楊金清，陳薪宇，趙正雄，保志娟

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，云南 昆明 650201； 2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650201)

多酚是植物體內(nèi)苯丙烷代謝途徑生成的一類次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、絡(luò)合金屬、抑菌等生理活性功能[1-3]。同時(shí)，多酚類物質(zhì)具有光保護(hù)作用，能吸收過(guò)多的太陽(yáng)輻射[4]，影響植物光合作用，并參與植物的防御反應(yīng)[5-6]。煙草葉片富含多酚，其含量可達(dá)干質(zhì)量的3%[7]。煙草多酚不僅反映煙草的遺傳特性和生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)，還與其品質(zhì)密切相關(guān)[8]。

外源調(diào)節(jié)劑能夠促進(jìn)作物光合作用，增加干物質(zhì)積累，同時(shí)還可以調(diào)節(jié)作物生理代謝，促進(jìn)次生代謝物積累，進(jìn)而改善品質(zhì)[9-13]。茶多酚(Tea polyphenols，TP)，又稱茶鞣質(zhì)[14]，是茶葉的主要次級(jí)代謝物，主要由沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)、表沒(méi)食子兒茶素(EGC)及表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)等30多種酚類化合物組成。茶多酚作為一種外源性自由基清除劑[15]，具有較強(qiáng)的抗氧化[16-17]、抗癌、抗輻射及抗腫瘤[18-19]效果，也可以作為高效的植物源農(nóng)藥和新型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。楊穎麗等[20]發(fā)現(xiàn)，茶多酚能有效緩解鹽脅迫誘導(dǎo)的小麥根滲透性調(diào)節(jié)物積累和鈣元素含量減少。司廉邦等[21]研究表明，茶多酚能增強(qiáng)鹽脅迫下小麥幼苗的光合能力，減少H2O2的產(chǎn)生，緩解鹽脅迫對(duì)小麥幼苗的傷害。目前，有關(guān)茶多酚對(duì)烤煙光合特性和多酚類物質(zhì)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道，鑒于此，探討了打頂后噴施茶多酚對(duì)烤煙光合特性和酚類次生代謝物含量的影響，以期為明確茶多酚調(diào)控?zé)煵萆L(zhǎng)及次生代謝的機(jī)制提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試品種及土壤

供試烤煙品種為云煙206。試驗(yàn)于2019年3—9月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)教育科研基地進(jìn)行。試驗(yàn)田地處23°32′～25°34′N、103°13′～103°16′E，氣候?qū)儆趤啛釒Ъ撅L(fēng)氣候，前茬作物為玉米，土壤理化性質(zhì)為pH值7.73，有機(jī)質(zhì)含量45.70 g/kg，含水量3.29%，全氮含量0.28 g/kg，速效氮、磷、鉀含量分別為130.49、47.88、507.70 mg/kg，硝態(tài)氮含量2.70 mg/kg，銨態(tài)氮含量0.46 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)為單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，共設(shè)置4個(gè)茶多酚用量處理，分別為0(CK)、25、50、75 mg/株，將以上處理茶多酚用純凈水(體積50 mL)分別配制成溶液。煙苗選用高度、生長(zhǎng)、剪葉均一致的壯苗，于2019年5月12日移栽至大田，栽種高度保持一致?；蕿?5 g/株煙草復(fù)合肥(N-P2O5-K2O:15-8-25)，采用環(huán)施法一次施入，其他栽培管理均保持一致，定期灌溉，噴灑殺蟲(chóng)劑等。在50%煙株中心花開(kāi)放時(shí)進(jìn)行打頂。于打頂后1 d挑選生長(zhǎng)一致的煙株，將各處理茶多酚溶液分別噴灑于上部葉(10：00前)，第7天噴灑第2次。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4株，每個(gè)處理共12株。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 光合指標(biāo) 第2次噴灑調(diào)節(jié)劑后，于第2天9:00—11:00，采用美國(guó)LI-COR公司生產(chǎn)的LI-6400型便攜式光合測(cè)定儀測(cè)定煙株第14位葉片(從下往上數(shù))的凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)、大氣CO2濃度(Ca)。儀器使用開(kāi)放式氣路、內(nèi)置 LED紅/藍(lán)光源(6400-02B)，光強(qiáng)設(shè)置為800 μmol/(m2·s)，葉室溫度為(25±2)℃，測(cè)定每處理重復(fù)5次。計(jì)算以下指標(biāo)：氣孔限制值(Ls)=1-Ci/Ca；潛在水分利用效率(WUEg)=Pn/Gs；瞬時(shí)水分利用效率(WUEt)=Pn/Tr；表觀光能利用效率(LUEapp)=Pn/PAR；表觀CO2利用效率(CUEapp)=Pn/Ci。

1.3.2 煙葉SPAD值 第2次噴灑調(diào)節(jié)劑后，于第2天9:00—11:00，每個(gè)處理選取5株烤煙，采用日本產(chǎn)SPAD-502型葉綠素計(jì)測(cè)定噴灑調(diào)節(jié)劑后煙株第14位葉片(從下往上數(shù))的SPAD值，分別在葉基、葉中、葉尖處測(cè)得SPAD值，重復(fù)3次，計(jì)算每片葉的平均值即為該葉片的SPAD值。

1.3.3 煙葉多酚含量 第2次噴灑調(diào)節(jié)劑后，于第2天取上部煙葉(第14—16葉位)，清洗除主脈后于烘箱中105 ℃殺青30 min，60 ℃烘干至恒質(zhì)量(將該時(shí)期樣品標(biāo)記為“打頂后”)；在烤煙上部葉成熟時(shí)進(jìn)行采收烘烤，于烘烤后取上部煙葉(第14—16葉位)，去除主脈后于烘箱中60 ℃烘干至恒質(zhì)量(將該時(shí)期樣品標(biāo)記為“烘烤后”)。取“打頂后”及“烘烤后”煙樣，干燥粉碎后過(guò)孔徑為0.425 mm的篩網(wǎng)。分別稱取0.4 g干樣品置于50 mL錐形瓶?jī)?nèi)，再加入28 mL 80%甲醇水溶液和2 mL鹽酸溶液，超聲提取30 min(功率100%、溫度50 ℃)。靜置，取1 mL萃取液經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾后，采用高效液相色譜儀(1260 infinity Ⅱ，Agilent，USA)測(cè)定綠原酸、咖啡酸、蘆丁、莨菪亭4種多酚類化合物含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel 2013、SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，差異顯著性比較使用Duncan’s新復(fù)極差法(P=0.05)，采用Origin 8.0進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚對(duì)烤煙光合氣體交換參數(shù)的影響

如圖1所示，0～75 mg/株茶多酚處理下，烤煙葉片Pn、Gs、Tr均隨茶多酚用量增加呈先增加后減少的趨勢(shì)，25、50 mg/株處理均高于CK。與CK相比，打頂后噴施茶多酚處理的烤煙葉片Ls有所提高，Ci均顯著降低(P<0.05)。其中,以25 mg/株茶多酚處理效果最顯著，烤煙葉片Pn、Gs、Tr和Ls分別比CK顯著提高102.5%、365.0%、121.6%和241.7%，而Ci比CK顯著降低32.5%；50 mg/株茶多酚處理烤煙葉片Pn、Gs、Tr和Ls分別比CK提高91.4%、40.4%、5.1%和90.8%，Ci比CK顯著降低11.3%。

2.2 茶多酚對(duì)烤煙葉片資源利用效率的影響

由圖2可知，打頂后，50～75 mg/株茶多酚處理烤煙葉片WUEg、WUEt均比CK提高，其中以50 mg/株茶多酚處理最高，分別比對(duì)照顯著提高30.3%、82.0%。噴施茶多酚能促進(jìn)烤煙葉片CUEapp提高，而25～50 mg/株茶多酚處理能促進(jìn)烤煙葉片LUEapp提高。其中，CUEapp、LUEaap均以25 mg/株茶多酚處理最高，分別比CK顯著提高199.7%、101.7%；而50 mg/株茶多酚處理分別比CK顯著提高115.4%、89.7%。以上結(jié)果說(shuō)明，煙株打頂后噴施25～50 mg/株茶多酚處理更有利于提高烤煙葉片H2O、CO2和光能資源的綜合利用效率，從而促進(jìn)光合作用，進(jìn)一步促進(jìn)煙葉干物質(zhì)積累。

2.3 茶多酚對(duì)烤煙葉片SPAD值的影響

由圖3可知，煙株打頂后，烤煙葉片SPAD值隨茶多酚噴施用量的增加而下降，各處理均顯著低于CK，25、50、75 mg/株茶多酚處理分別降低8.2%、10.3%、28.2%。

2.4 茶多酚對(duì)烤煙多酚含量的影響

由圖4可知，打頂后噴施茶多酚，煙葉綠原酸、咖啡酸、蘆丁含量均隨茶多酚用量的增加而增加，其中，50 mg/株和75 mg/株茶多酚處理與CK差異顯著(P<0.05)，分別比CK增加了60.2%、22.8%、66.4%和132.8%、202.4%、203.2%；打頂后噴施茶多酚處理的煙葉莨菪亭含量較CK明顯降低，25、50、75 mg/株茶多酚處理分別比對(duì)照降低20.3%、8.1%、12.2%。

而成熟采烤的煙葉，除75 mg/株茶多酚處理煙葉咖啡酸含量極顯著低于打頂后，其余處理的4種多酚物質(zhì)均極顯著高于打頂后(P<0.01)，綠原酸、咖啡酸、莨菪亭、蘆丁含量分別增加3.98～11.04倍、1.06～1.53倍、0.31～0.52倍、0.82～5.11倍。煙葉成熟采烤后，噴施茶多酚處理煙葉4種多酚物質(zhì)含量與CK相比或增或減，無(wú)明顯變化趨勢(shì)。

2.5 茶多酚用量與煙葉光合特性、多酚含量的相關(guān)分析

如表1所示，打頂后，茶多酚噴施用量與煙葉Pn、Gs、Ci、Tr及Ls間無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系，而與煙葉SPAD值呈極顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明茶多酚對(duì)葉綠素積累具有抑制作用。如表2所示，打頂后，茶多酚噴施用量與煙葉綠原酸、咖啡酸、蘆丁含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與莨菪亭含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；煙葉成熟采烤后，茶多酚噴施用量與煙葉多酚化合物含量均無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系。

表1 茶多酚用量與煙葉光合特性的相關(guān)系數(shù)

表2 茶多酚用量與煙葉多酚含量的相關(guān)系數(shù)Tab.2 Correlation coefficients between tea polyphenols and polyphenol content of tobacco leaves

2.6 打頂后煙葉光合特性與多酚含量的相關(guān)性分析

對(duì)打頂后不同用量茶多酚處理的煙葉光合特性與多酚含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，煙葉Pn與Gs呈顯著正相關(guān)，與Tr呈極顯著正相關(guān)，與綠原酸、咖啡酸、蘆丁含量呈極顯著負(fù)相關(guān)；煙葉Gs與Tr呈極顯著正相關(guān)，與Ls、莨菪亭含量呈極顯著負(fù)相關(guān)；煙葉Ci與Ls、SPAD值呈極顯著正相關(guān)，與咖啡酸、蘆丁含量呈極顯著負(fù)相關(guān)；煙葉Tr與Ls呈極顯著正相關(guān)，與莨菪亭含量呈極顯著負(fù)相關(guān)；煙葉SPAD值與咖啡酸、蘆丁含量呈極顯著負(fù)相關(guān)；煙葉綠原酸含量與咖啡酸、蘆丁含量呈顯著正相關(guān)；煙葉咖啡酸含量與蘆丁含量呈極顯著正相關(guān)。

表3 打頂后煙葉光合特性與多酚含量的相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis of photosynthetic characteristics and polyphenol content of tobacco leaves after topping

3 結(jié)論與討論

光合作用是植物有機(jī)物質(zhì)合成、能量貯存與轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)，與植物的生長(zhǎng)發(fā)育有著密切的關(guān)系。導(dǎo)致光合速率降低的因素包括氣孔限制和非氣孔限制，其判定依據(jù)是Ci和Ls的變化方向，Ci降低和Ls升高表明氣孔限制因素是主要原因，而Ci增高和Ls降低則表明引起光合速率降低的主要原因是非氣孔因素[22]。本試驗(yàn)研究表明，煙株打頂后，噴施75 mg/株茶多酚處理的烤煙葉片Ci下降、Ls升高，且Pn和LUEapp比CK降低，推斷此時(shí)氣孔因素限制凈光合速率，光合同化能力下降；而噴施25、50 mg/株茶多酚處理烤煙葉片Pn、Gs、Tr、LUEapp則比CK有所提升，說(shuō)明少量茶多酚能提高煙葉光合同化能力，過(guò)量茶多酚抑制煙葉氣孔開(kāi)閉進(jìn)而影響煙葉光合作用。植物光合作用本身受與鈣離子相關(guān)的CBL-SnRK31/SnPK34基因表達(dá)的調(diào)控[23-25]，而茶多酚自身能夠絡(luò)合鈣離子[26]，由此推測(cè)，茶多酚可能通過(guò)絡(luò)合鈣離子，從而調(diào)控與鈣離子相關(guān)的CBL-SnRK31/SnPK34基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控保衛(wèi)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)氣孔的開(kāi)閉，調(diào)控?zé)熑~光合作用。

葉綠素是影響植物光合作用的一個(gè)重要因素，而SPAD值能反映植株葉片中葉綠素含量的相對(duì)值。司廉邦等[21]發(fā)現(xiàn)，茶多酚能促進(jìn)小麥幼苗葉片葉綠素含量增加，而本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，噴施茶多酚處理煙葉SPAD值比CK顯著降低，與前人結(jié)果相反，但噴施中低濃度茶多酚處理的煙葉光合能力增強(qiáng)，此時(shí)SPAD值下降的可能原因是茶多酚促進(jìn)葉綠素分解酶活性上升，使葉綠素轉(zhuǎn)化為葉綠素酯和葉綠素醇，因此SPAD值降低。

本試驗(yàn)中，不同處理烤煙葉片的光合參數(shù)有顯著區(qū)別，然而，茶多酚用量與光合參數(shù)的相關(guān)性并不顯著，卻與SPAD值相關(guān)性顯著，可能是茶多酚促進(jìn)葉綠素a轉(zhuǎn)化為葉綠素b，導(dǎo)致葉綠素總量有所下降，而葉綠素a/b值在一定范圍內(nèi)越小，葉片對(duì)植物光能的吸收率越高[21]，從而間接影響光合參數(shù)變化，茶多酚影響烤煙光合色素的機(jī)制仍需進(jìn)一步深究。

煙草中多酚的合成、積累受環(huán)境條件、遺傳因素、種植管理方式、調(diào)制方法以及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等多種因素的影響。代麗等[27]研究表明，打頂后葉面噴施水楊酸能提高煙葉綠原酸、蘆丁含量。與其結(jié)果類似，本試驗(yàn)研究顯示，煙株打頂后，噴施茶多酚處理煙葉的綠原酸、咖啡酸、蘆丁含量均高于CK，且與茶多酚用量呈極顯著正相關(guān)，表明茶多酚可能利用自身抗氧化能力增強(qiáng)煙株活性氧的清除能力，降低煙葉中多酚氧化酶的活性，進(jìn)而促進(jìn)煙葉多酚類物質(zhì)積累。

本試驗(yàn)中，烤后煙葉多酚含量總體上均高于打頂后，與朱金峰等[28]的研究結(jié)果一致；但不同處理煙葉成熟采烤后多酚物質(zhì)含量的變化趨勢(shì)與打頂后不一致，且茶多酚用量與烤后煙葉多酚物質(zhì)含量無(wú)顯著相關(guān)性。由此說(shuō)明，煙株打頂至煙葉成熟采收以及烘烤等一系列過(guò)程會(huì)弱化茶多酚對(duì)煙葉多酚含量的影響效應(yīng)。這可能是因?yàn)椋蝽敽鬅熑~部分多酚在成熟階段發(fā)生降解或通過(guò)根系分泌進(jìn)入環(huán)境中，而進(jìn)入烘烤過(guò)程后，煙葉多酚在多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶的作用下發(fā)生酶促棕色化反應(yīng)，同時(shí)降解成香氣物質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致茶多酚對(duì)烘烤過(guò)程中煙葉酚類次生代謝物的影響力下降。

綜上所述，打頂后噴施適量茶多酚可提高煙葉凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率及光能利用率，提高煙葉光合同化能力，促進(jìn)煙葉綠原酸、咖啡酸和蘆丁含量積累，抑制莨菪亭積累；且煙葉光合特性與多酚含量的變化存在一定的相關(guān)性。但煙株打頂至煙葉成熟采收以及烘烤等一系列過(guò)程會(huì)弱化茶多酚對(duì)煙葉多酚含量的影響效應(yīng)。綜合來(lái)看，打頂后噴施50 mg/株茶多酚效果最佳，煙葉光合同化能力較強(qiáng)，同時(shí)能促進(jìn)鮮煙葉多酚積累，烘烤后煙葉咖啡酸、蘆丁含量最多。