孟穎 池玉梅 嚴(yán)國(guó)俊 曹杰楠 王媛媛 夏夢(mèng)瑩 潘金火

摘要 目的：建立當(dāng)歸藥材及當(dāng)歸身飲片高效液相色譜（HPLC）特征圖譜，并通過(guò)對(duì)當(dāng)歸藥材和當(dāng)歸身飲片特征圖譜的比較分析，為當(dāng)歸藥材和當(dāng)歸身飲片的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。方法：采用Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.2%乙酸為流動(dòng)相，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL;采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”對(duì)3產(chǎn)地15批當(dāng)歸藥材及相應(yīng)當(dāng)歸身飲片進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，建立當(dāng)歸藥材及當(dāng)歸身飲片HPLC特征圖譜。結(jié)果：以阿魏酸為參照峰，構(gòu)建了由阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H和藁本內(nèi)酯4個(gè)特征峰組成的當(dāng)歸藥材及當(dāng)歸身飲片HPLC特征圖譜，15批當(dāng)歸藥材相似度>0.96，15批對(duì)應(yīng)當(dāng)歸身飲片相似度>0.97，當(dāng)歸藥材與當(dāng)歸身飲片特征圖譜相似，但各成分含量高低存在差異。結(jié)論：本研究建立的方法穩(wěn)定可靠，重現(xiàn)性好，可為當(dāng)歸藥材和當(dāng)歸身飲片質(zhì)量控制提供參考，為含當(dāng)歸或當(dāng)歸身的經(jīng)典名方的開(kāi)發(fā)研究提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 當(dāng)歸;當(dāng)歸身;特征圖譜;質(zhì)量控制;經(jīng)典名方

Research on HPLC Specific Chromatogram of Angelica sinensis and Angelica Body Decoction Pieces

MENG Ying，CHI Yumei，YAN Guojun，CAO Jienan，WANG Yuanyuan，XIA Mengying，PAN Jinhuo

（College of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China）

Abstract Objective：To establish the HPLC specific chromatogram of Angelica sinensis and Angelica sinensis body，and to provide reference for the quality control of Angelica sinensis and Angelica body by the comparative analysis of the characteristic maps of Angelica sinensis and Angelica body.Methods：The HPLC analysis was performed on an Symmetry C18 column（250 mm×4.6 mm，5 μm） with acetonitrile-0.2% acetic acid solution as the mobile phase with gradient elution at a flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was 280 nm.The column temperature was 30 ℃.The flow rate was 1.0 mL/min，and the injection volume was 20 μL; Similarity evaluation system of chromatographic fingerprint of Chinese medicine was used to evaluate the similarity of 15 batches of Angelica sinensis and Angelica body in 3 production areas，and to establish the characterisics fingerprint of Angelica sinensis and Angelica body.Results：The specific chromatogram was preliminarily constructed and 4 common peaks of ferulic acid，senkyunolide I，senkyunolide H and ligustilide with ferulic acid as the reference were identified.The similarity of 15 batches of Angelica sinensis was greater than 0.96，and the similarity of 15 batches of angelica body was greater than 0.97.The characteristics of the HPLC specific chromatogram of Angelica sinensis and angelica body were similar，but the content of each component was different.Conclusion：The method is stable，reliable and reproducible，and can be used for quality control of Angelica sinensis and angelica body，and provide a basis for the development of famous classical formulas containing Angelica sinensis or angelica body.

Keywords Angelica sinensis; Angelica body; Specific chromatogram; Quality control; Famous classical formulas

中圖分類號(hào)：R282;R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.04.003

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸[Angelica sinensis（Oliv.）Diels]的干燥根，其香氣濃郁，性溫，味甘、辛，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤(rùn)腸通便的功效[1]，具有“血中之氣藥”“補(bǔ)血之要藥”“婦科之良藥”等稱號(hào)。當(dāng)歸藥用歷史悠久，許多經(jīng)典名方以其入藥，僅2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部中收錄的含當(dāng)歸中成藥就有288種[2]，素有“十方九歸”之稱。2018年國(guó)家中醫(yī)藥管理局公布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》中[3]，100首經(jīng)典名方中共有24首用到當(dāng)歸，其中“清胃散”和“圣愈湯”2方以“當(dāng)歸身”入藥。當(dāng)歸不同部位具有截然不同的功效，其中當(dāng)歸身主補(bǔ)血，亦有養(yǎng)血之效。當(dāng)歸中主要含有揮發(fā)油類、有機(jī)酸類、多糖類、黃酮類、氨基酸類、呋喃香豆素衍生物等化學(xué)成分及大量微量元素，現(xiàn)代藥理

學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其具有舒張胃腸平滑肌、抗氧化、改善造血功能、改善血液循環(huán)、抗血栓、鎮(zhèn)痛抗炎、抗腫瘤、抗抑郁、平喘、保肝強(qiáng)腎健體、增強(qiáng)免疫力、抗輻射損傷等多種功效[4-9]。2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》中其含量測(cè)定僅以阿魏酸為質(zhì)量控制指標(biāo)，難以全面評(píng)價(jià)當(dāng)歸藥材的質(zhì)量。中藥高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）特征圖譜是對(duì)中藥整體性的化學(xué)表征，信息量大，特征性強(qiáng)，本研究通過(guò)建立當(dāng)歸藥材及當(dāng)歸身飲片HPLC特征圖譜，以期對(duì)當(dāng)歸藥材及當(dāng)歸身飲片質(zhì)量進(jìn)行整體控制，有效評(píng)定當(dāng)歸藥材及當(dāng)歸身飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為含當(dāng)歸或當(dāng)歸身的經(jīng)典名方的開(kāi)發(fā)研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀，Waters 2998 PDA檢測(cè)器，電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：FA-1104N），電子天平（梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司，型號(hào)：MS-105DU），超聲波清洗機(jī)（賽飛中國(guó)有限公司，型號(hào)：Biosafer-SB25-12DTD），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號(hào)：DHG-9023A），正方形調(diào)節(jié)式中藥切片機(jī)（瑞安市百信藥機(jī)器械廠，型號(hào)：HK-168），多功能粉碎機(jī)（永康市鉑歐五金制品有限公司，型號(hào)：400Y）。

1.2 試劑 無(wú)水乙醇（上海泰坦化學(xué)有限公司，批號(hào)：20035273，分析純），甲醇（美國(guó)天地有限公司，美國(guó)，批號(hào)：20065184，色譜純），乙腈（美國(guó)天地有限公司，美國(guó)，批號(hào)：20035273，色譜純），冰乙酸（阿拉丁試劑有限公司，批號(hào)：A2007065，分析純），磷酸（南京化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：13040910475，分析純），甲酸（阿拉丁試劑有限公司，批號(hào)：E1830032，分析純），純凈水（怡寶，批號(hào)：6832003260J）。

1.3 分析樣品 阿魏酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，貨號(hào)：110773-201614，99.0%），洋川芎內(nèi)酯I對(duì)照品（南京金益柏生物科技有限公司，貨號(hào)：17121105，98.0%），洋川芎內(nèi)酯H對(duì)照品（南京金益柏生物科技有限公司，貨號(hào)：17121106，98.0%），藁本內(nèi)酯對(duì)照品（南京金益柏生物科技有限公司，貨號(hào)：20032701，98.62%），15批不同產(chǎn)地當(dāng)歸樣品來(lái)源信息見(jiàn)表1，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)劉訓(xùn)紅教授鑒定為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%乙酸（B）;梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表2;流速：1.0 mL/min;柱溫：30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm;進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 1）單一對(duì)照品貯備液制備：分別取阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H和藁本內(nèi)酯對(duì)照品適量，精密稱定，置于10 mL棕色容量瓶，加入甲醇溶解并定容到刻度，制成含阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H和藁本內(nèi)酯濃度分別為871 μg/mL、176.8 μg/mL、355 μg/mL和690.34 μg/mL的單一成分對(duì)照品貯備液。2）混合對(duì)照品制備：精密量取以上4種對(duì)照品貯備液適量，置于10 mL棕色容量瓶，加甲醇制成含阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H和藁本內(nèi)酯濃度分別為17.42 μg/mL、7.07 μg/mL、17.75 μg/mL和138.07 μg/mL的混合溶液作為對(duì)照品溶液，低溫避光保存。

2.3 當(dāng)歸身飲片的制備 取當(dāng)歸原藥材，置挑選工作臺(tái)上，人工除去雜質(zhì)、異物及非藥用部位（殘留的草質(zhì)莖、須根、歸頭、歸尾）。清水洗5 min，中途等間隔時(shí)間噴水霧3次，當(dāng)歸身藥材外覆濕布，潤(rùn)制12 h，至內(nèi)無(wú)干心、軟硬適度、藥透水盡。將切藥機(jī)刀片厚度調(diào)至1～2 mm，異形片數(shù)<10%，切制后立即置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱50 ℃低溫干燥150 min，過(guò)6目篩，水分含量<10%，即得。

2.4 供試品溶液的制備 分別將當(dāng)歸藥材、當(dāng)歸身飲片打粉，過(guò)3號(hào)篩，取粉末約0.2 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密吸取70%乙醇20 mL，搖勻，密塞，稱定重量。超聲（45 kHz，30 ℃，300 W）處理30 min。取出，放至室溫，再次稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻。過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.5 專屬性試驗(yàn) 取空白溶劑、對(duì)照品溶液及供試品溶液，分別采用“2.1”色譜條件，進(jìn)行HPLC色譜測(cè)定。樣品與對(duì)照品在同一保留時(shí)間有相同的峰出現(xiàn)，而空白溶劑則無(wú)相應(yīng)的峰，證明實(shí)驗(yàn)專屬性良好。

2.6 中間精密度試驗(yàn) 取批號(hào)為DG-18009的當(dāng)歸藥材粉末，按“2.4”項(xiàng)下制備樣品，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以阿魏酸的保留時(shí)間和峰面積為參照，測(cè)得4個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.02%～0.05%，均<0.5%，相對(duì)峰面積RSD為0.37%～0.93%，均<3.0%，表明儀器精密度良好。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取批號(hào)為DG-18009的當(dāng)歸藥材粉末，按“2.4”項(xiàng)下制備樣品，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下于0、3、6、9、12、18、24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖。以阿魏酸的保留時(shí)間和峰面積為參照，測(cè)得4個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.23%～0.46%，均<0.5%，相對(duì)峰面積RSD為0.57%～1.68%，均<3.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取批號(hào)為DG-18009的當(dāng)歸藥材粉末6份，按“2.4”項(xiàng)下制備樣品，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖。以阿魏酸的保留時(shí)間和峰面積為參照，測(cè)得4個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.03%～0.04%，均<0.5%，相對(duì)峰面積RSD為0.60%～1.77%，均<3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 參照峰選擇

阿魏酸是當(dāng)歸中有機(jī)酸類成分，含量較多且較穩(wěn)定，且在提取過(guò)程中損失小，在HPLC色譜中峰位居中，峰面積穩(wěn)定，分離度較好，同時(shí)為2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》中當(dāng)歸含量測(cè)定的指標(biāo)性成分，故選擇阿魏酸作為參照峰。

2.10 樣品測(cè)定結(jié)果

2.10.1 當(dāng)歸藥材特征圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)

將15批當(dāng)歸藥材按“2.4”項(xiàng)下制備樣品，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄45 min色譜圖。將15批當(dāng)歸藥材圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入相似度評(píng)價(jià)軟件（2012版《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》），選擇S9當(dāng)歸藥材樣品圖譜作為參照?qǐng)D譜，采用多點(diǎn)校正、平均數(shù)法，設(shè)置時(shí)間窗為0.1，生成當(dāng)歸藥材特征圖譜疊加圖譜和對(duì)照?qǐng)D譜。見(jiàn)圖1、圖2。

各供試品溶液色譜圖中，各特征峰相對(duì)于阿魏酸色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間值見(jiàn)表3，各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<0.5%，各特征峰相對(duì)于阿魏酸色譜峰的相對(duì)峰面積值差異較大。見(jiàn)表4，各特征峰相對(duì)峰面積的RSD均>10%，未列于表中。

將15批當(dāng)歸藥材樣品的色譜圖導(dǎo)入相似度評(píng)價(jià)軟件（2012版《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》），對(duì)生成的當(dāng)歸藥材特征圖譜進(jìn)行相似度分析。結(jié)果顯示15批當(dāng)歸藥材的相似度范圍為0.967～0.999，表明當(dāng)歸藥材的特征圖譜較為穩(wěn)定，通過(guò)相似度可以較為整體的評(píng)價(jià)當(dāng)歸藥材質(zhì)量。相似度結(jié)果見(jiàn)表5。

2.10.2 當(dāng)歸身飲片特征圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)

取15批當(dāng)歸藥材，按“2.3”項(xiàng)下制備方法制備15批當(dāng)歸身飲片，并按“2.4”項(xiàng)下制備15批當(dāng)歸身飲片樣品，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣，記錄45 min色譜圖。將15批當(dāng)歸身飲片圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入相似度評(píng)價(jià)軟件（2012版《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》），選擇S9當(dāng)歸身飲片樣品圖譜作為參照?qǐng)D譜，采用多點(diǎn)校正、平均數(shù)法，設(shè)置時(shí)間窗為0.1，生成當(dāng)歸身飲片特征圖譜疊加圖譜和對(duì)照?qǐng)D譜。見(jiàn)圖3、圖4。

各供試品溶液色譜圖中，各特征峰相對(duì)于阿魏酸色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間值見(jiàn)表6。各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<0.5%，各特征峰相對(duì)于阿魏酸色譜峰的相對(duì)峰面積值差異較大。見(jiàn)表7。各特征峰相對(duì)峰面積的RSD均>10%，未列于表中。

將15批當(dāng)歸身飲片樣品的色譜圖導(dǎo)入相似度評(píng)價(jià)軟件（2012版《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》），對(duì)生成的當(dāng)歸身飲片特征圖譜進(jìn)行相似度分析。結(jié)果顯示15批當(dāng)歸身飲片的相似度0.973～0.999，表明當(dāng)歸身飲片的特征圖譜較為穩(wěn)定，通過(guò)相似度可以較為整體的評(píng)價(jià)當(dāng)歸身飲片質(zhì)量。相似度結(jié)果見(jiàn)表8。

3 討論

3.1 色譜條件 針對(duì)當(dāng)歸的有效成分主要為有機(jī)酸類和揮發(fā)油類，本研究考察了乙腈-磷酸、乙腈-甲酸和乙腈-乙酸3種不同色譜系統(tǒng)，分別進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)色譜峰的分離情況及色譜峰形比較，流動(dòng)相為乙腈-乙酸時(shí)分離度較好，峰形對(duì)稱，故選之;分別考察0.05%、0.10%、0.15%、0.20%濃度乙酸，結(jié)果顯示乙酸濃度為0.20%時(shí)，色譜峰的峰形較好。本研究采用PDA檢測(cè)器，對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行選擇，本研究選定的4個(gè)特征峰中，藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯I和洋川芎內(nèi)酯H最大吸收波長(zhǎng)均在280 nm附近，

且阿魏酸在280 nm波長(zhǎng)下也有良好的相應(yīng)，圖譜較美觀，基線平穩(wěn)，故檢測(cè)波長(zhǎng)定為280 nm。

3.2 樣品制備 提取溶劑方面，分別考察了純水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和100%乙醇9種不同提取溶劑，結(jié)果顯示以70%甲醇、70%乙醇作為提取溶劑時(shí)，樣品特征峰的峰面積較大;70%乙醇與70%甲醇比較，70%乙醇的提取結(jié)果較為穩(wěn)定，且乙醇毒性較小，故最終選擇70%乙醇作為提取溶劑。提取方式方面，以70%乙醇為提取溶劑，分別考察超聲與回流的提取效果，結(jié)果顯示樣品超聲提取時(shí)，各特

征峰的峰面積顯著高于回流提取，且超聲提取更易于操作，故提取方式選擇超聲;分別比較超聲提取15 min、30 min、45 min和60 min的區(qū)別，結(jié)果顯示，隨著超聲時(shí)間的增加，樣品中各成分含量亦逐漸增加，且在30 min時(shí)，各成分峰面積已達(dá)45 min時(shí)各成分峰面積的98%，考慮到節(jié)省時(shí)間，故本研究選擇超聲時(shí)間為30 min。

3.3 當(dāng)歸藥材及當(dāng)歸身飲片特征圖譜比較分析?? 當(dāng)歸藥材與當(dāng)歸身飲片特征圖譜相似，均指認(rèn)出阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H和藁本內(nèi)酯4個(gè)特征峰。通過(guò)比較當(dāng)歸藥材與當(dāng)歸身飲片特征圖譜，當(dāng)歸身飲片中化學(xué)成分含量除藁本內(nèi)酯外，阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I和洋川芎內(nèi)酯H含量均低于對(duì)應(yīng)當(dāng)歸藥材中各成分含量，主要原因是當(dāng)歸不同部位所含有的化學(xué)成分含量不同[10-12]。其次，在制備當(dāng)歸身飲片時(shí)也有少許的化學(xué)成分損失[13]。當(dāng)歸藥材使用的是全當(dāng)歸，當(dāng)歸身飲片為全當(dāng)歸去除歸頭與歸尾，秦書(shū)芝等[14]對(duì)當(dāng)歸不同部位中的阿魏酸進(jìn)行含量測(cè)定，研究結(jié)果表明，當(dāng)歸中阿魏酸含量最高部位是當(dāng)歸尾，當(dāng)歸頭次之，歸身含量最低，與本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)歸身飲片阿魏酸含量低于當(dāng)歸藥材中阿魏酸含量的結(jié)果一致;藁本內(nèi)酯為當(dāng)歸中揮發(fā)油類的主要成分，在當(dāng)歸中含量較高，在對(duì)當(dāng)歸不同部位揮發(fā)油研究的文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸身中藁本內(nèi)酯的相對(duì)百分含量顯著高于當(dāng)歸頭和當(dāng)歸尾[15]，當(dāng)歸身飲片中藁本內(nèi)酯含量高于全當(dāng)歸藥材中藁本內(nèi)酯含量，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

本研究建立了當(dāng)歸藥材及當(dāng)歸身飲片HPLC特征圖譜，并指認(rèn)出4個(gè)特征峰。該方法穩(wěn)定可靠，重現(xiàn)性好，且簡(jiǎn)單易操作，能夠較為整體全面反映當(dāng)歸藥材及當(dāng)歸身飲片的化學(xué)成分信息，能夠?yàn)楫?dāng)歸藥材及當(dāng)歸身飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考，為含當(dāng)歸或當(dāng)歸身的經(jīng)典名方的開(kāi)發(fā)研究提供依據(jù)。

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（2020-08-01收稿 責(zé)任編輯：楊覺(jué)雄）