胡基雄，王 席，李國(guó)攀，榮 俊

（1.長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；2.荊州長(zhǎng)新生物有限公司，湖北 荊州 434025）

副豬嗜血桿菌sodA基因編碼的金屬錳依賴的超氧化物歧化酶是一種防御蛋白質(zhì)［1，2］。超氧化物歧化酶（SOD）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物中。1938年，Keilin和Mann在血液中發(fā)現(xiàn)了一種蛋白質(zhì)——血銅蛋白。1969年，Mc Cord和Fridovich發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)具有酶活性，并正式命名其為超氧化物歧化酶［3］。超氧化物歧化酶根據(jù)其結(jié)合的金屬離子不同主要分為Mn SOD、Fe SOD、Cu/Zn SOD以及Ni SOD 4類，分別由sodA、sodB、sodC以及sodN基因編碼［4，5］。超氧陰離子自由基（O2-）是生物體生理反應(yīng)的中間產(chǎn)物，具有極強(qiáng)的氧化能力，是生物氧毒害重要因素之一［6］。SOD是機(jī)體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子，對(duì)維持生物體內(nèi)動(dòng)態(tài)平衡具有重要作用。缺失SOD的嗜血桿菌菌株比野生型更容易被細(xì)胞外超氧化物殺死［7］。Yesilkaya等［8］通過突變肺炎鏈球菌sodA基因使其Mn SOD失活，突變株在有氧條件下生長(zhǎng)速度低于野生型。SOD在細(xì)菌預(yù)防侵染過程中宿主免疫細(xì)胞的氧化殺傷中可能發(fā)揮重要作用［9］。本研究以副豬嗜血桿菌sodA基因?yàn)檠芯繉?duì)象，通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組HPSSOD蛋白質(zhì)，利用鄰苯三酚自氧化法檢測(cè)其活性，獲得具有活性的重組HPSSOD蛋白質(zhì)，為研究SOD在HPS細(xì)菌生理代謝中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌株

血清5型副豬嗜血桿菌、pET28a（+）載體以及E.coliBL21（DE3）菌種來源于長(zhǎng)江大學(xué)生物醫(yī)藥研究所。

1.2 試劑與儀器

瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；快速質(zhì)粒DNA小提試劑盒購(gòu)自Sigma公司；BamHⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司；金牌Mix（green）Golden Star T6 Super Mix購(gòu)自北京擎科生物科技有限公司；鄰苯三酚購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；Tris購(gòu)自賽國(guó)生物科技有限公司；分析純?cè)噭┝姿釟涠c、磷酸二氫鈉、氯化鈉以及濃鹽酸均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Gel Doc EZ凝膠成像儀、Trans-Blot Turbo轉(zhuǎn)膜儀均購(gòu)自Bio-Rad公司；UV 2450紫外可見分光光度計(jì)購(gòu)自島津公司；美國(guó)1200高效液相色譜儀購(gòu)自安捷倫公司；TAS-990型火焰原子化法原子吸收光譜儀購(gòu)自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 HPS SOD重組表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)GenBank上發(fā)布的HPSsodA基因序列（ACCESSION：CP041334），設(shè)計(jì)1對(duì)引物sod F和sod R（表1），以血清5型副豬嗜血桿菌煮沸法粗提的基因組DNA作為模板，PCR擴(kuò)增一段長(zhǎng)度為629 bp的SOD序列，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，58℃退火10 s，72℃延伸20 s，30個(gè)循環(huán)；72℃最終延伸3 min；4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析并切膠回收。將回收的PCR產(chǎn)物以及pET28a（+）載體用BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，用T4DNA連接酶將酶切后的PCR產(chǎn)物連接至pET28a（+）載體中。將連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）化學(xué)感受態(tài)中，經(jīng)PCR鑒定以及測(cè)序鑒定后，將測(cè)序正確的菌種保存，命名為E.coliBL21（DE3）/pET28a-HPS-SOD。

表1 引物序列

1.4 重組HPS SOD蛋白質(zhì)的表達(dá)

將E.coliBL21（DE3）/pET28a-HPS-SOD工程菌種接種至含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)8 h，1∶100接種至含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，至OD600nm為0.8，經(jīng)終濃度30 mmol/Lα-乳糖在32℃誘導(dǎo)表達(dá)10 h。收集菌體沉淀，用磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L PB，15 mmol/L NaCl，pH 7.4）將菌體按照1∶10（m∶V）重懸，超聲破碎后，12 000 r/min離心10 min，收集上清液進(jìn)行SDSPAGE檢測(cè)。

1.5 重組HPS SOD蛋白質(zhì)的純化

將上清液進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀，收集飽和度40%～60%的沉淀蛋白質(zhì)，用PB緩沖液重懸沉淀并利用0.22μm濾器過濾。用3倍柱體積的PB緩沖液（pH 7.4）平衡Sephacryl S-300層析柱及系統(tǒng)，將預(yù)處理的蛋白液注入純化儀，流速3 mL/min，分管收集所有UV 280 nm出現(xiàn)吸收峰的溶液，電泳后將目的蛋白質(zhì)含量較高的收集液進(jìn)行混合。用5倍柱體積的緩沖液A（pH 7.4 PB）平衡DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱及系統(tǒng)，以1 mL/min的流速將上一步混合液注入純化儀，上樣完成后用緩沖液A淋洗層析柱5個(gè)柱體積，然后通過緩沖液A和緩沖液B（pH 7.4 PB，1 mol/L NaCl）調(diào)整比例以形成離子強(qiáng)度梯度，以3 mL/min流速進(jìn)行梯度洗脫，分管收集所有UV 280 nm出現(xiàn)吸收峰的溶液，將純化后的蛋白用SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)，用Bio-Rad凝膠成像儀Image Lab軟件進(jìn)行純度分析，同時(shí)采用Bradford法對(duì)純化后蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 重組HPS SOD蛋白質(zhì)的Western Blotting鑒定

將純化后的目的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將目的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至NC纖維膜上，以5%脫脂奶粉在37℃孵育1 h，以6×His Tag Mouse Monoclonal antibody作為一抗（1∶8 000），37℃孵育1 h，用1×PBST洗滌NC膜3次，10 min/次。以HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗IgG（H+L）作為二抗（1∶20 000），37℃孵育1 h，用1×PBST洗滌NC膜3次，10 min/次。加入ECL超敏化學(xué)顯色液（A液+B液）孵育30 s，用Gel Doc XRS凝膠成像儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光成影拍照。

1.7 鄰苯三酚自氧化法的建立

1.7.1 鄰苯三酚自氧化最大波長(zhǎng)的選擇 依次加入25℃預(yù)熱的100 mmol/L Tris-HCl（含1 mmol/L EDTA-2Na，pH 8.2）、20 mmol/L PB緩沖液（pH 7.4）和4.5 mmol/L鄰苯三酚（表2），迅速搖勻，分光光度計(jì)掃描300～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物的吸收峰。

表2 鄰苯三酚自氧化法測(cè)定

1.7.2 鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定 依次加入25℃預(yù) 熱的100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.2）和20 mmol/L PB緩沖液（pH 7.4），4.5 mmol/L鄰苯三酚，迅速搖勻，檢測(cè)前3 min鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物在最大吸收峰處吸收值的變化。

1.7.3 酶活力的計(jì)算 調(diào)節(jié)待測(cè)樣品至其對(duì)鄰苯三酚氧化抑制率接近50%進(jìn)行酶活測(cè)定最佳，

式中，?A1為鄰苯三酚自氧化速率；?A0為樣液抑制鄰苯三酚自氧化速率；V為樣液體積，單位為mL；n為樣液稀釋倍數(shù)；C為樣品濃度，單位為mg/mL。

1.8 Mn元素含量的測(cè)定

用固體硫酸錳配制成錳的濃度為100 mg/mL的儲(chǔ)存溶液，介質(zhì)為2%的稀鹽酸，然后將錳儲(chǔ)存液稀釋成系列梯度的標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品系列質(zhì)量濃度見表3。用TAS-990原子吸收分光光度計(jì)進(jìn)行Mn元素的檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)279.48 nm對(duì)應(yīng)樣品的吸光度，繪制Mn的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。同法測(cè)定濃縮后純化的HPSSOD蛋白質(zhì)中Mn原子吸收值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的方程計(jì)算樣品中Mn元素含量。

表3 Mn原子吸收標(biāo)準(zhǔn)系列質(zhì)量濃度

1.9 HPS SOD聚合形式的初步鑒定

利用0.1μm濾膜過濾后的流動(dòng)相（50 mmol/L PBS，pH 7.4）沖洗高效液相色譜系統(tǒng)，將純化后的重組HPSSOD樣品以及3個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品：牛血清白蛋白二聚體（132.8 ku）、胰蛋白酶單體（23.8 ku）、豬尿酸氧化酶四聚體（132.0 ku）分別經(jīng)0.1μm濾器過濾后上樣至高效液相色譜柱（Agilent Bio SEC-5）中，以1 mL/min流速進(jìn)行淋洗，檢測(cè)280 nm處樣品吸收峰，記錄保留時(shí)間。以各標(biāo)準(zhǔn)品的log10（標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量）作為橫坐標(biāo)，保留時(shí)間作為縱坐標(biāo)擬合線性回歸方程，根據(jù)重組HPSSOD的保留時(shí)間，利用線性回歸方程計(jì)算其分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPS SOD重組表達(dá)載體的鑒定

對(duì)構(gòu)建的重組表達(dá)菌株E.coliBL21（DE3）/pET 28a-HPS-SOD進(jìn)行菌液PCR鑒定，經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)鑒定，結(jié)果表明，在600 bp處擴(kuò)增到了特異性條帶（圖1），與預(yù)期大小相符，表明E.coliBL21（DE3）/pET28a-HPS-SOD重組表達(dá)菌株構(gòu)建成功。

圖1 菌液PCR鑒定結(jié)果

2.2 HPS SOD重組蛋白質(zhì)的表達(dá)與純化

E.coliBL21（DE3）/pET28a-HPS-SOD工程菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)。結(jié)果表明，表達(dá)的重組HPSSOD蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為26.0 ku，與預(yù)期大小相同，表達(dá)產(chǎn)物主要以可溶性形式存在于上清中（圖2）。表達(dá)的重組HPSSOD蛋白質(zhì)經(jīng)過硫酸銨分級(jí)沉淀，Sephacryl S-300過濾層析以及DEAESepha?rose Fast Flow陰離子交換層析等方法純化后，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，得到的純度為95%的重組HPSSOD蛋白質(zhì)（圖2）。

2.3 HPS SOD重組蛋白質(zhì)的鑒定

將純化后的重組HPSSOD蛋白質(zhì)進(jìn)行Western Blotting檢測(cè)，在26 ku處有明顯特異性反應(yīng)（圖3），與重組的HPSSOD蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大小一致，陰性對(duì)照與6×His Tag多克隆抗體無明顯特異性反應(yīng)，表明重組HPSSOD蛋白質(zhì)表達(dá)成功。

圖2 SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果

圖3 Western Blotting檢測(cè)結(jié)果

2.4 HPS SOD重組蛋白的酶活

2.4.1 鄰苯三酚自氧化最大吸收波長(zhǎng)選擇 如圖4所示，在波長(zhǎng)300～600 nm，每隔3 min掃描1次，鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物最大吸收峰為318 nm，故選擇318 nm進(jìn)行酶活性測(cè)定。

圖4 鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物在不同時(shí)間的吸收掃描光譜

2.4.2 重組HPSSOD酶活的測(cè)定 采用建立的鄰苯三酚自氧化法來檢測(cè)純化的重組HPSSOD的酶活性，檢測(cè)得到重組HPSSOD酶活性為215.9 U/mg，表明重組HPSSOD具有較好的活性。

2.5 重組HPS SOD蛋白質(zhì)中Mn元素的含量

根據(jù)測(cè)定的錳標(biāo)準(zhǔn)品不同含量對(duì)應(yīng)的吸收值，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5），得出計(jì)算方程C=0.568 7A2+2.847 6A+0.002 4（C為濃度mg/L，A為吸光度），相關(guān)系數(shù)為0.999 94，表明Mn質(zhì)量濃度在0～1.0 mg/L內(nèi)相關(guān)性較好。測(cè)得純化的重組SOD樣品對(duì)應(yīng)的平均吸收值為0.24（SD為0.000 2，RSD為0.513%），對(duì)應(yīng)純化的重組SOD樣品中Mn元素平均含量為0.71 mg/L，加標(biāo)量為0.20 mg/L，測(cè)得總量為0.89 mg/L，回收率為90%，表明該方法所測(cè)的純化后HPSSOD中Mn濃度具有較好的準(zhǔn)確度。

圖5 Mn元素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

2.6 重組HPS SOD蛋白質(zhì)表觀分子質(zhì)量的檢測(cè)

經(jīng)HPSEC檢測(cè)，純化后的HPSSOD保留時(shí)間為8.171 min。分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間見表4。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品擬合的線性方程為保留時(shí)間（min）=-1.248 9×log1（0分子質(zhì)量）+10.72，相關(guān)系數(shù)為0.989 3，將重組HPSSOD的保留時(shí)間代入方程計(jì)算得出純化的重組HPSSOD蛋白質(zhì)表觀分子質(zhì)量為109.8 ku。變性電泳顯示重組HPSSOD單亞基的分子質(zhì)量為26 ku，由此推測(cè)該重組蛋白質(zhì)是4聚體蛋白質(zhì)。

表4 HPSEC檢測(cè)數(shù)據(jù)表

3 小結(jié)與討論

副豬嗜血桿菌病又稱格拉澤氏病，由副豬嗜血桿菌引起的豬全身性炎癥反應(yīng)［10］。超氧化物歧化酶作為治療全身炎癥性疾病的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)接種了副豬嗜血桿菌亞單位疫苗SOD的小鼠對(duì)HPSSH0165和MD0322具有較好的免疫保護(hù)作用，表明HPSSOD是潛在的具有高效免疫原性的重組蛋白之一［11，12］。目前，從鼠傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、熒光假單胞菌等中均克隆并表達(dá)出了活性SOD［13-15］。但關(guān)于副豬嗜血桿菌sodA編碼的Mn-SOD的酶活性以及相關(guān)理化性質(zhì)的研究未見報(bào)道，本研究通過克隆副豬嗜血桿菌的sodA基因，表達(dá)出了具有活性的重組HPSSOD。

生物體內(nèi)存在兩類抗氧化系統(tǒng)，其中一類為酶抗氧化系統(tǒng)，包括過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等［16］。超氧化物歧化酶在清除活性氧系統(tǒng)中作為第一道防線，是機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)的重要監(jiān)測(cè)指標(biāo)［17，18］。目前獲得超氧化物歧化酶的傳統(tǒng)途徑是從植物、動(dòng)物、微生物等提取，動(dòng)物血液中提取SOD存在交叉感染等風(fēng)險(xiǎn)已被國(guó)內(nèi)外禁止，植物中SOD含量較少，提取純化工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本較高，雖然微生物發(fā)酵法提取高產(chǎn)菌株的SOD產(chǎn)量較高成本較低但獲得高產(chǎn)菌株的來源有限，微生物中SOD基因的表達(dá)與其生長(zhǎng)階段以及營(yíng)養(yǎng)條件有關(guān)［19］。一般的動(dòng)植物和微生物中提取的天然SOD穩(wěn)定性較差。利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)異源蛋白，因其具有產(chǎn)出快、產(chǎn)量高的特點(diǎn)成為獲取SOD的有效途徑［20］。Shi等［21］通過克隆蠶的BmSOD3基因，利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得Cu/Zn-SOD，在體外顯示出對(duì)大腸桿菌的抗菌活性，還有克隆黃瓜Cu/Zn-SOD基因獲取有活性的SOD［22］。而大多數(shù)采用的IPTG作為誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG具有毒性作用，在應(yīng)用方面有較大限制［23］，因此本研究通過α-乳糖作為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)大腸桿菌工程菌進(jìn)行表達(dá)，獲得高表達(dá)量的可溶性異源HPSSOD蛋白質(zhì)，測(cè)得純化后的HPSSOD酶活力為215.9 U/mg，同樣具有較好的活性。SOD在食品、臨床、日化等方向應(yīng)用廣泛［24］。獲得高純度有活性的超氧化物歧化酶產(chǎn)物顯得尤為重要，傳統(tǒng)從動(dòng)植物微生物中提取純化天然SOD的方法是破碎提取法，然后經(jīng)過有機(jī)溶劑、鹽沉淀、層析柱分離出SOD［25，26］。本研究采用硫酸銨沉淀、過濾層析、離子交換層析等系列的方法得到純度為95%較高純度的重組HPSSOD蛋白質(zhì)，在實(shí)際大規(guī)模生產(chǎn)用于人類醫(yī)療保健中具有較大的優(yōu)勢(shì)。

不同SOD其結(jié)合的金屬離子不同。通過原子吸收分光光度法檢測(cè)水樣［27］、人血白蛋白［28］中金屬含量已有報(bào)道。本研究采用火焰原子吸收光度法檢測(cè)到濃縮后的純化的HPSSOD樣品中Mn元素含量為0.71 mg/L，回收率為90%，檢測(cè)準(zhǔn)確度較好。Mn-SOD主要以二聚體或四聚體的形式存在，不同來源的Mn-SOD亞基分子分子質(zhì)量在20 ku左右，分子質(zhì)量在40～80 ku［29，30］，真核生物線粒體中的Mn-SOD是一種四聚體蛋白［31］。有學(xué)者通過測(cè)定雙孢蘑菇SOD酶亞基分子質(zhì)量以及全酶分子質(zhì)量推測(cè)其聚合形式為二聚體［30］。目前，通過HPSEC法分析可有效獲得蛋白表觀分子質(zhì)量［32，33］，本研究通過HPSEC法檢測(cè)計(jì)算得到重組的HPSSOD分子質(zhì)量為109.8 ku，與其4個(gè)亞基形成的聚合體分子質(zhì)量相近，推測(cè)重組HPSSOD可能是由4個(gè)相同亞基組成的多聚體。

綜上所述，本研究成功地將副豬嗜血桿菌的sodA基因克隆到pET28a（+）表達(dá)載體中，通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了重組HPSSOD蛋白質(zhì)。重組HPSSOD蛋白質(zhì)為可溶性蛋白質(zhì)，為多聚體，酶活性較好，為研究HPSSOD的抗氧化機(jī)理以及開發(fā)利用提供了依據(jù)。