王洪博， 蔡景竹， 麻文婕

(1.河北省胸科醫(yī)院， 河北 石家莊 050041； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 河北 保定 071000)

0 引言

【研究意義】知母屬百合科多年生植物[1]，是常用的大宗中藥材。知母的藥用價(jià)值較高，具有清熱瀉火、滋陰潤(rùn)燥等功效，可用于治療外感熱病、肺熱燥咳及內(nèi)熱消渴等癥狀[2-3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，知母的市場(chǎng)需求量不斷增加，野生知母資源日趨匱乏，因此，人工栽培知母在市場(chǎng)中的占比逐漸升高[4]。知母與大田作物一樣，合理的種植方式是其量產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的基礎(chǔ)[5]。知母的外觀性狀，如分蘗、株高、直徑粗細(xì)等植株外觀形態(tài)影響知母的藥用有效成分(如芒果苷含量和知母皂苷BⅡ)含量，從而影響其市場(chǎng)價(jià)格[6-8]。河北省張家口蔚縣地形以丘陵、山地為主，全年干旱少雨，氣候條件非常適宜知母的生長(zhǎng)[9-10]?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，由于人為濫采等原因，知母資源受到嚴(yán)重破壞。如何保護(hù)知母資源，合理開發(fā)和提高種植產(chǎn)質(zhì)量已成為十分迫切的問題?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用單因素試驗(yàn)和雙因素試驗(yàn)研究不同繁殖方式、不同種植密度及不同基肥配比對(duì)知母生長(zhǎng)指標(biāo)和有效活性成分含量的影響，明確林下套種知母的生長(zhǎng)特性及活性成分含量變化規(guī)律，尋找一種既省時(shí)省力又有效增收，同時(shí)又不破壞傳統(tǒng)杏產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新途徑，為當(dāng)?shù)刂傅母弋a(chǎn)優(yōu)質(zhì)規(guī)范化栽培，穩(wěn)定脫貧及后續(xù)可持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)支撐[11-12]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)在河北省張家口蔚縣北水泉鎮(zhèn)細(xì)弦子村進(jìn)行。當(dāng)?shù)馗珊瞪儆?，無灌溉設(shè)備，土壤pH 7.64，沙質(zhì)土壤，有機(jī)質(zhì)含量為15.35 mg/kg。

1.2 材料

1.2.1 知母 知母種子及2年生植株，由蔚縣惠農(nóng)中藥材合作社提供。

1.2.2 試劑 知母皂苷BⅡ標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)20191221A)，純度≥98.00%；芒果苷標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)2019122101C)，純度≥98.00%，均為江萊生物科技有限公司生產(chǎn)；超純水、乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)和冰醋酸(分析純)，市購。

1.2.3 肥料 氮磷鉀復(fù)合肥(下稱復(fù)合肥)，N∶P2O5∶K2O=15∶15∶15，購自歐化肥料科技有限公司；農(nóng)家糞和豬糞，均來自河北博貞農(nóng)家樂。

1.2.4 設(shè)備 SHIMADZU LC-15C高效液相色譜儀，沈陽益海大通儀器設(shè)備有限公司；ZORBAX Eclipse Plus色譜柱，濟(jì)南賽暢科學(xué)儀器有限公司；OM-2000CT超聲波提取機(jī)，上海歐蒙實(shí)業(yè)有限公司；DKZ-2電熱恒溫振蕩水槽，上海雙旭電子有限公司；FA1004電子天平，常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)預(yù)處理 1) 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取知母皂苷BⅡ標(biāo)準(zhǔn)品和芒果苷標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g，用50%甲醇水溶液稀釋成濃度為1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。2) 種子萌發(fā)。查閱資料[13-17]顯示，正常情況下知母種子發(fā)芽率僅為40%～50%，在播種前幾天，將種子放入60℃溫水中浸泡10 h左右，然后晾干表皮水分，與2倍的濕潤(rùn)細(xì)沙攪拌均勻，其上蓋細(xì)砂，再用地膜覆蓋，周圍用土壓緊，當(dāng)多數(shù)種子露白時(shí)，再取出播種。此方法可以提高種子的出苗率。3) 種苗培育。2年生知母種苗于2018年春天播種及分株，2019年6月作移栽秧苗備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 將配制的知母皂苷BⅡ和芒果苷標(biāo)準(zhǔn)溶液用50%甲醇水溶液稀釋制成濃度為10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L和100 mg/L的溶液，采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定各濃度對(duì)應(yīng)的峰面積。根據(jù)芒果苷和知母皂苷BⅡ的濃度(x)與峰面積(y)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，采用外標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算。

1.3.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 2019年6月，選4塊土質(zhì)條件基本一致的杏林田地，面積均為3 m×24 m，其中，2塊地用于不同基肥試驗(yàn)，另外2塊地用做移栽密度試驗(yàn)，以篩選出最佳種植方式。

1) 不同播種方式對(duì)知母出苗率的影響。采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)2個(gè)處理，Z1，種子繁殖；Z2，分株繁殖。各播種300粒(株)，采用翻埋方式栽培，翻埋深度30 cm。

2) 不同基肥對(duì)知母生長(zhǎng)和有效活性成分含量的影響。采用雙因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，肥料種類(A)：A1，復(fù)合肥+農(nóng)家肥；A2，復(fù)合肥+豬糞。施肥量(B)：B1，復(fù)合肥 3 700 kg/hm2；B2，復(fù)合肥3 700 kg/hm2+農(nóng)家/豬糞200 kg/hm2；B3，復(fù)合肥7 450 kg/hm2+農(nóng)家/豬糞470 kg/hm2。以單施農(nóng)家肥200 kg/hm2為對(duì)照(CK)。

3) 不同移栽密度對(duì)知母生長(zhǎng)和有效活性成分含量的影響。采用雙因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，行距(A)：A1，行距30 cm；A2，寬窄行40 cm/20 cm。株距(B)：B1，株距10 cm；B2，株距20 cm；B3，株距30 cm。

1.3.4 樣品采集及預(yù)處理 于2020年11月在每個(gè)區(qū)域采集具代表性的知母3株，去掉泥沙、須根及地上部分，只保留根莖，然后將其洗凈、干燥并粉碎，各處理樣品混勻備用。

1.3.5 指標(biāo)測(cè)定 1) 知母生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定。分別調(diào)查和測(cè)量各處理知母樣品分蘗數(shù)、株高、根莖及地上部分干重和鮮重、須根干重和鮮重、根莖干重和鮮重等指標(biāo)。2) 活性成分含量測(cè)定。取備用的知母根莖粉末0.1 g，用甲醇溶劑定容至100 mL，采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定知母皂BⅡ含量和芒果苷含量。色譜條件：Shim-pack色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為已腈∶0.4%冰醋酸溶液為50∶50，檢測(cè)波長(zhǎng)為258 nm，柱溫25℃，流速1.0 mL/min。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)各個(gè)指標(biāo)的平均數(shù)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析或顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

芒果苷的標(biāo)準(zhǔn)品曲線方程為y=629.25x+5.841 2(R2=0.999 1)，知母皂苷B的標(biāo)準(zhǔn)品曲線方程為y=1.341 7x+5.416 0(R2=0.999 1)。表明，在工作濃度范圍內(nèi)，芒果苷和知母皂苷BⅡ標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(x)與吸光度(y)存在良好的線性關(guān)系。

2.2 不同播種方式知母的出苗率

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有201粒知母種子出苗，占種子總播種量(300粒)的67%；分株繁殖有222株出苗，出苗率為74%。后續(xù)試驗(yàn)均以分株繁殖方式進(jìn)行栽培。

2.3 不同基肥處理知母的生長(zhǎng)性能與有效活性成分含量

2.3.1 知母的生長(zhǎng)性能 從表1看出，基肥可以提升知母的生長(zhǎng)性能，但不同基肥的影響程度有所不同。

1) 分蘗數(shù)。各施肥處理的分蘗數(shù)為2.37～5.08個(gè)，較CK(2.27個(gè))提高4.41%～123.79%，依次為A2B3>A2B2>A1B2>A1B3>A1B1>A2B1>CK，其中，A2B3的分蘗數(shù)最多，顯著高于其余處理；A2B2其次，為4.53個(gè)，較CK提高99.56%，與除A1B2外的其余處理差異顯著；除A1B1和A2B1外其余處理較CK的增幅均超過60%；A1B1和A2B1顯著低于其余處理。

2) 株高。各施肥處理的株高為66.91～82.80 cm，較CK(62.09 cm)提高7.76%～33.35%，依次為A2B3>A1B3>A1B2>A1B1>A2B2>A2B1>CK，其中，A2B3最高，顯著高于除A1B3和A1B2外的其余處理；A1B3其次，為72.65 cm，較CK提高17.01%，與其余處理差異不顯著；A1B1、A2B2和A2B1較CK的增幅較小，均不足10%。

3) 地上部鮮重。各施肥處理的鮮重為64.50～97.79 g，較CK(57.01 g)增加13.14%～71.53%，依次為A2B3>A2B2>A1B3>A1B1>A1B2>A2B1>CK，其中，A2B3最高，顯著高于其余處理；A2B2其次，為81.33 g，較CK增加42.66%，顯著高于A2B1和CK，與其余處理差異不顯著；A1B2和A2B1較CK的增幅較小，均不足30%，且均與A1B1和CK差異不顯著。

4) 根莖長(zhǎng)度。各施肥處理的根莖長(zhǎng)度為8.26～17.29 cm，較CK(7.11 cm)提高16.17%～143.18%，依次為A2B3>A2B2>A1B2>A2B1>A1B1>A1B3>CK。其中，A2B3最高，顯著高于其余處理；A2B2其次，為13.17 cm，較CK提高85.23%，顯著高于除A2B3外的其余處理；A1B3較CK的增幅較小，不足30%，與其余處理差異顯著，與CK差異不顯著。

5) 根莖最大直徑。各施肥處理的根莖最大直徑為1.02～2.33 cm，A1B1和A2B3較CK(1.38 cm)提高分別下降16.67%和26.09%，其余處理較CK提高5.07%～68.84%，依次為A1B3>A2B2>A2B1>A1B2>CK>A1B1>A2B3，其中，A1B3最大，顯著高于其余處理；A2B2其次，為1.71 cm，較CK提高23.91%，顯著高于A1B1和A2B3；其余處理間差異不顯著；A1B1和A2B3較CK分別降低16.67%和26.09%，二者差異不顯著。

6) 根莖鮮重。各施肥處理的鮮重為20.15～29.51 g，A1B1較CK(20.54 g)下降1.90%，其余處理較CK提高10.13%～43.67%，依次為A2B2>A1B3>A1B2>A2B3>A2B1>CK>A1B1，其中，A2B2最高，顯著高于除A1B3外的其余處理；A1B3其次，為27.54 g，較CK提高34.08%，顯著高于除A1B2外的其余處理；A1B1較CK降低1.90%，二者與A2B1差異不顯著。

綜上，A2B3知母的株高、鮮重和根莖長(zhǎng)度3個(gè)生長(zhǎng)性能指標(biāo)均最高，A1B3略高于A1B2，但與A2B3差距都不大，CK各指標(biāo)均最低。方差分析結(jié)果(表2)表明，基肥種類對(duì)株高、根莖鮮重和分蘗數(shù)的影響存在差異但不顯著；施肥量對(duì)株高的影響不顯著，對(duì)根莖鮮重和分蘗數(shù)的影響分別達(dá)極顯著和顯著水平；基肥種類與施肥量互作對(duì)根莖鮮重的影響達(dá)極顯著水平，對(duì)分蘗數(shù)的影響達(dá)顯著水平。

2.3.2 藥用活性成分的含量 由圖1看出，不同施肥處理知母芒果苷(占知母整棵重量的質(zhì)量比)含量和知母皂苷BⅡ(占知母整棵重量的質(zhì)量比)含量分別為1.01%～1.59%和10.23%～14.56%，均較對(duì)照(0.81%和7.43%)有不同程度的提高，分別依次為A2B2>A2B1>A1B3>A1B2>A1B1>A2B3>CK和A1B2>A1B1>A2B1>A2B2>A1B3>A2B3>CK。其中，芒果苷含量和知母皂苷BⅡ含量均以CK最低，A1B2的芒果苷和知母皂苷BⅡ的含量總體都比較高，行距30 cm，株距20 cm是相對(duì)較好的種植密度。

圖1 不同基肥處理知母的藥用活性成分含量

2.4 不同移栽密度知母的生長(zhǎng)性能及根莖的藥用活性成分含量

2.4.1 知母的生長(zhǎng)性能 從表3看出，不同移栽密度對(duì)知母生長(zhǎng)性能的影響存在差異。

表3 不同移栽密度知母的生長(zhǎng)性能

1) 分蘗數(shù)。各施肥處理的分蘗數(shù)為2.35～4.73個(gè)，A2B3和A2B1分別較CK(3.69個(gè))下降4.88%和36.31%，其余處理較CK提高1.63%～28.18%，依次為A2B2>A1B2>A1B3>A1B1>CK>A2B3>A2B1。其中，A2B2的分蘗數(shù)最多，顯著高于其余處理；A1B2其次，為4.22個(gè)，較CK提高14.36%，與除A1B3外的其余處理差異顯著；A2B1顯著低于其余處理；其余處理差異不顯著。

2) 株高。各施肥處理的株高為65.84～87.45 cm，較CK(64.44 cm)提高2.17%～35.71%，依次為A2B2>A1B2>A2B3>A1B3>A2B1>A1B1>CK，其中，A2B2最高，顯著高于其余處理；A1B2其次，為78.56 cm，較CK提高21.91%，顯著高于除A2B3和A1B3外的其余處理；其余處理間差異不顯著。

3) 地上部鮮重。各施肥處理的鮮重為74.58～93.33 g，較CK(74.58 g)增加0%～25.14%，依次為A2B2>A1B2>A1B3>A2B3>A2B1>A1B1=CK，其中，A2B2和A1B2較高，分別為93.33 g和91.16 g，A1B3和A2B3其次，分別為88.91 g和87.79 g，較CK分別增加19.21%和17.71%，四者均顯著高于A2B1、A1B1和CK，但相互間差異不顯著；A2B1較CK增加7.37%，但與A1B1和CK差異均不顯著。

4) 根莖長(zhǎng)度。各施肥處理的根莖長(zhǎng)度為7.58～13.33 cm，較CK(7.32 cm)提高3.55%～82.10%，依次為A2B2>A1B3>A2B3>A1B2>A2B1>A1B1>CK。其中，A2B2最高，較CK提高82.10%，顯著高于除A1B3和A2B3外的其余處理；A1B3和A2B3其次，分別為12.91 cm和12.79 cm，較CK分別提高76.37%和74.73%，三者差異不顯著，但均顯著高于其余處理；A1B1較CK的增幅最小，不足30%，與除CK外的其余處理差異顯著。

5) 根莖最大直徑。各施肥處理的根莖最大直徑為1.22～2.18 cm，A2B3和A1B2分別較CK(1.45 cm)下降4.14%和15.86%，其余處理較CK提高1.38%～50.34%，依次為A1B3>A2B1>A1B1>A2B2>CK>A2B3>A1B2，其中，A1B3最大，較CK提高50.34%，顯著高于其余處理；A2B1其次，為1.84 cm，較CK提高26.90%，顯著高于其余處理；A1B2最低，與CK差異顯著；其余處理與CK差異不顯著，但均顯著高于A1B2。

6) 根莖鮮重。各施肥處理的鮮重為20.54～30.33 g，A1B1較CK(21.52 g)降低4.55%，其余處理較CK提高4.60%～40.94%，依次為A2B3>A2B2>A1B3>A1B2>A2B1>CK>A1B1，其中，A2B3最高，較CK提高40.94%，顯著高于其余處理；A2B2其次，為29.76 g，較CK提高29.99%，顯著高于除A1B2外的其余處理；A1B1最低，較CK降低4.55%，二者與A1B3差異不顯著，均顯著低于其余處理。

經(jīng)顯著性分析(表4)，行距對(duì)根莖長(zhǎng)度、最大直徑和鮮重的影響不顯著；株距對(duì)根莖長(zhǎng)度的影響達(dá)顯著水平，對(duì)最大直徑和鮮重的影響不顯著；行距與株距互作對(duì)知母的根莖長(zhǎng)度和鮮重的影響達(dá)極顯著水平，對(duì)根莖最大直徑的影響達(dá)顯著水平。

2.4.2 藥用活性成分的含量 由圖2看出，不同移栽密度知母芒果苷和知母皂苷BⅡ的含量分別為0.59%～2.73%和4.62%～12.06%，均符合2015年版藥典的要求，其中，各處理芒果苷的含量均較對(duì)照有不同程度的提高，為A1B1>A2B3>A2B2>A2B1>A1B2>A1B3>CK，A1B3芒果苷含量低于其他處理；知母皂苷BⅡ的含量除A1B1較對(duì)照提高外，其余處理均較對(duì)照有不同程度的降低，為A1B1>CK>A2B2>A2B1>A2B3>A1B3>A1B2，A1B2知母皂苷BⅡ含量低于其余處理。

圖2 不同移栽密度知母的藥用活性成分含量

3 討論

研究知母繁殖方法、基肥施用和種植密度對(duì)制定知母規(guī)范化種植的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，提高并穩(wěn)定栽培知母藥材產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要意義。種植密度影響每株知母所擁有的平均營(yíng)養(yǎng)空間，進(jìn)而影響知母的生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量、質(zhì)量及經(jīng)濟(jì)效益。該研究篩選出旱地知母較適宜的種植方法，并揭示了其藥用活性成分的特征，該方法種植的知母藥用活性成分含量雖符合國家藥典，但并不是最高的。該研究主要通過大量采樣分析，先確定最佳的種植方式，進(jìn)而考察施肥種類、施肥量和種植密度對(duì)藥用活性成分的影響，由于知母生產(chǎn)區(qū)域性的差異，該研究缺少種植區(qū)域?qū)χ杆幱没钚猿煞钟绊懙姆治?；此外，選擇分析的藥用活性成分相對(duì)單一，不利于對(duì)知母的質(zhì)量分類。施肥種類、施肥量和種植密度對(duì)藥用活性成分的影響理論上應(yīng)該是聯(lián)合影響，此方面缺少相關(guān)性分析，有待進(jìn)一步深入研究。

從知母的出苗率和操作便捷性考慮，播種方式建議在收獲時(shí)將刨出的根狀莖的芽頭切下來作繁殖材料，然后在早春發(fā)芽前或晚秋植株進(jìn)入休眠期后分株繁殖。如果在晚秋栽植，最好在每株上面培土6～7 cm，第2年春天將土扒平，利于新芽出土生長(zhǎng)。

4 結(jié)論

從知母單株生長(zhǎng)性狀、根莖外觀性狀以及根莖中藥用活性成分考慮，杏林套種知母高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)規(guī)范化栽培最佳模式：基肥最好用有機(jī)肥，種類與配比為農(nóng)肥糞200 kg/hm2+復(fù)合肥3 700 kg/hm2，種植方式采用早春或晚秋分株繁殖，最佳移栽密度為株距30 cm，行距為寬窄行40 cm/20 cm，此時(shí)，知母分蘗數(shù)較少、株高較矮，根莖鮮重最大，根莖長(zhǎng)度較大，分別為3.51個(gè)、72.80 cm、30.33 g和12.79 cm，且根莖有效活性成分芒果苷和知母皂苷BⅡ含量達(dá)最高，分別為2.67%和14.03%，符合國家藥典標(biāo)準(zhǔn)。