門(mén)美福，盧家成，張 鑫，信建豪

（黃河科技學(xué)院，a.醫(yī)學(xué)院；b.工學(xué)部，鄭州 450000）

紫甘藍(lán)俗稱(chēng)紫包菜，為十字花科蕓苔屬甘藍(lán)種的一個(gè)變種。中國(guó)紫甘藍(lán)資源豐富，全國(guó)各地均有分布，且產(chǎn)量大，產(chǎn)量可達(dá)37.5～60.0 t/hm2。開(kāi)發(fā)紫甘藍(lán)中的花青素及相關(guān)產(chǎn)品，有利于促進(jìn)農(nóng)產(chǎn)品的合理利用，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品市場(chǎng)的調(diào)節(jié)具有重要意義。花青素是天然色素的一種，具有抗腫瘤［1，2］、抗氧化［3，4］、預(yù)防老年?。?］、降血脂［6］等生物活性，又可作為食品添加劑中的天然色素，具有安全性高、色澤自然鮮艷等特點(diǎn)［7-9］。

目前，花青素的提取工藝研究常用的有溶劑提取法［10］、柱色譜法［11］、超聲輔助提?。?2，13］、酶法［14，15］、溶劑提取法［16］、離子液體提取法［17］、微波輔助提取法［18，19］等。這些工藝中，由于花青素與紫甘藍(lán)的纖維組織結(jié)合較緊密，不容易溶出，直接溶劑提取則提取率較低，且污染性較強(qiáng)，因此，采用果膠酶對(duì)纖維組織進(jìn)行分解，可提高提取率。微波輔助能夠使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞程度更加充分，使提取耗時(shí)更短，耗能更低，更能提高提取效果。

本研究通過(guò)酶解-微波輔助法對(duì)紫甘藍(lán)中花青素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，采用微波使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞，以果膠酶降解，并將有機(jī)溶劑替換為十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液，形成了微波-酶解法提取工藝，以期為紫甘藍(lán)中花青素的提取提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫甘藍(lán)：市售，產(chǎn)地鄭州；果膠酶、無(wú)水乙醇、鹽酸、磷酸氫二鉀、檸檬酸、十二烷基硫酸鈉（SDS）等均為分析純（AR級(jí)）。

TU-1810PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-2（金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠）；立鶴牌101A系列電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（山東濰坊精鷹醫(yī)療器械有限公司）；PHS-3C型酸度計(jì)（上海理達(dá)儀器廠）；FA2004型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；TL80-1型醫(yī)用離心機(jī)（濟(jì)南格利特科技有限公司）；MCR-3型微波化學(xué)反應(yīng)器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取工藝 稱(chēng)取一定量的紫甘藍(lán)60℃干燥24 h→粉碎→提取→酶解+微波→400 r/min離心30 min→取上清液測(cè)定吸光度。

1.2.2 單因素試驗(yàn) 稱(chēng)取一定量的紫甘藍(lán)干燥粉末于錐形瓶?jī)?nèi)，加入調(diào)節(jié)pH后的提取劑，并加入果膠酶反應(yīng)一段時(shí)間后，置于微波反應(yīng)器中，在微波作用下進(jìn)行浸提，再將溶液離心，取部分上清液，在最佳波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以酶解pH、加酶量、料液比、酶解時(shí)間、提取劑、溫度、微波時(shí)間、微波功率為考察因素，選擇最佳條件。

1）pH的選擇。稱(chēng)取等量每份1.0 g紫甘藍(lán)干粉，以SDS為提取劑，以吸光度為指標(biāo)，固定料液比1∶15（g∶mL，下同），加酶量1.1%，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間60 min，微波功率360 W，微波時(shí)間4 min。設(shè)置酶解pH梯度為3、4、5、6、7、8，考察酶解pH對(duì)紫甘藍(lán)中花青素提取的影響。

2）酶解溫度的選擇。固定料液比1∶15，加酶量1.1%，酶解時(shí)間60 min，pH 7.0，微波功率360 W，微波時(shí)間4 min。設(shè)置酶解溫度梯度為20、30、40、50、60℃，考察酶解溫度對(duì)紫甘藍(lán)花青素提取的影響。

3）加酶量的選擇。固定料液比1∶15，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間60 min，pH 7.0，微波功率360 W，微波時(shí)間4 min。加酶量梯度設(shè)置為0.3%、0.7%、1.1%、1.5%、1.9%，考察加酶量對(duì)紫甘藍(lán)中花青素提取的影響。

4）料液比的選擇。在酶量1.1%、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間60 min、pH 7.0、微波功率360 W、微波時(shí)間4 min的條件下料液比梯度設(shè)置為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶45，考察料液比對(duì)紫甘藍(lán)中花青素提取的影響。

5）酶解時(shí)間的選擇。固定料液比1∶15，加酶量1.1%，酶解溫度50℃，pH 7.0，微波功率360 W，微波時(shí)間4 min。在酶解時(shí)間設(shè)置為20、40、60、80、100 min，考察酶解時(shí)間對(duì)紫甘藍(lán)中花青素提取的影響。

6）微波時(shí)間的選擇。固定料液比1∶15，加酶量1.1%，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間60 min，pH 7.0，微波功率360 W，考察微波時(shí)間（1、2、3、4、5、6 min）對(duì)提取效果的影響。

7）微波功率的選擇。固定其他條件，考察微波功率（90、180、270、360、450 W）對(duì)提取效果的影響。1.2.3 正交試驗(yàn) 在微波輔助及酶解法單因素試驗(yàn)下，以紫甘藍(lán)花青素提取率為指標(biāo)，采用L1（837）正交試驗(yàn)優(yōu)化提取條件，因素及水平見(jiàn)表1。

表1 微波-酶解法正交試驗(yàn)因素和水平

1.2.4 提取劑的選擇 將紫甘藍(lán)晾干，于60℃恒溫干燥箱干燥24 h；取等量干燥粉碎紫甘藍(lán)，分別置于燒杯中，固定料液比1∶15，加酶量1.1%，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間60 min，pH 7.0，微波功率360 W，微波時(shí)間4 min。分別選擇乙醇、SDS作為提取劑，乙醇體積分?jǐn)?shù)梯度設(shè)置為40%、45%、50%、55%、60%、65%，十二烷基硫酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)置梯度為0.08%、0.1%、0.12%、0.14%、0.16%、0.18%，酶解、微波后于波長(zhǎng)531 nm處測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大波長(zhǎng)的選擇

通過(guò)紫外可見(jiàn)掃描，紫甘藍(lán)花青素在紫外區(qū)280 nm附近、可見(jiàn)光區(qū)500～550 nm存在最大吸收，但280 nm附近干擾物質(zhì)較多，為減小誤差，采用531 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2 提取劑的選擇

由圖1可知，在不同提取劑的選擇中，乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%、SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%時(shí)效果最佳，且SDS溶液得到的提取率大于乙醇溶液，同時(shí)不存在有機(jī)物殘留，則選擇0.12%SDS溶液作為提取劑。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 pH的選擇 由圖2可知，酶解pH為7時(shí)，紫甘藍(lán)花青素提取效果最好，因此，pH適宜控制在7左右。

2.3.2 酶解溫度的選擇 由圖3可知，在30～60℃，紫甘藍(lán)花青素提取效率在50℃時(shí)達(dá)到最大，大于50℃提取率有所下降。原因可能是溫度升高酶的活性增強(qiáng)，但溫度超過(guò)50℃后酶可能有部分失活現(xiàn)象發(fā)生，因此，50℃為最適提取溫度。

圖2 酶解p H對(duì)紫甘藍(lán)中花青素提取的影響

圖1 提取劑選擇試驗(yàn)結(jié)果

圖3 酶解溫度對(duì)紫甘藍(lán)中花青素提取的影響

2.3.3 酶量的選擇 由圖4可知，加酶量在0.3%～1.1%時(shí)，紫甘藍(lán)中花青素提取效率呈增加趨勢(shì)，加酶量大于1.1%后隨酶量的增加，提取效率降低。原因可能是酶量過(guò)大，與細(xì)胞壁產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)性作用，使提取率稍有降低，因此，選取加酶量為1.1%。

2.3.4 料液比的選擇 由圖5可知，隨著料液比的變化，紫甘藍(lán)中花青素提取效率呈先上升后降低的趨勢(shì)。綜合考慮，選取料液比為1∶15。

圖4 加酶量對(duì)紫甘藍(lán)中花青素提取的影響

圖5 料液比對(duì)紫甘藍(lán)中花青素提取的影響

2.3.5 酶解時(shí)間的選擇 由圖6可知，隨酶解時(shí)間增加，紫甘藍(lán)中花青素提取效率先增加后稍有降低，在60 min時(shí)酶解完全，因此，選擇酶解時(shí)間為60 min。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)紫甘藍(lán)中花青素提取的影響

2.3.6 微波時(shí)間的選擇 由圖7可知，微波4 min時(shí)紫甘藍(lán)中花青素提取效果最佳，因此，微波時(shí)間選擇4 min。

圖7 微波時(shí)間選擇對(duì)紫甘藍(lán)中花青素提取的影響

2.3.7 微波功率的選擇 由圖8可知，隨著微波功率的加大，吸光度增大，提取效果更好。但微波功率超過(guò)360 W時(shí)，溶液暴沸現(xiàn)象較易發(fā)生，因此，微波功率選擇360 W。

2.4 正交試驗(yàn)

圖8 微波功率選擇對(duì)紫甘藍(lán)中花青素提取的影響

采用“1.2.3”的方法，對(duì)溫度、加酶量、料液比、pH、微波功率、酶解時(shí)間和微波時(shí)間7個(gè)因素作為影響因子，以花青素含量為指標(biāo)，通過(guò)L1（837）正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

從表2和表3可知，微波-酶解法中的7個(gè)影響因子對(duì)紫甘藍(lán)花青素提取的影響都不顯著，而料液比影響較大，其最佳工藝為溫度50℃，加酶量1.1%，料液比1∶15，pH 7，微波功率360 W，酶解時(shí)間60 min，微波時(shí)間3 min，其主次因素影響順序?yàn)榱弦罕龋緋H＞酶解時(shí)間＞加酶量＞微波時(shí)間＞微波功率＞溫度。

表2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

2.5 工藝驗(yàn)證及結(jié)果

正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)與單因素試驗(yàn)中最佳微波時(shí)間不同，所以對(duì)上述正交試驗(yàn)所得的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，即設(shè)置試驗(yàn)條件為溫度50℃，加酶量1.1%，料液比1∶15，pH 7，微波功率360 W，酶解時(shí)間60 min，微波時(shí)間3 min。在此條件下，進(jìn)行5組平行試驗(yàn)，結(jié)果平均值為1.216 mg/g，RSD為6.34%，較單因素試驗(yàn)中的結(jié)果1.124 mg/g（微波時(shí)間為4 min，其他因素相同）更佳，故選擇上述為最佳提取條件。

表3 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果方差分析

3 小結(jié)

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)果表明，微波-酶解法提取紫甘藍(lán)中花青素的最佳工藝為溫度50℃，加酶量1.1%，料液比1∶15，pH 7，微波功率360 W，酶解時(shí)間60 min，微波時(shí)間3 min。本研究中酶解法最大提取率為1.216 mg/g，高于單用酶法或微波法的結(jié)果，因此該方法可以提高紫甘藍(lán)中花青素的提取效果，為農(nóng)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用增產(chǎn)增效。