李炳霞，張 亮

（1.山東省濰坊市濰坊濱海經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)動物防疫監(jiān)督所，山東 濰坊 262737； 2.山東方舟生物科技有限公司，山東 濰坊）

金黃色葡萄球菌廣泛分布于自然界中，是自然界分布最廣泛的細(xì)菌之一，金黃色葡萄球菌的感染可以引起皮膚表面化膿，以及引起人畜共患的嘔吐、咳嗽等癥狀，常侵染抵抗力低下的人畜機(jī)體，該菌株耐藥性強(qiáng)，變異菌株感染常常不能得到快速有效的治療，例如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphyloco-ccus aureus，MRSA），該菌株具有多重耐藥性，且耐藥產(chǎn)生的過程極短，成為了人畜共患的主要細(xì)菌之一[1]，在與細(xì)菌長期的抗?fàn)幹?，天然植物提取物的抗菌作用逐漸顯現(xiàn)，其中茶樹精油的抗菌效果極佳，對金黃色葡萄球菌有很好的抑制和殺滅作用，茶樹精油（Teatreeoil）是從桃金娘科白千層屬植物茶樹中提取得到的淡黃色油狀液體，具有特殊芳香氣味，廣泛分布于澳大利亞與新西蘭的部分地區(qū)，目前我國福建、海南、云南及廣西等地也有種植，茶樹精油含有揮發(fā)油、鞣質(zhì)、脂肪酸、萜類等100多種成分，其主要成分為松油烯-4-醇與1,8-桉葉素[2]。茶樹精油具有非選擇性的廣譜抗菌活性，以膜破壞的形式發(fā)揮抗菌作用，對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌等都有較強(qiáng)的抑制作用[3]，茶樹精油又是天然植物的提取成分，具有無毒害的特點[4]，在某些特定場景比抗生素更有優(yōu)勢，有望可以替代抗生素，為開發(fā)天然藥物替代抗生素奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

新鮮茶樹枝葉（由山東方舟生物科技有限公司提供）；松油烯-4-醇標(biāo)準(zhǔn)品（北京索萊寶科技有限公司），1,8-桉葉素標(biāo)準(zhǔn)品（北京索萊寶科技有限公司），色譜級甲醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），色譜級正己烷，高純度氮氣、Agilent7890氣相色譜分析儀（美國安捷倫公司）、KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗儀、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA），MH-A瓊脂培養(yǎng)基、MH-B肉湯培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）；MTT染液（北京索萊寶科技有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（型號為DNP-9272A，購自上海鴻都電子科技有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（型號為LDZX-50KBS，購自上海申安醫(yī)療器械廠）；生物安全柜（型號為HF-safe，購自上海力申科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

采用水蒸氣蒸餾法提取茶樹精油，通過倍比稀釋法測定茶樹精油對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抑制作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹精油有效成分含量測定

色譜條件：毛細(xì)管色譜柱Aligent DB-FFAP（30 m × 0.32 mm × 0.5 μm）氮 氣；進(jìn) 樣 口230 ℃；檢測器230 ℃；升溫程序：50 ℃ 保持1 min，5 /min℃ 升至200 ℃，保持2 min，流速及模式1.3 ml/min，恒線速度；分流比50:1；進(jìn)樣量1 μl。樣品色譜圖松油烯-4-醇與1,8-桉葉素的保留時間一致。

以峰面積與縱坐標(biāo)（Y），松油烯-4-醇、1,8-桉葉素對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：松油烯-4-醇為Y=340.45X-8.1705（R2=0.9999）；1,8-桉葉素為Y=433.7X+ 0.2551（R2=0.9999）。

2.2 茶樹精油的提取

熱回流提取。稱取100 g茶樹枝葉，用剪刀剪成段狀[5]，加入燒瓶中，按照1:10加入1 L純化水，加熱回流提取2 h，待精油液面不再變化，緩慢放液取出上層淡黃色油相層液體[6]，得茶樹精油1.6 g，與標(biāo)準(zhǔn)品峰對比，茶樹精油中的松油烯-4-醇與1,8-桉葉素保留時間一致[7]。

2.3 茶樹精油主要成分薄層色譜鑒別

精密吸取提取到的茶樹精油0.375 ml加入到5 ml容量瓶，乙酸乙酯定容。取松油烯-4-醇50mg和1,8-桉葉素10mg分別加入兩個5 ml容量瓶中用乙酸乙酯定容備用。用點樣器分別吸取提取到的茶樹精油、松油烯-4-醇、1,8-桉葉素各2 μl點于含羧甲基纖維素鈉的硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯（10:1）為展開劑，以2 %香草醛硫酸乙醇溶液為顯色劑，烘干加熱至顯色[8]，見圖1。結(jié)果顯示本次提取到的茶樹精油與松油烯-4-醇、1,8-桉葉素標(biāo)準(zhǔn)品在色譜相對應(yīng)的位置顯示相同顏色的斑點。

圖1 茶樹精油（左）、松油烯-4-醇（中）、1,8-桉葉素（右）薄層色譜

2.4 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）抑菌試驗

2.4.1 菌液制備 在超凈工作臺中取出凍存的MRSA菌株，接種于MH-B液體培養(yǎng)基中，36 ℃ 恒溫震蕩培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)完成后再接取一接種環(huán)劃線接種至MH-A固體培養(yǎng)基中36 ℃ 恒溫培養(yǎng)24 h。用接種環(huán)挑取單菌落于MH-B液體培養(yǎng)基中[9]，連續(xù)培養(yǎng)至16 h即可作為菌液使用。

2.4.2 最小抑菌濃度（MIC）測定 將培養(yǎng)至16 h的MRSA菌液轉(zhuǎn)移至無菌操作臺，用倍比稀釋法測定最小抑菌濃度，通過生長對照、陰性對照，37 ℃ 恒溫培養(yǎng)18 h。重復(fù)三次試驗觀察結(jié)果[10]。通過倍比稀釋法測定茶樹精油對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抑制作用，當(dāng)茶樹精油濃度為0.75 % 時，該孔澄清，生長對照組渾濁[11]，說明0.75 % 濃度的茶樹精油能有效抑制MRSA生長，茶樹精油對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.75 %。

2.4.3 茶樹精油作用下MRSA的動態(tài)生長曲線 將茶樹精油加入含MRSA（106CFU/ ml）的MHB培養(yǎng)基中，使茶樹精油濃度為1×MIC、2×MIC、4×MIC，并設(shè)置生長對照組，設(shè)置取樣時間點為0、1、2、4、8、16、24 h。應(yīng)用活菌計數(shù)法測定各組菌量數(shù)，36 ℃ 恒溫培養(yǎng)18 h，做菌落計數(shù)，重復(fù)三次試驗，繪制MRSA動態(tài)生長曲線圖，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示茶樹精油對MRSA的動態(tài)生長，2×MIC的茶樹精油能夠顯著抑制MRSA生長，4×MIC濃度的茶樹精油作用下MRSA幾乎無生長。

圖2 MRSA動態(tài)生長曲線

3 討論

（1）采用水蒸汽蒸餾法提取茶樹精油得茶樹精油1.6 g，得率1.6 %，該方法簡便易行[12]，提取快速，提取成本較低，無需繁瑣的操作步驟，適合工廠快速大量的生產(chǎn)提取，所得茶樹精油雜質(zhì)較少，顏色為無色至淡黃色[13]，主要成分含量為松油烯-4-醇為35.4 %、1,8-桉葉素為1.2 %；提取效果較好，其中松油烯-4-醇與1,8-桉葉素含量符合GB/T 26514-2011標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。（2）使用該方法可以快速的鑒別茶樹精油中的主要成分松油烯-4-醇與1,8-桉葉素，與標(biāo)準(zhǔn)品色譜相對應(yīng)的位置顯示相同顏色的斑點[14]，該方法可以便捷快速的鑒別茶樹精油的主要成分[15]，不僅操作簡便易行，且圖譜顯色迅速準(zhǔn)確，可作為茶樹精油主要成分鑒別的有效方法。（3）通過本研究可以得出茶樹精油對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌作用的MIC為0.75 %，觀察茶樹精油作用下MRSA的動態(tài)生長曲線，結(jié)果顯示在2×MIC濃度的茶樹精油作用下MRSA的生長和繁殖受到了明顯抑制，茶樹精油4×MIC濃度下MRSA無生長。

綜上所述，使用水蒸汽蒸餾法提取茶樹中的茶樹精油操作簡便高效，提取得到的茶樹精油主要成分松油烯-4-醇與1,8-桉葉素含量分別為35.4 %與1.2 %，對茶樹精油的主要成分松油烯-4-醇與1,8-桉葉素鑒別方法反應(yīng)快速、準(zhǔn)確，通過茶樹精油對MRSA作用的抑菌試驗研究，2×MIC濃度的茶樹精油即可顯著抑制MRSA生長繁殖，4×MIC濃度的茶樹精油作用于MRSA，幾乎無生長，抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）效果顯著，本研究為茶樹精油抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）提供理論依據(jù)，為天然藥物替代抗生素奠定基礎(chǔ)。