綠素分子、2個質體醌分子(QA、QB)、1個非血紅素Fe離子(與4個組氨酸的咪唑環(huán)和1個HCO3-/CO32-配位)，它們排布成近似左右對稱的兩條電子轉移鏈(圖1(b))。PSII核心色素分子被光激發(fā)后，發(fā)生原初電荷分離，產生正離子自由基(P680＋?)和負離子自由基 (Pheo-?)[15-16]。其中：Pheo-?具有很強的還原性(還原電位為－0.42 V)，它推動受體側非血紅素Fe催化質體醌QB的還原反應；P680＋?具有很高的氧化性(氧化電位可達+1.25 V)，它驅動放氧中心(OEC)催化水氧化反應[2]。

圖1 PSII整體結構(a)和核心輔基空間排布(b)

TyrZ和QA是PSII中擔負調控快速原初光化學反應(單電子反應)和緩慢催化反應(包括給體側四電子、四質子的水催化氧化反應和受體側兩電子、兩質子的醌催化還原反應)的兩個關鍵樞紐[17-18]。前期我們借助于液氦溫度電子順磁共振(EPR)技術，通過原位誘導、原位探測的方法在具有放氧活性的PSII樣品中同時成功探測到TyrZ和QA中間體(TyrZ?和QA-?)EPR信號[19-21](圖2)，并提出它們通過兩種氫鍵調控光系統(tǒng)II兩側電子轉移和催化反應的機理模型[6,18,22](圖3)。

圖2 活性PSII中 TyrZ?和QA-?的EPR信號

如圖3所示，給體側(左側)TyrZ與His190之間氫鍵強度經歷“強→弱→強”變化[22]，受體側(右側)QA與His214之間氫鍵強度經歷“弱→強→弱”變化[23]。由于強氫鍵向弱氫鍵轉變過程中可產生10～20 kcal/mol的能量變化[24-25]，這種氫鍵強度的可逆變化可以有效穩(wěn)定高活性電子轉移中間體。PSII兩側的氫鍵強度可逆變化能保證電子源源不斷地從給體側向受體側傳遞，避免電子逆向傳遞，從而防止電荷復合的發(fā)生，維持PSII高效的光能轉換[6]。

圖3 PSII中氫鍵調控光反應和催化反應的機理模型

2 光合作用放氧催化中心

OEC是PSII最關鍵的組分，它也是自然界唯一能高效、安全地將水裂解，釋放出電子、質子和氧氣的生物催化劑[14,26-27]。OEC結構和催化原理一直是光合作用領域最受關注的研究熱點和難點。早在40多年前人們就知道OEC的核心由4個Mn離子和1個Ca離子組成[28-29]。20世紀末，人們依據EPR、EXAFS(擴展X射線吸收精細結構)等光譜測定和理論計算提出了多種OEC的結構模型[30-33]。1999年我們團隊提出了如圖4(a)所示的OEC結構模型[34]，首次提出關鍵輔基Ca離子位于OEC的中心，它通過3個氧橋(μ-O)、2個羧基與4個Mn離子結合。

圖4 OEC的結構模型(a)和晶體結構示意圖(b)

2011年Umena等人[11]報道了1.9 ?分辨率的PSII晶體結構，首次揭示出OEC核心骨架及其配體環(huán)境的詳細結構信息(圖4(b))。OEC的核心骨架中4個Mn離子和1個Ca離子通過5個μ-O連接成1個不對稱的Mn4CaO5簇。OEC的外圍配體由6個羧基、1個咪唑環(huán)和4個水分子提供。在此結構中，Ca離子通過3個μ-O橋、2個羧基與4個Mn離子結合，這一結構特征證實了我們1999年提出的OEC結構模型[34]。

OEC在催化放氧過程中經歷5種不同的狀態(tài)(S0、S1、S2、S3、S4態(tài))[26,35-36](圖5)。其中：S0態(tài)是起始態(tài)；S1態(tài)是黑暗穩(wěn)定態(tài)；S2和S3態(tài)為高氧化態(tài)；S4態(tài)是一個瞬態(tài)，它能夠結合水分子并很快釋放氧氣恢復到S0態(tài)。在此催化循環(huán)過程中，伴隨著電子、質子的轉移和釋放，4個Mn離子的價態(tài)和OEC自身空間結構都會發(fā)生變化。OEC中4個Mn離子的價態(tài)[26,37]分別是S0(＋3、＋3、＋3、＋4)或(＋2、＋3、＋4、＋4)、S1(＋3、＋3、＋4、＋4)、S2(＋3、＋4、＋4、＋4)、S3(＋4、＋4、＋4、＋4)。由于在實驗中難以捕捉S4，目前S4態(tài)中錳離子的價態(tài)仍然未知。圖4(b)給出的是S1態(tài)OEC的結構。近幾年，S0、S2、S3態(tài)的OEC結構也陸續(xù)有報道[38-41]，但實際測試樣品中混有多種不同狀態(tài)的OEC，導致結構分析和指認困難，同時在結構測試過程中X射線對OEC結構有破壞作用，導致這些結構仍然存在不確定性[8,42-43]。最近人們依據S1態(tài)OEC的結構和理論計算提出了多種光合放氧機理模型[7,38,44-50]，但尚無一種被廣泛認可[8]。目前光合放氧機理方面有許多重要的科學問題仍有待研究。例如：①O-O鍵如何形成？②Ca離子如何發(fā)揮作用？③底物水分子的結合位點在哪？④OEC的構型如何變化？對于這些問題的回答將是今后光合放氧研究的重點。

圖5 OEC催化放氧反應過程中錳離子的價態(tài)變化及電子、質子釋放示意圖

3 光合放氧中心的生物合成

OEC的催化功能與其自身特殊結構密切相關，也與PSII的蛋白環(huán)境密切相關。在PSII中，OEC主要結合在D1蛋白亞基上。大量研究顯示，在日照條件下D1蛋白會發(fā)生光破壞而喪失功能，而光合生物為維持有效安全的光能利用，受到破壞的D1蛋白會不斷地被新合成的D1蛋白所替代[51-53]。通常在日照條件下D1蛋白的壽命只有約30 min[54]。伴隨著舊的D1蛋白降解和新的D1蛋白重組，OEC也經歷著降解和再合成[51](圖6)。PSII的外周蛋白(藍藻中為PsbO、PsbV、PsbU；高等植物及真核藻類為PsbO、PsbQ、PsbP)在穩(wěn)定OEC方面發(fā)揮重要作用[55]。特別是PsbO蛋白，其解離會使OEC暴露于水相環(huán)境，導致OEC很快解離成游離Ca2+和Mn2+。光系統(tǒng)II核心蛋白和OEC的降解和修復過程如圖6所示。

圖6 PSII核心蛋白和OEC的降解與組裝原理圖

因為OEC的組裝需要光的參與，所以OEC的組裝過程又被稱為光組裝(photo-assemble)或光活化(photo-activation)過程[56]。OEC能進行組裝的前提條件是PSII蛋白框架(主要包括D1、D2、CP43、CP47、Cytb559、PsbO等)能夠提供一個可接納OEC的微環(huán)境 (如圖7所示)。得益于分子生物學[57-58]和不同PSII樣品(包括具有放氧活性的PSII、OEC缺失的PSII、OEC組裝前PSII樣品)的結構解析[11,59-61]，人們發(fā)現OEC的微環(huán)境存在6～7個羧基、2～3個咪唑環(huán)殘基和水分子，呈弱酸性(pH為5～6)。組裝前的PSII被稱為Apo-PSII。Apo-PSII結合游離Mn2+和Ca2+，在光驅動下，Mn2+被逐步氧化為高價錳離子(Mn3+/Mn4+)，最終形成Mn4CaO5簇合物。由于難以獲得OEC組裝中間體的確切結構信息，目前人們對OEC組裝機理的認識還非常有限，遠未達到在分子-原子層次闡明OEC的組裝規(guī)律[54,62-63]。此外，需要說明的是，通常OEC的組裝研究都是在體外進行，而體外組裝所得PSII放氧活性均顯著低于正常生理條件下PSII的放氧活性[62]，因此體外OEC組裝實驗能否準確反映光合生物體內OEC的組裝規(guī)律仍然是個懸而未決的問題。

圖7 光合生物中OEC所處的蛋白微環(huán)境

在生理條件下，OEC的降解和組裝時刻都在發(fā)生，因此OEC核心骨架和配體環(huán)境除了要滿足高效、安全地催化水氧化的功能外，還必須滿足OEC降解和組裝兩個過程都能有效和安全地進行。這就要求OEC自身的結構不能太穩(wěn)定，否則無法有效降解；同時OEC的合成條件不能太苛刻，過程不能太復雜，否則無法快速合成。由此可見，在探討OEC各組分的結構和功能關系時，不僅要考慮它們在水氧化過程中的作用，同時也需要考慮其在OEC降解和組裝過程中所發(fā)揮的作用。

4 光合放氧中心的人工合成

人工合成光合作用OEC，以取之不竭的太陽能驅動水裂解來獲取清潔能源(氫能或電能)，被認為是解決人類社會面臨的能源危機、環(huán)境污染和溫室效應問題的理想途徑。這方面的研究具有重要的科學意義和應用價值，同時也是廣受關注的重要科學前沿[3,5,14,64]。

光合作用OEC的空間結構解析為人工合成OEC提供了重要的依據，但如何實現OEC的人工合成卻是一個極具挑戰(zhàn)性的科學難題，有一系列合成問題需要解決[65-66]。例如：①如何將Ca2+鑲嵌在Mn簇中？②如何模擬生物配體環(huán)境？③如何合成不對稱Mn4CaO5核心骨架？④如何穩(wěn)定高氧化性的催化中心？

自20世紀末以來，國際上很多研究小組嘗試人工合成OEC，并報道了大量含錳簇合物[67-72]。2015年之前人們基本上都局限在對OEC的局部結構特征進行模擬，如何實現對OEC整體結構的模擬則是一個巨大的挑戰(zhàn)[65]。我們團隊基于對生物OEC的結構和催化機理的長期研究，2014年以來開展了一系列OEC的仿生模擬研究[73-76]，并先后解決了Ca/Sr離子難與Mn簇結合和難以在高價Mn簇中引入生物配體的合成難題。2015年受生物OEC組裝的啟示，我們首次成功合成出不對稱的仿生Mn4CaO4簇合物[77](圖8)。

圖8 OEC(左)和仿生OEC(右)的結構比較[77]

在仿生Mn4CaO4簇合物中，4個Mn離子和1個Ca離子通過4個μ-O橋構成1個不對稱的Mn4CaO4核心骨架，其外圍由8個羧酸根陰離子、2個羧酸分子和1個吡啶分子提供配位。仿生Mn4CaO4簇合物中4個Mn離子的價態(tài)(+3、+3、+4、+4)與生物OEC(S1態(tài))完全一樣(圖8)。該化合物被單電子氧化后能夠觀察到類似于OEC(S2態(tài))樣品所擁有的g=2和g=4兩種EPR信號[77]。這些結果顯示仿生Mn4CaO4簇合物與OEC不僅空間結構上非常類似，而且電子結構也類似。仿生Mn4CaO4簇合物的電化學測定(圖9)揭示它也能夠進行4個電子的氧化-還原反應，其中S1→S2轉變的中電位為+0.8 V，它與OEC對應S1→S2的中電位基本一致。此外，我們還觀察到仿生Mn4CaO4簇合物在有少量水(＜1.0%)存在時，能夠在電極表面催化水裂解，給出顯著的催化電流[77]。這些研究揭示仿生Mn4CaO4簇合物不僅在結構上與OEC類似，而且在理化性能上也與OEC類似。這類仿生Mn4CaO4簇合物的獲得為今后研究OEC的結構和催化機理提供了理想的化學模型，同時為今后制備廉價、高效的人工水裂解催化劑奠定了重要的基礎[78]。

圖9 Mn4CaO4簇合物的氧化還原特性[77]

2019年通過對上述仿生Mn4CaO4簇合物中鈣離子上配體的替換，我們成功制備出能夠在極性有機溶劑(包括CH3CN、DMF)中可以穩(wěn)定4～6周的新型Mn4CaO4簇合物[43](圖10)。這類新型化合物除鈣離子的配體外，其他部分與圖8的仿生Mn4CaO4簇合物完全一樣，其錳離子的價態(tài)也與前期Mn4CaO4簇合物一樣。鈣離子上2個溶劑分子(如DMF)的引入使仿生Mn4CaO4簇合物與生物OEC的結構更加接近。

圖10 兩種含溶劑分子的新型仿生Mn4CaO4簇合物[43]

圖8和圖10仿生Mn4CaO4簇合物的制備、結構和理化性能均說明Mn4CaO4核心是個熱力學非常穩(wěn)定的結構單元，這可能是大自然為什么選擇類似簇合物作為光合放氧中心的一個重要原因[79]。但需要特別指出的是，目前我們制備的所有仿生Mn4CaO4簇合物均缺少與OEC中類似的一個μ2-O橋(在仿生簇合物中對應位置被一個羧基橋替代)[80-81]。能否在仿生Mn4CaO4簇合物的Mn3和Mn4之間引入這一μ2-O氧橋將是今后人工合成OEC研究中令人期待的一個研究方向。此外，能否突破生物OEC對Mn離子、Ca離子的依賴性，人工合成更穩(wěn)定、更高效的仿生OEC同樣非常令人期待。這些方面的深入研究不僅能加深我們對自然光合放氧微觀本質的認識，同時也會推動人工光合作用的研究進程。

5 結論與展望

綜上所述，近年來光合生物的PSII晶體結構研究取得了突破性進展，光合放氧中心Mn4CaO5簇合物的詳細結構已被揭示。光合生物的OEC具備三個重要特點：一、正常條件下，OEC能高效、安全地催化放氧反應；二、在PSII的D1蛋白發(fā)生破壞時，OEC能被快速降解；三、在PSII的D1蛋白被修復時，OEC能被快速合成。最近我們借鑒OEC的生物組裝條件成功合成出結構和理化性能均與OEC類似的系列仿生Mn4Ca-簇合物，為研究OEC的微觀原理提供了理想的化學模型。但目前無論自然光合放氧研究，還是人工光合放氧研究都還有許多科學問題亟待解答，它們包括：①生理條件下OEC的組裝規(guī)律；②OEC催化放氧的機理；③能否借鑒OEC的結構，發(fā)展穩(wěn)定、高效、廉價的仿生水裂解催化劑？④能否構建高效人工光驅動水裂解體系，獲取清潔能源(氫能或電能)？對這些問題的深入研究將會有助于人們對自然光合放氧反應微觀本質的認識，同時也會推動人工光合作用利用太陽能裂解水來獲得清潔能源(電能或氫能)的研究進程。