吉秋霞，許曉樂(lè)

1.南通大學(xué)附屬海安醫(yī)院，江蘇 南通 226001

2.南通大學(xué)藥學(xué)院 藥理系，江蘇 南通 226001

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是世界最常見(jiàn)的肝臟疾病，肥胖、2 型糖尿病、高脂血癥和高血壓在NAFLD 患者中普遍存在，NAFLD 的危險(xiǎn)因素與代謝綜合征的構(gòu)成幾乎相同[1-2]。NAFLD 是一個(gè)復(fù)雜的肝病譜，從無(wú)癥狀的脂肪變性發(fā)展為具侵略性的壞死炎性反應(yīng)形式即非酒精性脂肪肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）。NASH 病理表現(xiàn)為不同程度的脂肪變性、細(xì)胞骨架損傷（肝細(xì)胞氣球樣變）、小葉炎性反應(yīng)伴或不伴纖維化，目前尚無(wú)藥物被批準(zhǔn)用于NASH 的治療?；⒄溶仗崛∽赞た浦参锘⒄萈olygonum cuspidatumSieb.et Zucc.，是白藜蘆醇的前體化合物?；⒄溶漳軌虮Ｗo(hù)肝臟免受酒精、四氯化碳（CCl4）、半乳糖/果糖過(guò)載和蛋氨酸膽堿缺乏飼料喂養(yǎng)引起的肝損傷[3-7]?；⒄溶漳軌蛲ㄟ^(guò)恢復(fù)溶酶體功能和自噬通量，從而改善蛋氨酸膽堿缺乏飼料喂養(yǎng)的db/db 小鼠模型NASH[8]。本研究旨在探討虎杖苷對(duì)高脂飲食喂養(yǎng)中年（12月齡）低密度脂蛋白受體基因敲除（low-density lipoprotein receptor knockout，LDLr-/-）小鼠形成的代謝綜合征模型中NASH 的保護(hù)作用及機(jī)制，為虎杖苷的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性LDLr-/-小鼠40 只，5 周齡，購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（蘇）2018-0008。動(dòng)物于室溫（25±2）℃、相對(duì)濕度50%～60%、晝夜12 h 交替的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理法規(guī)的規(guī)定和總則建議進(jìn)行，倫理批準(zhǔn)號(hào)20190105。

1.2 藥品與試劑

虎杖苷（批號(hào)JZ17021204）、白藜蘆醇（批號(hào)JZ17110701）購(gòu)自南京狄爾格生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為98%；含21%脂肪、0.21%膽固醇的高脂飼料購(gòu)自常州開(kāi)源飼料有限公司；三酰甘油（triglycerides，TG）檢測(cè)試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）檢測(cè)試劑盒、游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）檢測(cè)試劑盒、蘇木素-伊紅（HE）染液、丙二醛（malonaldehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH）檢測(cè)試劑盒、羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物技術(shù)有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測(cè)試劑盒、白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）檢測(cè)試劑盒、組織總蛋白和核蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒、G/A beads 購(gòu)自江蘇海門碧云天生物技術(shù)研究所；小鼠胰島素ELISA 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司；腺苷酸活化蛋白激酶（AMPactivated protein kinase，AMPK）抗體、磷酸化AMPK（p-AMPK）抗體、組蛋白H2A 抗體、核因子E2 相關(guān)因子（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）抗體、乙酰化肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）抗體、硬脂酰輔酶 A 去飽和酶 1（stearoyl-CoA desaturase 1，SCD1）抗體購(gòu)自美國(guó)CST 公司；脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）抗體（批號(hào) 10624-2-AP）、肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶 1α（carnitine palmitoyltransferase 1α，CPT1α）抗體（批號(hào)15184-1-AP）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）抗體（批號(hào)21898-1-AP）、α 平滑肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體（批號(hào) 55135-1-AP）、α-tublin 抗體（批號(hào)11224-1-AP）購(gòu)自美國(guó)ProteinTech 公司；p65 抗體、乙?；痯65 抗體、過(guò)氧化物酶體增殖激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα）抗體、sirtuin 1（SIRT1）抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；LKB1 抗體、p-LKB1 抗體購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購(gòu)自康成生物工程有限公司；山羊抗小鼠IgG 抗體購(gòu)自美國(guó)LI-COR 公司。

1.3 儀器

冰凍切片機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter 公司）；電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）；Synergy H1全功能微孔板檢測(cè)儀（美國(guó)Bio-TEK 公司）；顯微鏡（日本Olympus 公司）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

12月齡LDLr-/-小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組、白藜蘆醇（200 mg/kg）組和虎杖苷低、高劑量（100、200 mg/kg）組[4-5,8]，每組8 只。白藜蘆醇溶于0.5%羧甲基纖維素鈉配制成質(zhì)量濃度為20 mg/mL 的溶液，虎杖苷溶于0.5%羧甲基纖維素鈉分別配制成質(zhì)量濃度為10、20 mg/mL 的溶液。對(duì)照組給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，其余各組給予高脂飼料喂養(yǎng)；各給藥組ig 相應(yīng)藥物，對(duì)照組和模型組ig 0.5%羧甲基纖維素鈉，1 次/d，連續(xù)12 周。

2.2 虎杖苷對(duì)高脂喂養(yǎng)的中年LDLr?/?小鼠代謝參數(shù)的影響

給藥結(jié)束后，小鼠禁食12 h，自由飲水，稱定質(zhì)量。按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)胰島素水平；采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血糖水平；眼眶取血，按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中TG、TC 和FFA 水平。

2.3 虎杖苷對(duì)高脂喂養(yǎng)的中年LDLr?/?小鼠肝臟組織病理變化的影響

末次給藥24 h 后，小鼠脫頸椎處死。取各組小鼠肝臟組織，以生理鹽水洗滌，于4%多聚甲醛中固定，分別進(jìn)行油紅O 染色、HE 染色和Masson染色，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 虎杖苷對(duì)高脂喂養(yǎng)的中年LDLr?/?小鼠肝臟組織脂質(zhì)水平的影響

取各組小鼠肝臟組織，按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)肝臟組織中TG 和TC 水平。

2.5 虎杖苷對(duì)高脂喂養(yǎng)的中年LDLr?/?小鼠肝臟組織TNF-α 和IL-6 水平的影響

取各組小鼠肝臟組織，按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)肝臟組織中TNF-α 和IL-6 水平。

2.6 虎杖苷對(duì)高脂喂養(yǎng)的中年LDLr?/?小鼠肝臟組織SOD、CAT、GSH 活性以及MDA、HYP 水平的影響

取各組小鼠肝臟組織，按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)肝臟組織中SOD、CAT、GSH 活性以及MDA、HYP水平。

2.7 虎杖苷對(duì)高脂喂養(yǎng)的中年LDLr?/?小鼠肝臟組織乙酰化LKB1 和LKB1 表達(dá)的影響

G/A beads 和LKB1 抗體于PBS 溶液（pH＝8.2）中4 ℃孵育2 h，用dimethylpimelimidate-Cl 在三乙醇胺（pH 8.2）中懸浮，室溫孵育30 min；G/A beads在Tris 緩沖液中懸浮15 min，用含5%聚山梨酯-20的Tris 緩沖液（pH 8.0）洗滌與LKB1 抗體交聯(lián)的G/A 珠，洗滌3 次，10min/次，4 ℃用封閉溶液懸浮。免疫沉淀珠用裂解緩沖液洗滌4 次，用30 μL十二烷基磺酸鈉樣品緩沖液洗脫，用乙酰化LKB1和LKB1 抗體進(jìn)行免疫印跡。

2.8 虎杖苷對(duì)高脂喂養(yǎng)的中年LDLr?/?小鼠肝臟組織AMPK、p-AMPK、Nrf2、SCD1、FASN、CPT1A、TGF-β、α-SMA、p65、乙?；痯65、PPARα、SIRT1、LKB1 和p-LKB1 蛋白表達(dá)的影響

按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取肝臟組織總蛋白和核蛋白，按BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，加入封閉液4 ℃孵育過(guò)夜；洗滌后，分別加入FASN、SCD1、PPARα、CPT1A、GAPDH、α-tublin、H2A、Nrf2、TGF-β、α-SMA、SIRT1、LKB1、p-LKB1、AMPK、p-AMPK、p65和乙酰化p65 抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；洗滌后，加入山羊抗小鼠IgG 抗體，室溫孵育2 h，洗滌后，采用ODYSEEY 掃描儀顯影，并用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 虎杖苷對(duì)高脂喂養(yǎng)的中年LDLr?/?小鼠代謝參數(shù)的影響

如表1所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量顯著增加（P＜0.05），血清中TC、TG 和FFA 水平顯著升高（P＜0.05），血糖和胰島素水平均顯著增高（P＜0.05）；與模型組比較，虎杖苷高劑量組和白藜蘆醇組小鼠體質(zhì)量明顯降低（P＜0.05），各給藥組小鼠血清中TC、TG 和FFA 水平均顯著降低（P＜0.05），虎杖苷高劑量組和白藜蘆醇組小鼠血糖和胰島素水平顯著降低（P＜0.05）。

表1 虎杖苷對(duì)高脂喂養(yǎng)的中年LDLr?/?小鼠代謝參數(shù)的影響Table 1 Effect of polydatin on metabolic parameters in middle-aged LDLr?/? mice fed with high-fat

表1 虎杖苷對(duì)高脂喂養(yǎng)的中年LDLr?/?小鼠代謝參數(shù)的影響Table 1 Effect of polydatin on metabolic parameters in middle-aged LDLr?/? mice fed with high-fat

與對(duì)照組比較：#P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05，下表同#P <0.05 vs control group;*P <0.05 vs model group,same as below tables

組別 劑量/(mg·kg-1)體質(zhì)量/g TC/(mmol·L-1)TG/(mmol·L-1)FFA/(mmol·L-1)血糖/(mmol·L-1)胰島素/(ng·mL-1)對(duì)照 — 35.13±3.05 18.44±4.17 2.53±0.38 0.76±0.18 7.57±1.70 0.41±0.11模型 — 48.13±4.76# 48.80±6.28# 6.46±1.09# 1.97±0.38# 20.78±5.42# 0.92±0.17#虎杖苷 100 43.61±3.89 37.99±8.06* 4.36±0.69* 1.52±0.29* 18.97±4.03 0.82±0.23 200 38.45±5.57* 28.71±6.18* 3.32±0.50* 1.28±0.29* 12.05±2.70* 0.72±0.12*白藜蘆醇 200 41.66±4.88* 36.10±6.16* 3.71±0.47* 1.25±0.27* 11.28±1.38* 0.66±0.16*

3.2 虎杖苷對(duì)高脂喂養(yǎng)的中年LDLr?/?小鼠肝臟組織病理變化的影響

如圖1所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟油紅O 染色面積及顏色深度均增加，提示肝臟出現(xiàn)明顯脂質(zhì)聚積；各給藥組小鼠肝臟油紅O 染色面積及顏色深度均降低。HE 染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠肝臟細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞質(zhì)均勻；模型組小鼠肝臟細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)存在大量大小不一的脂滴空泡，可見(jiàn)氣球樣變；各給藥組小鼠肝臟病理表現(xiàn)均有所緩解。Masson 染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟表現(xiàn)出廣泛的纖維化；各給藥組小鼠肝纖維化明顯減輕。

圖1 虎杖苷對(duì)高脂喂養(yǎng)的中年LDLr?/?小鼠肝臟組織病理變化的影響(×200)Fig.1 Effect of polydatin on pathological changes of liver tissue in middle-aged LDLr?/? mice fed with high-fat(× 200)

3.3 虎杖苷對(duì)高脂喂養(yǎng)的中年LDLr?/?小鼠肝臟組織脂質(zhì)水平的影響

如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肝臟中TC 和TG 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠肝臟中TC 和TG 水平顯著降低（P＜0.05）。

圖2 虎杖苷對(duì)高脂喂養(yǎng)的中年LDLr?/?小鼠肝臟組織脂質(zhì)水平的影響Fig.2 Effect of polydatin on lipid levels in liver tissue in middle-aged LDLr?/? mice fed with high-fat

3.4 虎杖苷對(duì)高脂喂養(yǎng)的中年LDLr?/?小鼠肝臟組織FASN、SCD1、PPARα 和CPT1α 蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肝臟中FASN 和SCD1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），PPARα 和CPT1α 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠肝臟中FASN 和SCD1 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），虎杖苷高劑量組和白藜蘆醇組PPARα 和CPT1α 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），虎杖苷低劑量組PPARα 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。

圖3 虎杖苷對(duì)高脂喂養(yǎng)的中年LDLr?/?小鼠肝臟組織FASN、SCD1、PPARα 和CPT1α 蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of polydatin on expressions of FASN,SCD1,PPARα and CPT1α in liver tissue in middle-aged LDLr?/? mice fed with high-fat

3.5 虎杖苷對(duì)高脂喂養(yǎng)的中年LDLr?/?小鼠肝臟組織炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激和膠原沉積的影響

如表2所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肝臟中TNF-α 和IL-6 水平顯著升高（P＜0.05），MDA水平顯著升高（P＜0.05），抗氧化物酶SOD、CAT和GSH 活性顯著降低（P＜0.05），膠原沉積標(biāo)志物HYP 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠肝臟中TNF-α 和IL-6 水平均顯著降低（P＜0.05），MDA 水平顯著降低（P＜0.05），SOD和GSH 活性顯著升高（P＜0.05）；虎杖苷高劑量組和白藜蘆醇組小鼠肝臟中CAT 活性顯著升高（P＜0.05），HYP 水平顯著降低（P＜0.05）。

表2 虎杖苷對(duì)高脂喂養(yǎng)的中年LDLr?/?小鼠肝臟組織炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激和膠原沉積的影響Table 2 Effect of polydatin on hepatic inflammation,oxidative stress and collagen deposition in liver tissue in middle-aged LDLr?/? mice fed with high-fat

表2 虎杖苷對(duì)高脂喂養(yǎng)的中年LDLr?/?小鼠肝臟組織炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激和膠原沉積的影響Table 2 Effect of polydatin on hepatic inflammation,oxidative stress and collagen deposition in liver tissue in middle-aged LDLr?/? mice fed with high-fat

組別 劑量/(mg·kg-1)TNF-α/(pg·mL-1)IL-6/(pg·mL-1)MDA/(nmol·mg-1)SOD/(U·mg-1)GSH/(U·mg-1)CAT/(U·mg-1)HYP/(μg·mg-1)對(duì)照 — 569.25±144.38 1 042.00±226.49 2.10±0.40 142.33±28.56 43.66±8.70 257.36±55.97 0.21±0.05模型 — 1 249.75±229.71# 1 804.13±322.85# 7.55±1.30# 63.41±18.37# 15.11±3.88# 148.79±49.93# 0.54±0.08#虎杖苷 100 953.89±285.11* 1 511.00±350.57* 5.47±1.00* 98.37±19.92* 23.59±3.61* 169.75±30.27 0.40±0.10 200 866.50±170.61* 1 283.38±234.63* 3.68±1.09* 124.28±26.03* 30.15±6.94*# 222.94±37.61* 0.29±0.05*白藜蘆醇 200 787.25±137.08* 1 332.25±251.71* 4.27±1.27* 107.43±15.20* 34.08±7.00* 210.52±53.48* 0.34±0.06*

3.6 虎杖苷對(duì)高脂喂養(yǎng)的中年LDLr?/?小鼠肝臟組織Nrf2 蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肝臟Nrf2 入核表達(dá)顯著減少（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠肝臟Nrf2 入核表達(dá)顯著增加（P＜0.05）。

圖4 虎杖苷對(duì)高脂喂養(yǎng)的中年LDLr?/?小鼠肝臟組織Nrf2 蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of polydatin on Nrf2 expression in liver tissue in middle-aged LDLr?/? mice fed with high-fat

3.7 虎杖苷對(duì)高脂喂養(yǎng)的中年LDLr?/?小鼠肝臟組織TGF-β 和α-SMA 蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肝臟中促纖維化關(guān)鍵因子TGF-β 和α-SMA 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠肝臟中TGF-β 和α-SMA 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。

圖5 虎杖苷對(duì)高脂喂養(yǎng)的中年LDLr?/?小鼠肝臟組織TGF-β 和α-SMA 蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of polydatin on expressions of TGF-β and α-SMA in liver tissue in middle-aged LDLr?/? mice fed with high-fat

3.8 虎杖苷對(duì)高脂喂養(yǎng)的中年LDLr?/?小鼠肝臟組織中SIRT1 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖6-A所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肝臟中SIRT1 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組肝臟中SIRT1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。SIRT1 主要通過(guò)對(duì)底物靶點(diǎn)去乙?；a(chǎn)生作用，且LKB1 調(diào)控AMPK。如圖6-B所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肝臟LKB1 乙?；斤@著升高（P＜0.05），p-LKB1/LKB1 和p-AMPK/AMPK 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，虎杖苷高劑量組和白藜蘆醇組肝臟LKB1 乙?；斤@著降低（P＜0.05），p-LKB1/LKB1 和p-AMPK/AMPK 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）。如圖6-C所示，與對(duì)照組比較，模型組p65 乙酰化水平和p65 入核表達(dá)均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組p65 乙酰化水平和p65 入核表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）。

圖6 虎杖苷對(duì)高脂喂養(yǎng)的中年LDLr?/?小鼠肝臟組織中SIRT1 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of polydatin on expressions of SIRT1 signaling related proteins in liver tissue in middle-aged LDLr?/? mice fed with high-fat

4 討論

NASH 是一種多方面的疾病，由于代謝并發(fā)癥并存，其治療復(fù)雜。由于大多數(shù)NAFLD/NASH 患者伴有代謝綜合征，理想的NASH 動(dòng)物模型應(yīng)具有與人類NASH疾病發(fā)展相似的生理學(xué)變化如體質(zhì)量增加、血脂紊亂、胰島素抵抗、脂肪細(xì)胞因子的釋放等，以及與人類NASH 相似的不同階段中的病理學(xué)模式和組織學(xué)變化等。常見(jiàn)的NASH 模型為蛋氨酸膽堿缺乏飲食、肝臟化學(xué)毒素如CCl4等誘導(dǎo)的動(dòng)物模型。蛋氨酸膽堿缺乏飲食會(huì)誘導(dǎo)動(dòng)物高代謝和低吞咽，導(dǎo)致血漿TG 水平明顯降低、體質(zhì)量減輕、肝細(xì)胞氣球狀變??；肝臟化學(xué)毒素如CCl4也會(huì)導(dǎo)致小鼠體質(zhì)量減輕，與NASH 的病因和病理表現(xiàn)不一致[9-10]。以上模型與以高脂血癥、肥胖為主的代謝綜合征或糖尿病患者的NASH 有很大不同，近年遺傳模型在NASH 研究中被廣泛應(yīng)用，db/db 或ob/ob小鼠會(huì)出現(xiàn)代謝綜合征和肝脂肪變性，但不會(huì)出現(xiàn)肝纖維化和炎性反應(yīng)[1,9]?；贜ASH 與動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制的相似性，脂蛋白功能受損的基因小鼠模型被應(yīng)用于NASH 研究。研究發(fā)現(xiàn)，給予中年（12月齡）雄性LDLr-/-小鼠高脂飲食喂養(yǎng)，可以在代謝綜合征的背景下發(fā)展為NASH，滿足5 項(xiàng)人類代謝綜合征標(biāo)準(zhǔn)中的4 項(xiàng)，并具有人類NASH 的關(guān)鍵特征如肝脂肪變性、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激和纖維化，且呈年齡相關(guān)性[10]。因此，本研究采用高脂喂養(yǎng)的中年LDLr-/-小鼠形成的代謝綜合征模型探究虎杖苷對(duì)NASH 的作用。

肥胖、血脂異常、空腹血糖升高和胰島素升高是NASH 患者的主要代謝綜合征特征。結(jié)果顯示，虎杖苷明顯抑制高脂飼料喂養(yǎng)的中年LDLr-/-小鼠血脂紊亂，減輕體質(zhì)量，降低血糖和胰島素水平，表明虎杖苷能夠改善代謝綜合征小鼠模型的代謝基礎(chǔ)特征參數(shù)。NASH 的病理發(fā)展涉及多重打擊，肝臟脂肪變性使肝細(xì)胞易受到其他刺激，從而導(dǎo)致肝臟炎性反應(yīng)、損傷和纖維化[1,3]。結(jié)果顯示，高脂飼料喂養(yǎng)的中年LDLr-/-小鼠肝臟出現(xiàn)明顯脂肪變性，虎杖苷明顯減少肝臟脂肪變性。脂肪酸的從頭生成和β-氧化是脂質(zhì)代謝的2 個(gè)關(guān)鍵作用。新生脂肪生成受一系列脂酶如FASN 和SCD1 的調(diào)控。PPARα和CPT1α 是脂肪酸β 氧化的2 個(gè)關(guān)鍵酶[11]。本研究結(jié)果顯示，虎杖苷顯著降低肝臟中FASN 和SCD1蛋白表達(dá)水平，提高PPARα 和CPT1α 蛋白表達(dá)水平，提示虎杖苷通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪酸的新生脂肪生成和β-氧化，有助于減輕血脂異常和肝脂肪變性。

炎性反應(yīng)可以通過(guò)激活肝星狀細(xì)胞和纖維化，在NASH 發(fā)展中發(fā)揮主導(dǎo)作用，為NASH 與肝臟的單純性脂肪變性的主要區(qū)別。結(jié)果顯示，虎杖苷抑制肝臟炎性因子TNF-α 和IL-6 水平，表明虎杖苷可以改善肝臟炎性反應(yīng)，有助于抑制NASH 進(jìn)程。多種內(nèi)源性和外源性損傷、線粒體呼吸鏈衰竭、抗氧化元素如SOD、CAT 活性或脂質(zhì)過(guò)氧化水平升高的過(guò)度生成，能夠?qū)е鲁掷m(xù)性肝損傷、凋亡、炎性反應(yīng)和纖維化。結(jié)果顯示，虎杖苷抑制中年LDLr-/-小鼠肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物MDA 水平，增強(qiáng)肝臟抗氧化應(yīng)激的主要抗氧化酶SOD、GSH 和CAT活性。Nrf2 是抗氧化機(jī)制的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，作用于多種抗氧化物酶，為潛在的治療NAFLD/NASH 的靶點(diǎn)[12]。結(jié)果顯示，虎杖苷能夠促進(jìn)Nrf2 入核表達(dá)，從而增加抗氧化酶活性。在炎性反應(yīng)和慢性肝損傷過(guò)程中，肝星狀細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生異常數(shù)量的細(xì)胞外基質(zhì)而被激活，并向肌纖維樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致肝纖維化。本研究結(jié)果顯示，虎杖苷顯著抑制肝臟膠原沉積和纖維化相關(guān)蛋白TGF-β 和α-SMA 表達(dá)，從而抑制肝臟纖維化。

SIRT1 是肝臟脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，可以預(yù)防和改善NAFLD/NASH的特征[13]。SIRT1 激活劑白藜蘆醇能夠通過(guò)SIRT1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑改善NAFLD[14]。結(jié)果顯示，虎杖苷顯著增強(qiáng)高脂喂養(yǎng)中年LDLr-/-小鼠肝臟中SIRT1 蛋白表達(dá)水平。SIRT1 作為1 種依賴于NAD+的脫乙?；?，催化組蛋白的脫乙酰化，也能夠使非組蛋白底物去乙?；?。LKB1 和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是由SIRT1 介導(dǎo)的去乙?；{(diào)節(jié)代謝和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。SIRT1 通過(guò)在Lys48 處使LKB1 去乙酰而作用于AMPK 信號(hào)的上游，并激活LKB1，導(dǎo)致p-AMPK表達(dá)增加[13-14]。AMPK 是肝臟脂質(zhì)代謝的重要調(diào)節(jié)因子，AMPK 的激活能夠抑制下游靶點(diǎn)FASN 和SCD1，從而抑制脂肪的從頭合成；AMPK 的激活可以增強(qiáng)CPT1 表達(dá)，增加肝臟脂肪酸β-氧化；AMPK 調(diào)節(jié)脂肪酸β-氧化的另 1 個(gè)重要分子PPARα[11]。因此，SIRT1/LKB1/AMPK 通路在肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝中起重要作用。結(jié)果顯示，虎杖苷顯著增強(qiáng)LKB1 去乙?；胶虯MPK 磷酸化水平，從而抑制AMPK 靶基因FASN 和SCD1 參與脂肪的從頭生成，促進(jìn)PPARα 和CPT1α 參與脂肪酸β 氧化，改善肝臟脂肪代謝、減輕肝臟脂肪變性。NF-κB 是炎性反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子，RelA/p65 是NF-κB 最常見(jiàn)的雜二聚體。SIRT1 能夠使RelA/p65 亞基的賴氨酸310 去乙酰，促進(jìn)p65/p50 復(fù)合物結(jié)合，使NF-κB轉(zhuǎn)錄活性失活，抑制其促炎靶基因的表達(dá)[15]。結(jié)果顯示，虎杖苷降低p65 乙?；?，即增加了p65的去乙酰化，從而抑制p65 入核表達(dá)，抑制炎性反應(yīng)。Nrf2 與AMPK、NF-κB 信號(hào)通路相互影響[16-17]，虎杖苷對(duì)Nrf2 的調(diào)控可能與其對(duì)AMPK 和NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控密切相關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)虎杖苷能夠減輕高脂喂養(yǎng)的中年LDLr-/-小鼠形成的代謝綜合征模型中NASH，即改善代謝參數(shù)、脂肪變性、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激和纖維化，以上作用可能與肝臟SIRT1 的激活有關(guān)?；⒄溶漳軌蛲ㄟ^(guò)調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白如p-AMPK、FASN、SCD1、PPARα、CPT1表達(dá)減輕肝臟脂肪變性，通過(guò)增強(qiáng)Nrf2 抗氧化信號(hào)通路減輕肝臟氧化應(yīng)激，通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子p65 活化減輕肝臟炎性反應(yīng)，通過(guò)抑制促纖維化關(guān)鍵蛋白TGF-β 和α-SMA 表達(dá)減輕肝臟纖維化。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突