王春花，曲雪嘉，孔令鈺，孫雪芳

（牡丹江師范學院生命科學與技術學院，黑龍江 牡丹江 157000）

菊花為菊科植物菊（Chrysanthemum morifoliumRa-mat.）的干燥頭狀花序，屬于藥食同源類中藥，其藥用最早記載于《神農本草經》，屬上品，歸肺、肝經，久服輕身耐老延年，具有清熱解毒、平肝明目等功效，在臨床上常被用于治療風熱感冒、目赤腫痛、瘡癰腫毒等癥［1，2］。在日常生活中，老百姓也常茶飲菊花或配伍其他中藥達到清熱解毒、防治疾病的作用?，F代藥理學研究表明，菊花具有抗炎、抑菌、調節(jié)免疫、鎮(zhèn)痛等作用，其清熱解毒功效與菊花抗炎藥理活性有一定的相關性［3］。目前，有關菊花的研究多集中在單一化學成分及其藥理作用的解析，中醫(yī)理論指導下的清熱解毒功效的物質基礎及分子作用機制方面的研究相對匱乏［3-5］。系統(tǒng)藥理學是從多成分-多靶點相互聯系的角度在整體水平上研究中藥作用機制的一種新手段，通過識別藥效物質、藥物靶點揭示疾病治療機制，從系統(tǒng)水平及整體水平研究和解決中藥藥效學和中醫(yī)藥基礎理論等關鍵問題，其研究方法符合中藥治療疾病的核心思想。近年來，在探索和預測中醫(yī)藥治療不同疾病的分子機制方面做出了顯著貢獻［6-8］。本研究采用系統(tǒng)藥理學方法，探討了菊花清熱解毒功效的分子機制，為菊花清熱解毒功效的研究與應用提供理論基礎與科學依據。

1 材料與方法

1.1 菊花活性化合物-靶點網絡的構建

借助中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺TCMSP（http：//tcmspw.com/index.php）檢索并篩選菊花中符合口服利用度利用TCMSP、Drugbank數據庫（https：//www.drugbank.ca）搜索化學成分的靶標蛋白質，合并作為化學成分的靶點。將化合物-靶點通過Cytoscape 3.7.1軟件構建菊花化合物-靶點網絡，分析化合物和靶點間的度（Degree）值，確定菊花關鍵靶點。

1.2 菊花靶點GO富集及關鍵靶點KEGG通路富集分析

將菊花靶點蛋白質基因上傳在線數據庫DAVID（https：//david.ncifcrf.gov），物種限定為“Homospaiens”，設定閾值P＜0.05，進行GO（Gene ontology）生物學過程富集分析。對菊花靶點蛋白質進行KEGG（KEGG pathway analysis）代謝通路富集分析，并通過Cyto?scape 3.7.1軟件構建靶點-信號通路網絡，分析菊花清熱解毒功效的分子機制。

1.3 菊花靶點蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建

將菊花相關靶點帶入在線網站STRING 11.0（https：//string-db.org），物種選擇為“Homo spaiens”，打分值設置＞0.9，獲取菊花化合物靶點PPI網絡信息，刪去無關聯蛋白質，通過Cytoscape 3.7.1軟件構建菊花靶點PPI網絡，分析菊花清熱解毒功效靶點相互作用關系。

1.4 菊花靶點器官定位

通 過BIOGPS數據庫（http：//biogps.org/#goto=welcome）對核心靶點進行器官定位分析，統(tǒng)計并整理各靶點組織分布信息，通過Cytoscape 3.7.1軟件繪制菊花核心靶點-組織網絡。

2 結果與分析

2.1 菊花化合物-靶點相互作用網絡

利用TCMSP平臺篩選并去除無靶點化合物后共獲得21種符合條件的活性成分。如圖1所示，化合物-靶點網絡共包括276個節(jié)點（21種化合物、255個靶點）和561條邊，菊花化合物由紅色節(jié)點代表，節(jié)點大小與Degree值相關，藍色節(jié)點代表靶點，內圈藍色節(jié)點為連接化合物大于10個的靶點，該網絡說明菊花清熱解毒功效可能是多成分、多靶點作用的結果。在菊花化合物-靶點網絡中，每個化合物有平均靶點數目26.7個，每個靶點平均與12.1個化合物相互作用，Degree值排名前5的成分是槲皮素（Quercetin）、山奈酚（Kaempferol）、木犀草素（Luteo?lin）、柚皮素（Naringenin）、β-谷甾醇（Beta-sitoster?ol），靶點≥10的化合物為菊花關鍵成分（表1）。從靶點的角度來看，連接化合物≥10個的靶點有6個，分別為前列腺素G/H合酶2（Prostaglandin G/H syn?thase 2）、核受體輔活化子2（Nuclear receptor coacti?vator 2）、前列腺素G/H合酶1（Prostaglandin G/H syn?thase 1）、熱 休 克 蛋 白90（Heat shock protein HSP 90）、二肽基肽酶IV（Dipeptidyl peptidase IV）、cAMP依賴性蛋白激酶催化亞單位α（PKA Catalytic Sub?unit C-alpha），連接化合物≥10個的靶點為菊花關鍵靶點（表2）?；衔?關鍵靶點-疾病網絡如圖2所示，菊花關鍵靶點主要與壞死（Necrosis）、產前暴露遲發(fā)效應（Prenatal exposure delayed effects）、化學藥物性肝損傷（Chemical and drug induced liver injury）、炎癥（Inflammation）、減重（Weight loss）、細胞增生（Hyperplasia）、腎臟疾?。↘idney diseases）和水腫（Edema）相關，推測菊花的清熱解毒功效可能與大部分活性成分發(fā)揮調控炎癥、壞死過程有關。

圖1 菊花化合物-靶點網絡

表1 菊花度值≥10的活性化合物基本信息

表2 菊花度值≥10的靶點基本信息

2.2 靶點通路分析

圖2 菊花化合物-關鍵靶點-疾病網絡

通過DAVID數據庫中GO功能富集分析得到GO條目146個（P＜0.05），其中生物過程（BP）條目105個，占72%，分子功能（CC）條目17個，占12%，細胞組成（MF）相關條目24個，占16%，主要GO條目如圖3所示。KEGG通路注釋分析，按P值排列前15條生物通路結果如圖4所示。其中包括癌癥信號通 路（Pathways in cancer、Bladder cancer、Pancreatc cancer、Prostate cancer、Non-small cell lung cancer）、炎癥信號通路（TNF signaling pathway）、免疫相關信號 通 路（Influenza A、Hepatitis B、Toxoplasmosis、Leishmaniasis、HTLV-Iinfection），通路中出現次數≥10的靶點有12個，包括AKT1、TP53、CCND、TGFB1、CDKN1A、MAPK3、MAPK1、IKBKB、NFKBIA、CHUK、RAF1、BAD，這些靶點蛋白主要參與細胞增殖和生長、細胞凋亡、炎癥反應、免疫和應激應答等過程。結果表明，菊花清熱解毒的功效與調控這些信號通路發(fā)揮抗炎、免疫調節(jié)作用有關。

圖3 菊花靶點GO富集

圖4 菊花靶點KEGG通路

2.3 菊花靶點PPI網絡構建與分析

為了更好地理解菊花清熱解毒功效的作用機制，利用STRING數據庫構建了菊花PPI網絡，結果表明，PPI網絡包括244個節(jié)點，946條相互關系，去掉無相互關系的35個節(jié)點，其余209個節(jié)點利用Cytoscape 3.7.1軟件繪制菊花靶點PPI網絡如圖5所示。節(jié)點Degree值≥10的節(jié)點共72個，為菊花的核心靶點，其中JUN、TP53、AKT1、MAPK3、MAPK1、RELA、TNF、HSP90AA1、IL6等出現頻率較高，根據Degree值大小繪制Degree值≥20的核心蛋白質節(jié)點的條形圖（圖6）。核心靶點中共包含11個炎癥相關靶點（TNF、IL1B、IL6、NOS2、CCL2、CXCL8、IL10、AKT1、VEGFA、MMP9、CXCL2），這些靶點蛋白在菊花清熱解毒功效中起到關鍵作用。

圖5 菊花靶點PPI網絡

2.4 靶點定位分析與歸經理論的相關性分析

圖6 菊花核心靶點（Degree值≥20）

利用BIOGPS數據庫對主要靶點（Degree值≥20）定位分析，保留每個基因表達量最高的排在前5位的組織，利用Cytoscape軟件繪制靶點-組織網絡圖（圖7），圖中節(jié)點大小與Degree值一致。結果表明，這些靶點主要分布在肺（Lung，Degree值=6），平滑?。⊿mooth muscle，Degree值=4），肝臟（Liver，De?gree值=3），扁桃體（Amygdala，Degree值=3），甲狀腺（Thyroid，Degree值=3），前列腺（Prostate，Degree值=3），該結果與菊花歸肺、肝經一致，這些組織器官在菊花清熱解毒功效中發(fā)揮重要作用。此外，CD33+髓樣細胞（CD33+Myeloid，Degree值=9），伯基特淋巴瘤（Lymphoma burkitts，Degree值=6）、心肌細胞（Cardiacmyocytes，Degree值=5）（CD56+NK Cells，Degree值=4）BDCA4+樹突狀細胞（BDCA4+Dentrit?ic Cells，Degree值=4），CD14+單 核 細 胞（CD14+Monocytes，Degree值=4），721 B淋巴母細胞（721 B lymphoblasts，Degree值=4）等細胞發(fā)揮重要的作用。

圖7 菊花靶點-歸經網絡

3 討論

利用系統(tǒng)藥理學分析了菊花清熱解毒功效的分子機制，以口服生物利用度（OB）與類藥性（DL）為指標通過TCMSP與Drugbank數據庫篩選出菊花中符合條件的化合物，建立備選化合物庫。結果表明，菊花主要通過槲皮素、山奈酚、木犀草素、柚皮素、β-谷甾醇等化合物發(fā)揮清熱解毒作用?，F代藥理學研究表明，菊花中作用最強的前5個化合物在抗炎、抗菌中起到不同程度的作用。槲皮素能明顯抑制大鼠急慢性前列腺炎模型與急性痛風性關節(jié)炎模型炎癥［9，10］，具有廣譜抗菌活性，對金黃色葡萄球菌、膠質芽孢桿菌、大腸桿菌、蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌均有明顯的抗菌效果［11］。山奈酚可通過MAPK等信號通路減輕脂多糖誘導的急性肺炎［12］，抑制氣道炎癥［13］。木犀草素能夠降低炎癥因子轉錄調節(jié)因子的活性，抑制IL6等各類促炎因子和炎癥介質的產生，改善氣道炎癥［14］。β-谷甾醇可以抑制肺炎鏈球菌溶菌素對細胞侵染，通過抑制STAT1的產生及NF-κB的核轉移發(fā)揮抗炎作用［15］。柚皮素對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有較好的抑菌作用［16，17］，可通過抑制炎癥細胞浸潤、炎癥介質釋放、iNOS活性等發(fā)揮抗炎作用［18，19］。通過化合物-關鍵靶點-疾病網絡分析發(fā)現菊花關鍵靶點主要與炎癥、壞死等疾病相關，如菊花關鍵靶點前列腺素G/H合酶2為體溫調節(jié)介質前列腺素合成的關鍵酶，可通過干預前列腺素E2的合成，參與機體發(fā)熱與炎癥等的調節(jié)［20］。以上分析說明，菊花的清熱解毒功效與其成分槲皮素、山奈酚、木犀草素、柚皮素、β-谷甾醇等化合物等干預炎癥、壞死過程，發(fā)揮抗炎抗菌作用有關。

KEGG通路分析結果顯示，菊花靶點主要作用于炎癥信號通路（TNF signaling pathway）和免疫相關信號通路（Influenza A、Hepatitis B、Toxoplasmosis、Leishmaniasis、HTLV-I infection），其中靶點AKT1、TP53、MAPK3、MAPK1等在通路中出現次數較高，在PPI網絡中發(fā)現這些靶點為菊花作用的核心蛋白質。AKT1與核心蛋白質TNF、IL6、NOS2、MMP9均為炎癥相關靶點，是菊花抗炎發(fā)揮清熱解毒功效的重要靶蛋白。AKT1為致癌基因，是AKT家族的重要一員，在增殖、凋亡等細胞進程及炎癥反應中發(fā)揮重要作用［21，22］。菊花可能是通過抑制AKT磷酸化減少炎性因子IL6、TNFα的釋放，緩解機體的炎癥反應。一氧化氮（NO）為重要的炎癥介質［23］，菊花可能是通過作用于靶點NOS2，抑制NO的影響，張星海［3］證實菊花提取液干預炎癥小鼠后炎癥癥狀明顯改善，血清中NO顯著降低。菊花還可能是通過調控MMP9的表達，改善炎癥臨床表現發(fā)揮清熱解毒功效的抗炎機制［24］。通過靶點定位分析發(fā)現，菊花主要靶點分布于肺臟與肝臟，與菊花歸經一致，這可能是菊花有效治療熱毒引起的目赤、風熱證的原因之一。綜上所述，菊花清熱解毒的功效可能與槲皮素、山奈酚、木犀草素、柚皮素、β-谷甾醇等化合物作用AKT1、TNF、IL6、NOS2、MMP9等核心靶點，調控炎癥和免疫相關信號通路，抑制炎癥反應有關，菊花清熱解毒的物質基礎與分子機制的確定還需通過生物學實驗進一步的研究與驗證。