韓 俊，沈雪梅，龍光強(qiáng)，余 珊，楊丕瓊，張峪榕

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；2.昆明市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，昆明 650034）

通關(guān)藤［Marsdenia tenacissima（Roxb.）Wight et Arn］為蘿藦科牛奶藤屬多年生攀援木質(zhì)藤木植物，廣泛分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)的云南、廣東、福建、臺(tái)灣、貴州等地［1］。通關(guān)藤始載于《滇南本草》，其味苦，性微甘，具有消炎止痛、清熱解毒、止咳平喘、降壓、保肝、抗癌等功效［2，3］。通關(guān)藤中含有機(jī)酸、多糖、生物堿、樹脂、色素及甾體苷等多種化學(xué)成分，其中C21甾體類是其主要化學(xué)成分，被現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為是具有抗腫瘤作用的主要活性物［4，5］。臨床采用通關(guān)藤總苷片、通光素、通關(guān)藤苷元甲治療慢性氣管炎［5］。目前，通關(guān)藤在食管癌、宮頸癌、急性白血病等多種病癥的治療方面也具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［6，7］。

隨著近年來對(duì)通關(guān)藤的開發(fā)利用，以通關(guān)藤為原料制成的消癌平口服液、注射液、顆粒劑、膠囊等中成藥被廣泛應(yīng)用于臨床，對(duì)胃癌、肝癌、肺癌、食管癌等各類惡性腫瘤療效較顯著［8-10］，同時(shí)科研人員對(duì)藥用植物通關(guān)藤的關(guān)注度倍增。研究工作多集中在原植物考證、生物學(xué)特性、地理分布特點(diǎn)、野生資源及野外生境、無性繁殖、有性繁殖、抗性研究、化學(xué)成分分析及方法和臨床藥理學(xué)等方面，而從通關(guān)藤的產(chǎn)量和質(zhì)量研究其最佳采收期的報(bào)道較少。

中藥材的種類繁多，用藥部位也有所不同，對(duì)應(yīng)的最佳采收時(shí)間也不同，最佳采收時(shí)間是針對(duì)藥材的質(zhì)量和產(chǎn)量而言的。中藥材質(zhì)量的好壞，一方面是由本身所積累的產(chǎn)量所影響；另一方面取決于有效成分含量的高低。所以，中藥材的最佳采收期應(yīng)在產(chǎn)量和有效成分含量相對(duì)較高的時(shí)期。一般來說，植物沒有生長(zhǎng)成熟，產(chǎn)量較低，有效成分積累還沒達(dá)到頂峰，自然用藥效果也就不理想，若超過了中藥材的成熟期，造成人力、物力和財(cái)力浪費(fèi)的同時(shí)，有效成分含量也會(huì)逐漸降低，直接影響藥物的臨床療效。因此，為了合理利用通關(guān)藤，尋找其最佳采收期就顯得至關(guān)重要。

本試驗(yàn)研究不同生長(zhǎng)期通關(guān)藤的莖粗和莖長(zhǎng)，分析其產(chǎn)量的變化；測(cè)定不同生長(zhǎng)期通關(guān)藤總皂苷的含量，通過產(chǎn)量和質(zhì)量變化來確定通關(guān)藤的最佳采收時(shí)期，以期為通關(guān)藤的生產(chǎn)和臨床合理用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

DZF-6050B真空干燥箱（上海恒科學(xué)儀器有限公司）、家用小型粉碎機(jī)、梅特勒-托利多萬分之一電子天平、超聲波儀器（FS-550T，功率550 W，頻率50 Hz）、CARY 60 UV-Vis紫外分光光度計(jì)［安捷倫科技（中國）有限公司］、HH-S型恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限公司）、電子數(shù)顯卡尺等。

1.2 材料與試劑

試驗(yàn)所用對(duì)照品通關(guān)藤苷G［11，12］購于云南云科生物技術(shù)有限公司（編號(hào)PR1371，純度大于98%）；不同生長(zhǎng)期的通關(guān)藤試驗(yàn)材料由云南信通植物藥業(yè)有限公司通關(guān)藤規(guī)范化種植（GAP）良種繁育與示范基地提供，從基地取不同生長(zhǎng)期（一年生、一年半生、兩年生、兩年半生、三年生、三年半生、四年生）通關(guān)藤的莖烘干粉碎備用。冰乙酸、香草醛、濃硫酸、97.5%乙醇、濃度5%香草醛-冰醋酸溶液均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 通關(guān)藤總皂苷含量測(cè)定

1）對(duì)照品溶液的制備。取通關(guān)藤苷G 1 mg，置于10 mL錐形瓶中，精密加入4.25 mL乙醇使其完全溶解，制成濃度為0.24 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2）最佳供試品溶液提取方法的確定。采用4個(gè)因子，每個(gè)因子3個(gè)水平，共9個(gè)處理的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L（934）。以四年生通關(guān)藤為試驗(yàn)材料，采用超聲波提取方法，提取時(shí)間為30、40、50 min 3個(gè)水平；提取溫度為40、50、60℃3個(gè)水平；提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、70%、80%3個(gè)水平；料液比為1∶20、1∶30、1∶40（mg∶mL，下同）3個(gè)水平，探究超聲提取時(shí)間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比對(duì)通關(guān)藤總皂苷提取的影響。

1.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取通關(guān)藤粉末0.2 g，置于10 mL具塞試管中，精密加入60%乙醇4 mL，超聲提取時(shí)間50 min，提取溫度60℃，超聲結(jié)束后取出靜置15 min，取上清液備用。

1.3.3 空白對(duì)照溶液的制備 不加通關(guān)藤藥材，按照“1.3.2”的方法制備空白對(duì)照溶液。

1.3.4 樣品的測(cè)定 精密量取供試品上清液各0.5 mL，分別置于10 mL具塞試管中，于60℃水浴上揮干甲醇，加入香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL和濃硫酸溶液0.6 mL，搖勻，70℃水浴加熱15 min，取出后立即用流水冷卻，加入10 mL冰醋酸稀釋。以不加樣品溶液為空白。采用紫外-可見分光光度法在462 nm處測(cè)定吸光度，同法測(cè)定對(duì)照樣品的吸光度，計(jì)算含量即得。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 精密吸取制備的通關(guān)藤苷G對(duì)照品溶液（濃度0.24 mg/mL）0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 mL置于10 mL具塞試管中，按照“1.3.4”的方法進(jìn)行操作，在波長(zhǎng)為462 nm處測(cè)定吸光度，以3次測(cè)定吸光度的平均值作為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（X為對(duì)照樣品含量，Y為吸光度）。回歸方程為Y=1.609 5X+0.024 9，r=0.999 4，呈良好的線性關(guān)系。

1.3.6 精密度試驗(yàn) 按“1.3.2”的方法制備5份供試品溶液，并按照“1.3.4”的方法進(jìn)行操作。結(jié)果顯示，RSD為1.37%，小于2.00%，精密度符合規(guī)定。

1.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液，按“1.3.4”的方法進(jìn)行操作，分別在0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，在462 nm下測(cè)定吸光度，RSD為1.69%，說明供試品溶液顯色后在3.0 h內(nèi)待測(cè)定組分化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

1.3.8 回收率試驗(yàn) 精密稱取0.1g已知含量的云南產(chǎn)通關(guān)藤藥材6份，分別加入對(duì)照樣品，按樣品含量的1/2加入，按“1.3.4”的方法制備供試品溶液，測(cè)定吸光度，并計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為99.63%，RSD為1.46%。

1.3.9 樣品總皂苷含量的測(cè)定 精密稱取半年生、一年生、一年半生、兩年生、兩年半生、三年生、三年半生、四年生的8個(gè)生長(zhǎng)期藥材各0.2 g，按“1.3.2”和“1.3.4”的方法進(jìn)行操作，在462 nm處測(cè)定樣品吸光度，同法測(cè)定對(duì)照品吸光度。再利用回歸方程將吸光度代入，計(jì)算出通關(guān)藤總皂苷含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件對(duì)通關(guān)藤總皂苷提取率的影響

經(jīng)LSR差異顯著性檢驗(yàn)表明（表1），處理3通關(guān)藤總皂苷提取率最高，達(dá)到6.412 6%，與處理4、5差異達(dá)顯著水平，與處理1、2、6、8、9差異達(dá)極顯著水平。表明采用超聲波提取通關(guān)藤總皂苷溶液的最佳提取條件是提取溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比為1∶40，提取時(shí)間為50 min，提取溫度為60℃。

表1 提取條件對(duì)通關(guān)藤總皂苷提取率的影響（n=9）

2.2 通關(guān)藤總皂苷含量的測(cè)定

由表2可以看出，兩年生通關(guān)藤總皂苷含量為7.400 2%，與其他生長(zhǎng)期總皂苷含量存在極顯著差異：兩年半生通關(guān)藤總皂苷含量為7.160 2%，與三年半生、四年生通關(guān)藤總皂苷含量也存在極顯著差異，最低的為半年生通關(guān)藤莖中總皂苷含量。通關(guān)藤總皂苷含量在兩年生至兩年半生時(shí)期相對(duì)較高、較穩(wěn)定，之后緩慢下降。不同生長(zhǎng)期通關(guān)藤總皂苷含量大小順序?yàn)閮赡晟緝赡臧肷救晟救臧肷舅哪晟疽荒臧肷疽荒晟景肽晟?/p>

表2 通關(guān)藤總皂苷含量測(cè)定結(jié)果

2.3 不同生長(zhǎng)期通關(guān)藤莖長(zhǎng)和莖粗的測(cè)定

通關(guān)藤藥用部分是藤莖，呈扁柱圓形，略扭曲。莖類藥材的產(chǎn)量主要取決于莖粗和莖長(zhǎng)，莖越長(zhǎng)越粗，莖的質(zhì)量就越大，產(chǎn)量就越高，因此莖類藥材產(chǎn)量與其莖長(zhǎng)和莖粗呈正相關(guān)。測(cè)定材料通關(guān)藤種植時(shí)間在2016年5月，種植土地呈48°，向陽坡。種植行間距為2.0 m×0.5 m，田間水肥管理相同。以8個(gè)不同生長(zhǎng)期通關(guān)藤作為調(diào)查對(duì)象，田間試驗(yàn)抽樣采用五點(diǎn)式抽樣法，對(duì)抽中的植株進(jìn)行掛牌，每年的11月和5月分別測(cè)定2次，測(cè)量莖長(zhǎng)和莖粗。

結(jié)果（表3）表明，通關(guān)藤的莖長(zhǎng)生長(zhǎng)到三年時(shí)較之前的莖長(zhǎng)差異達(dá)極顯著水平，之后增長(zhǎng)緩慢。通關(guān)藤的莖粗生長(zhǎng)到三年半以后較之前的莖粗差異達(dá)極顯著水平，以后也是緩慢增粗。因此，從通關(guān)藤的莖長(zhǎng)和莖粗來看，到三年時(shí)進(jìn)行采收，產(chǎn)量最大。

表3 不同生長(zhǎng)期通關(guān)藤的莖長(zhǎng)和莖粗

3 小結(jié)與討論

3.1 通關(guān)藤總皂苷含量測(cè)定

以正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用超聲波法提取通關(guān)藤總皂苷，試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過統(tǒng)計(jì)分析，確定最佳的提取條件。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)相對(duì)較低（60%）時(shí)，只要相對(duì)增加提取的溫度（60℃）和時(shí)間（50 min），就能增加總皂苷的提取率（6.412 6%）；或者適當(dāng)增加乙醇的體積分?jǐn)?shù)（80%），即使降低提取溫度（40℃），也可以保持較高的提取率（6.266 2%），能在較短時(shí)間和較低溫度下提取率比傳統(tǒng)的回流提取工藝明顯提高［13］。分析其原因，可能是因?yàn)槌暡艽偈怪参锛?xì)胞組織產(chǎn)生破壁或變形，使中藥材有效成分充分溶解出來。

中藥材的種類繁多，用藥部位也有所不同，對(duì)應(yīng)的最佳采收時(shí)間也不同。采收的時(shí)間是否恰當(dāng)，會(huì)直接影響其臨床療效。最佳的采收時(shí)間是針對(duì)藥材的質(zhì)量和產(chǎn)量而言的。中藥材質(zhì)量的好壞，一方面是由本身所積累的產(chǎn)量所決定；另一方面取決于有效成分含量的高低。所以，中藥材的最佳采收期應(yīng)在產(chǎn)量和有效期含量相對(duì)較高的時(shí)期。總皂苷屬于次生代謝產(chǎn)物，植物需要生長(zhǎng)一定的時(shí)間進(jìn)行積累［14］，試驗(yàn)結(jié)果顯示通關(guān)藤總皂苷在兩年生時(shí)含量達(dá)到最高，之后緩慢下降。

試驗(yàn)結(jié)果表明，8個(gè)不同生長(zhǎng)期通關(guān)藤總皂苷含量隨著植株不斷的生長(zhǎng)，呈先增后減的趨勢(shì)，存在極顯著差異。通關(guān)藤整個(gè)生長(zhǎng)期中總皂苷含量在兩年以前含量增加很快，從半年生總皂苷含量的3.268 9%到兩年生達(dá)到最高，含量為7.400 2%，在兩年生到兩年半生（總皂苷含量為7.160 2%）之間維持一個(gè)較高的水平，之后逐漸緩慢下降。

3.2 通關(guān)藤的產(chǎn)量

對(duì)于不同生長(zhǎng)期通關(guān)藤的莖長(zhǎng)和莖粗的測(cè)定，采取順序抽樣法中的五點(diǎn)式抽樣方法，此方法操作簡(jiǎn)單，能使抽樣單位在試驗(yàn)小區(qū)中均勻分布，樣本具有代表性，一般情況下這種抽樣方法存在的誤差較小。但若存在趨勢(shì)變異，可能出現(xiàn)偏差，而且難以無偏估計(jì)抽樣誤差。所以要在抽樣樣本個(gè)體性狀表現(xiàn)一致時(shí)，再采用順序抽樣法進(jìn)行抽樣。

不同生長(zhǎng)期通關(guān)藤的莖粗和莖長(zhǎng)隨年份的增長(zhǎng)而增加，通關(guān)藤藥用部分是藤莖，莖長(zhǎng)和莖粗決定著產(chǎn)量的高低。通關(guān)藤的莖長(zhǎng)從三年生、三年半生、四年生都與之前存在極顯著差異，以后緩慢生長(zhǎng)；通關(guān)藤的莖粗生長(zhǎng)到三年半就達(dá)到極顯著差異，以后也是緩慢增粗。因此，從通關(guān)藤的莖長(zhǎng)和莖粗來看，通關(guān)藤生長(zhǎng)到三年時(shí)繼續(xù)種植，雖然生物產(chǎn)量會(huì)有所增大，但增加不顯著，所以通關(guān)藤生長(zhǎng)到三年時(shí)進(jìn)行采收，可以節(jié)約大量的人力、物力和財(cái)力。

3.3 小結(jié)

根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果分析得出，通關(guān)藤的產(chǎn)量到三年生時(shí)增長(zhǎng)明顯，產(chǎn)量也相對(duì)較高。而通關(guān)藤總皂苷含量最高的為兩年生，之后逐漸緩慢下降。所以考慮到兼顧通關(guān)藤的產(chǎn)量與總皂苷含量都達(dá)到相對(duì)較高水平，確定最佳采收時(shí)間為兩年生至三年生的通關(guān)藤莖，該結(jié)論可為通關(guān)藤臨床用藥提供理論依據(jù)。