強婷婷，李益萍，王肖龍*

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 國家中醫(yī)心血管病臨床醫(yī)學(xué)研究中心分中心，上海 201203

2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 心血管病研究所，上海 201203

隨著中藥應(yīng)用日益廣泛，由中藥-西藥聯(lián)合使用產(chǎn)生的代謝性藥物相互作用和不良反應(yīng)事件也隨之增加，因此，中藥與西藥聯(lián)合應(yīng)用的安全性和合理性受到廣泛關(guān)注。肝臟是藥物代謝的主要場所，主要包括I 階段細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）酶系參與的氧化、還原、水解反應(yīng)[1]。CYP450 酶系是由許多同工酶組成的超基因大家族，其在肝臟含量最高，對大量結(jié)構(gòu)各異的藥物的生物轉(zhuǎn)化起著決定性作用[2]。藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄過程非常復(fù)雜，除了肝臟的代謝轉(zhuǎn)化外，膜轉(zhuǎn)運體可以主動轉(zhuǎn)運藥物進出細胞，平衡細胞內(nèi)的藥物濃度，膜轉(zhuǎn)運體在改變藥物代謝方面顯示出巨大的潛力[3]。目前國內(nèi)外越來越多的學(xué)者通過預(yù)測中藥對CYP450 酶及轉(zhuǎn)運體活性影響，進而評估藥物聯(lián)用時發(fā)生藥物相互作用的風(fēng)險[4-6]，研究發(fā)現(xiàn)，麝香保心丸在體外對人源CYP2B6、CYP2C9 以及有機陰離子 1B1（organic anion transporting polypeptide 1B1，OATP1B1）具有抑制作用，可能導(dǎo)致與其他藥物聯(lián)用時發(fā)生藥物相互作用[7]。

生脈注射液源于古方生脈散，由紅參、麥冬、五味子組成，具有益氣固脫、養(yǎng)陰生津的功效，用于治療氣陰兩虧、脈虛欲脫的心悸、氣短、四肢厥冷、汗出、脈欲絕及心肌梗死、心源性休克等癥狀。生脈注射液具有抗缺血缺氧及再灌注損傷、抑制心肌細胞凋亡及心肌纖維化等作用[8-9]。生脈注射液與常規(guī)西藥聯(lián)合使用時，不僅可以改善心力衰竭和冠心病心絞痛患者的臨床療效[10-12]，并且可以降低急性心肌梗死患者的死亡率[13]。但是，生脈注射液與心血管疾病常用藥物如CYP2C9 底物華法林、CYP2D6 底物美托洛爾、CYP3A 底物辛伐他汀、多藥耐藥蛋白1（multidrug resistance proteins 1，MDR1）底物地高辛、乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）與OATP1B1 底物瑞舒伐他汀、OATP1B1 底物替米沙坦等的代謝性相互作用的研究較少，存在用藥安全隱患。

美國食品和藥品管理局（FDA）發(fā)布的《藥物相互作用研究指導(dǎo)原則（2017）》[14]以及我國頒布的《藥物相互作用研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》[15]中，主要包括7 種酶以及9 種轉(zhuǎn)運體的抑制作用的研究，與心血管藥物代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)運體主要有MDR1、BCRP 與OATP1B1。因此，根據(jù)國內(nèi)外的指導(dǎo)原則，在有無生脈注射液的人肝微粒體、MDR1以及BCRP 囊泡和人胚胎腎細胞HEK293 中，培養(yǎng)CYP450 酶與轉(zhuǎn)運體的探針底物，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）及酶標儀檢測探針底物代謝產(chǎn)物的生成量或探針底物量，并計算半數(shù)抑制濃度（50% concentration of inhibition，IC50）值，從而進一步評估生脈注射液對CYP450 酶主要亞型以及轉(zhuǎn)運體MDR1、BCRP 與OATP1B1 的抑制作用，以期為生脈注射液與其他藥物臨床上安全、有效的聯(lián)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 人肝微粒體、囊泡和細胞

人肝微粒體（批號IHG，質(zhì)量濃度為20 mg/mL）購自美國體外技術(shù)公司；人源MDR1 囊泡（批號KKA4G23，質(zhì)量濃度為5 mg/mL）、BCRP 囊泡（批號QSHTG03，質(zhì)量濃度為5 mg/mL）、穩(wěn)定表達人源 OATP1B1 轉(zhuǎn)運體的 HEK293 細胞系HEK293-OATP1B1、轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因HEK293 細胞系 HEK293-MOCK 均購自日本GenoMembrane 公司。

1.2 藥品與試劑

生脈注射液（批號2018120503）購自上海和黃藥業(yè)；對照品非那西?。ㄙ|(zhì)量分數(shù)≥98%，批號77440）、阿莫地喹（質(zhì)量分數(shù)≥100%，批號A2799）、雙氯芬酸鈉（質(zhì)量分數(shù)≥98%，批號D6899）、α-萘磺酮（質(zhì)量分數(shù)≥98%，批號N5757）、槲皮素（質(zhì)量分數(shù)≥98%，批號Q4951）、噻氯匹定（質(zhì)量分數(shù)≥99%，批號T6654）、4-羥基雙氯芬酸（質(zhì)量分數(shù)≥98%，批號H-3661）、N-去乙基阿莫地喹（純質(zhì)量分數(shù)≥98%，批號705349）、右啡烷（質(zhì)量分數(shù)≥98%，批號 UC205）、熒光黃（質(zhì)量分數(shù)≥100%，批號L0259）、N-甲基奎尼丁（質(zhì)量分數(shù)≥100%，批號SBNMQ）、新生霉素（質(zhì)量分數(shù)≥93%，批號74675）、17β-葡萄糖苷-雌二醇（質(zhì)量分數(shù)≥98%，批號E1127）、利福平（質(zhì)量分數(shù)≥97%，批號R3501）、G418 鹽酸鹽（批號A1720）、丁螺環(huán)酮（質(zhì)量分數(shù)≥100%，批號B7148）、甲苯磺丁脲（質(zhì)量分數(shù)≥97%，批號T0891）購自美國Sigma 公司；對照品安非他酮（質(zhì)量分數(shù)≥98%，批號B3649）、酮康唑（質(zhì)量分數(shù)≥98%，批號K0045）、對乙酰氨基酚（質(zhì)量分數(shù)≥98%，批號H0190）購自日本東京化學(xué)工業(yè)株式會社；對照品塞替派（質(zhì)量分數(shù)≥100%，批號20101110）、4-羥基美芬妥英（質(zhì)量分數(shù)≥100%，批號H-3661）購自常州化工科技有限公司；羥基安非他酮對照品（質(zhì)量分數(shù)≥99.6%，批號BUP-16-007）購自加拿大Acanthus 公司；6β-羥基睪酮對照品（質(zhì)量分數(shù)≥100%，批號ZC-24060）購自上海甄準生物科技有限公司；甲醇購自美國Merck 公司；β-還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，β-NADPH，質(zhì)量分數(shù)≥100%，批號10041939）購自瑞士Roche 公司；S-美芬妥英對照品（質(zhì)量分數(shù)≥98%，批號7098-4-7）購自上海相輝醫(yī)藥科技公司；睪酮對照品（質(zhì)量分數(shù)≥99.28%，批號DRE-C17322500）購自德國Dr.Ehrenstorfer 公司；右美沙芬對照品（質(zhì)量分數(shù)≥100%，批號75469A）購自上海Damas-beta 公司；磺胺苯吡唑?qū)φ掌罚ㄙ|(zhì)量分數(shù)≥99%，批號178125）購自百靈威科技有限公司；奎尼丁對照品（質(zhì)量分數(shù)≥100%，批號Q685000）購自加拿大TRC 公司；轉(zhuǎn)運體囊泡試劑盒（批號GM3010）購自日本GenoMembrane公司；DMEM 培養(yǎng)基（批號11885-084）、胰酶（批號25300-062）、青霉素鏈霉素混合液溶液（批號15140-122）、胎牛血清（批號10099-141）購自美國Gibco 公司；BCA 蛋白定量試劑盒（批號23227）購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；24 孔賴氨酸包被培養(yǎng)板（批號354414）購自美國Corning 公司。

1.3 儀器

XW-80A 型漩渦儀（其林貝爾實驗室儀器有限公司）；DK-S24 型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；AL204 型天平（德國梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；VELOCITY18R 離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；HTS PAL 自動進樣系統(tǒng)（瑞士思特斯分析儀器股份公司）；LC20液相色譜儀（日本島津公司）；API4000 質(zhì)譜儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)有限公司）。

2 方法

2.1 生脈注射液的劑量設(shè)定依據(jù)

根據(jù)藥品說明書，生脈注射液靜脈滴注，20～60 mL/次；以標準成人65 kg 體質(zhì)量計算，循環(huán)血液總量約為5 L，故使用臨床常用劑量時的理論最大血藥濃度為1.2%（體積分數(shù)），考慮到肝臟內(nèi)濃度可能會高于血藥濃度，因此提高體外實驗的濃度上限至30.0%（體積分數(shù)）。在確定最高濃度后，設(shè)計的濃度范圍盡量包括臨床血藥濃度，但要滿足在1 個lg 內(nèi)需要有1 個濃度，否則在出現(xiàn)抑制作用時，無法準確擬合IC50，因此在設(shè)置梯度濃度時可以2～5 倍交叉梯度稀釋。

2.2 生脈注射液對CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6 和CYP3A4 的體外抑制作用

陰性對照組：人肝微粒體（終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL）與空白緩沖液預(yù)孵育15 min 后，加入相應(yīng)的探針底物溶液：非那西?。?0 μmol/L，CYP1A2）、安非他酮（100 μmol/L，CYP2B6）、阿莫地喹（1.5 μmol/L，CYP2C8）、雙氯芬酸（25 μmol/L，CYP2C9）、S-美芬妥英（50 μmol/L，CYP2C19）、右美沙芬（8 μmol/L，CYP2D6）和睪酮（100 μmol/L，CYP3A4），再加入β-NADPH，37 ℃孵育30 min。

陽性對照組：人肝微粒體（終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL）分別與各亞酶的選擇性抑制劑：α-萘磺酮（30 μmol/L，CYP1A2）、塞替派（200 μmol/L，CYP2B6）、槲皮素（100 μmol/L，CYP2C8）、磺胺苯吡唑（10 μmol/L，CYP2C9）、噻氯匹定（5 μmol/L，CYP2C19）、奎尼?。?0 μmol/L，CYP2D6）和酮康唑（5 μmol/L，CYP3A4）于37 ℃預(yù)孵育15 min后，加入各亞酶的探針底物和β-NADPH，于37 ℃孵育30 min。

生脈注射液組：人肝微粒體（終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL）分別與不同體積分數(shù)（0.1%、0.5%、3.0%、10.0%、30.0%）生脈注射液預(yù)孵育15 min后，加入各亞酶的探針底物和β-NADPH，于37 ℃孵育30 min。

各組加入預(yù)冷的甲醇終止反應(yīng)，4000 r/min 離心5 min，取上清液，采用LC-MS/MS 方法測定各探針底物的代謝產(chǎn)物生成量，并計算CYP450 亞酶的相對活性。

CYP450 亞酶的相對活性＝給藥組或陽性對照組代謝產(chǎn)物生成量/陰性對照組代謝產(chǎn)物生成量

2.3 生脈注射液對MDR1與BCRP的體外抑制作用

陰性對照組：Buffer A2 與人源 MDR1（5 mg/mL）和BCRP 囊泡（5 mg/mL）于37 ℃預(yù)孵育5 min，分別加入Reagent C2 和探針底物：N-甲基奎尼?。? μmol/L，MDR1）或熒光黃（10 μmol/L，BCRP），在有ATP 或AMP 的條件下，于37 ℃孵育5 min。

陽性對照組：酮康唑、新生霉素作為MDR1 與BCRP 的選擇性抑制劑，與人源性MDR1 及BCRP囊泡于37 ℃預(yù)孵育5 min，加入Reagent C2、熒光黃或N-甲基奎尼丁，在有ATP 或AMP 的條件下，于37 ℃孵育5 min。

生脈注射液組：不同體積分數(shù)（0.1%、0.5%、2%、5%、20%）生脈注射液與人源MDR1 和BCRP囊泡于37 ℃預(yù)孵育5 min，分別加入Reagent C2、N-甲基奎尼丁或熒光黃，在有ATP 或AMP 的條件下，于37 ℃孵育5 min。

各組加入預(yù)冷的Buffer B2 終止孵育，轉(zhuǎn)移至96 孔濾板，用真空泵抽濾，棄去濾液；加入0.2 mL預(yù)冷的Buffer B2 反復(fù)洗滌5 次；加入50 μL 80%甲醇溶解濾板上的囊泡，2000 r/min 離心2 min，離心2 次，收集濾液；合并2 次濾液，混勻，加入等體積0.05 mol/L H2SO4（N-甲基奎尼?。┗虻润w積DMSO（熒光黃），配制N-甲基奎尼丁或熒光黃標準曲線，采用酶標儀檢測樣本中N-甲基奎尼丁或熒光黃含量。N-甲基奎尼丁的激發(fā)光為355 nm，發(fā)射光為460 nm；熒光黃的激發(fā)光為428 nm，發(fā)射光為536 nm，其熒光強度與N-甲基奎尼丁或熒光黃水平成正比。計算底物被轉(zhuǎn)運到囊泡內(nèi)的轉(zhuǎn)運速率、相對活性和攝取率。

轉(zhuǎn)運速率＝(底物在ATP 驅(qū)動下的轉(zhuǎn)運量－底物在AMP驅(qū)動下的轉(zhuǎn)運量)/孵育時間×囊泡蛋白質(zhì)量

相對活性＝給藥組或陽性對照組代謝產(chǎn)物生成量/陰性對照組代謝產(chǎn)物生成量

攝取率＝陰性對照組或ATP 組探針底物轉(zhuǎn)運量/AMP 組探針底物轉(zhuǎn)運量

2.4 生脈注射液對OATP1B1 的體外抑制作用

2.4.1 HEK293 細胞培養(yǎng) 將人源HEK293-MOCK細胞作為HEK293-OATP1B1 細胞的陰性對照。細胞用含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（0.1 mg/mL）和遺傳霉素（0.5 mg/mL）的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的細胞以4×105/孔接種于24孔板中，當細胞融合度達到80%～90%時進行轉(zhuǎn)運實驗。

2.4.2 轉(zhuǎn)運實驗 棄去培養(yǎng)基，用預(yù)溫的轉(zhuǎn)移緩沖液（pH 7.4）清洗2 次，將第2 次緩沖液留置在板孔內(nèi)，于37 ℃靜置5 min，棄去緩沖液。設(shè)置陰性對照組、陽性對照組和生脈注射液（0.1%、0.5%、2%、5%、20%）組，陰性對照組加入預(yù)溫的含17β-葡萄糖苷-雌二醇（20 μmol/L）的空白緩沖液，陽性對照組加入預(yù)溫的含17β-葡萄糖苷-雌二醇（20 μmol/L）的利福平（100 μmol/L）溶液，生脈注射液組加入預(yù)溫的含 17β-葡萄糖苷-雌二醇（20 μmol/L）的生脈注射液，孵育10 min。棄去培養(yǎng)基，用4 ℃預(yù)冷的緩沖液洗滌3 次，棄去板內(nèi)殘余溶液；加入0.3 mL 蒸餾水，用液氮反復(fù)凍融3 次，使細胞完全裂解；取100 μL 細胞裂解液與含內(nèi)標甲醇按1∶4 沉淀，4 ℃、12 000 r/min 離心5 min，取上清，采用LC-MS/MS 方法檢測上清中的探針底物水平。取25 μL 細胞裂解液，用BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白質(zhì)量濃度。計算底物攝取速率、底物凈攝取速率、相對轉(zhuǎn)運活性和攝取率。

底物攝取速率＝細胞裂解液中被轉(zhuǎn)運的底物量/細胞蛋白質(zhì)量×孵育時間

底物凈攝取速率＝底物攝取速率－陰性對照組底物攝取速率

相對轉(zhuǎn)運活性＝給藥組或陽性對照組凈攝取速率/陰性對照組凈攝取速率

攝取率＝陰性對照組轉(zhuǎn)運體細胞的底物攝取速率/陰性對照組底物攝取速率

2.5 LC-MS/MS 測定 CYP450 酶以及轉(zhuǎn)運體OATP1B1 活力

2.5.1 色譜條件 DikmaInspire C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，5 μm）、Phenomenex SynergiTMHydro-RP 80 A 色譜柱（30 mm×2 mm，4 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫：0～0.70 min，90%～30% A；0.70～0.71 min，30%～5% A；0.71～1.20 min，5% A；1.20～1.21 min，5%～90% A；1.21～1.50 min，90% A；1.50～1.70 min，90%～30% A；1.70～2.01 min，30% A；2.01～2.30 min，30%～80% A。柱溫為45 ℃；進樣量為5 μL；體積流量為0.45 mL/min。

2.5.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源（ESI），多反應(yīng)監(jiān)測模式。ESI＋模式下，碰撞氣壓力為41.37 kPa，氣簾氣壓力為137.90 kPa，霧化氣壓力為344.75 kPa，輔助氣壓力為344.75 kPa，離子電壓為5000 V，離子噴射溫度為500 ℃。ESI-模式下，碰撞氣壓力為55.16 kPa，氣簾氣壓力為137.90 kPa，霧化氣壓力為344.75 kPa；輔助氣壓力為344.75 kPa，離子電壓為-4500 V，離子噴射溫度為500 ℃。目標代謝產(chǎn)物質(zhì)譜條件及其離子見表1。

表1 目標代謝產(chǎn)物質(zhì)譜條件及其離子Table 1 Mass spectrometric parameters for target metabolites and their ions

2.5.3 對照品溶液的配制 取對乙酰氨基酚、羥基安非他酮、6β-羥基睪酮、4-羥基雙氯芬酸、4-羥基美芬妥英、右啡烷、N-去乙基阿莫地喹和17-β-葡萄糖苷-雌二醇對照品適量，溶于甲醇溶液，分別配制成10 mmol/L 的對乙酰氨基酚、羥基安非他酮、6β-羥基睪酮、4-羥基雙氯芬酸、4-羥基美芬妥英、右啡烷的對照品儲備液，以及1 mg/mL 的N-去乙基阿莫地喹、17-β-葡萄糖苷-雌二醇的對照品儲備液。取丁螺環(huán)酮、維拉帕米、甲苯磺丁脲、特非那定對照品適量，溶于甲醇溶液，分別配制成10 mmol/L的丁螺環(huán)酮、甲苯磺丁脲、特非那定內(nèi)標儲備液，以及1 mg/mL 的維拉帕米內(nèi)標儲備液。

2.5.4 樣品處理 對標準曲線樣品、質(zhì)控樣品和測試樣品加入樣品50 μL，對空白樣品和空白質(zhì)控樣品加入空白基質(zhì)50 μL，對定量上限樣品加入不含內(nèi)標的樣品50 μL。標準曲線樣品、質(zhì)控樣品，空白質(zhì)控樣品和測試樣品中加入200 μL 內(nèi)標工作溶液（丁螺環(huán)酮10.0 nmol/L、維拉帕米0.400 ng/mL、甲苯磺丁脲20.0 nmol/L、特非那定10.0 nmol/L），向空白樣品和定量上限樣品加入200 μL 甲醇，室溫渦旋混勻10 min，4 ℃、4000 r/min 離心10 min，吸取200 μL 上清液至96 孔聚丙烯板中，進樣測定。

2.5.5 方法學(xué)考察

（1）檢出限、定量限、線性范圍和基質(zhì)效應(yīng) 在選擇的樣品處理、色譜與質(zhì)譜條件下，8 種目標代謝物在低、中、高3 個濃度水平上的絕對基質(zhì)效應(yīng)；分別以10 倍信噪比計算目標代謝物的定量限和檢出限。以各代謝產(chǎn)物濃度為橫坐標（X），各代謝產(chǎn)物與內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標（Y），建立線性回歸方程。如表2所示，8 種目標代謝物的線性相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.994，定量限為10 mmol/L，檢出限為10 mmol/L。

表2 8 種目標代謝產(chǎn)物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Linear equations,correlation coefficients,limits of detection,limits of quantitation and matrix effects of eight target metabolites

（2）精密度 通過計算低、中、高濃度（1.2、40、80 mmol/L）質(zhì)控樣品間的RSD 變化來考察精密度，最低濃度質(zhì)控樣品的RSD 在20%以內(nèi)，低、中、高濃度質(zhì)控樣品RSD 在15%以內(nèi)，可以認為精密度良好。結(jié)果見表3。

（3）提取回收率 通過比較樣品經(jīng)過提取后的色譜峰面積與未經(jīng)提取的色譜峰面積之間的比值來考察樣品前處理過程中的提取回收率。低、中、高濃度（1.2、40、80 mmol/L）質(zhì)控樣品提取回收率的RSD 在15%以內(nèi)，可以認為不同濃度下，樣品前處理過程中的提取回收率是一致的。結(jié)果見表3。

表3 8 種目標代謝產(chǎn)物的提取回收率和精密度(n=6)Table 3 Spiked recoveries and precisions of eight target metabolites(n=6)

2.6 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 生脈注射液對CYP450 酶的抑制作用

如表4所示，生脈注射液（0.1%、0.5%、3.0%、10.0%、30.0%）對人肝微粒體中CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6 和CYP3A4 酶活性均存在劑量相關(guān)性的抑制作用，IC50值分別為6.12%、2.72%、14.31%、12.96%、12.26%、3.72%；對人肝微粒體中CYP2C8 酶活性也存在抑制作用，其IC50值為10.00%～30.00%。

表4 生脈注射液對CYP450 酶相對活性的影響Table 4 Effect of Shengmai Injection on relative activity of CYP450

表4 生脈注射液對CYP450 酶相對活性的影響Table 4 Effect of Shengmai Injection on relative activity of CYP450

NA 表示未獲得NA means it has not obtained

組別 劑量/% 相對活性/%CYP1A2 CYP2B6 CYP2C8 CYP2C9 CYP2C19 CYP2D6 CYP3A4陰性對照 — 100.00±1.04 100.00±9.15 100.00±17.81 100.00±0.98 100.00±24.88 100.00±11.39 100.00±13.14陽性對照 — 14.41±0.69 15.22±0.46 34.34±1.84 15.59±0.52 30.13±5.23 9.13±0.29 3.86±1.96生脈注射液 0.1 101.65±4.29 110.18±3.51 97.48±7.49 98.79±1.34 113.26±19.49 102.42±2.54 112.13±31.07 0.5 100.69±6.86 87.40±4.48 126.73±14.46 100.00±1.96 119.26±1.14 104.83±2.74 96.13±NA 3.0 74.86±4.98 46.27±0.91 163.36±11.99 83.00±2.75 94.20±1.14 78.84±10.30 61.27±NA 10.0 29.34±2.94 15.27±0.52 163.99±4.25 57.91±1.32 52.46±9.72 57.39±2.72 21.44±1.44 30.0 15.00±1.33 14.69±0.81 46.23±1.23 32.68±1.46 21.01±4.99 25.65±0.63 2.93±0.42

3.2 生脈注射液對MDR1 與BCRP 的抑制作用

陰性對照組探針底物N-甲基奎尼丁和熒光黃的攝取率分別為14.2 和20.4，選擇性抑制劑分別抑制了MDR1 和BCRP 98.5%、97.1%的轉(zhuǎn)運活性，表明測試系統(tǒng)適合于本實驗。如表5所示，生脈注射射液（0.1%、0.5%、2.0%、5.0%、20.0%）抑制BCRP轉(zhuǎn)運熒光黃和MDR1 轉(zhuǎn)運N-甲基奎尼丁，呈劑量相關(guān)性，其IC50值分別為0.75%、0.15%。

表5 生脈注射液對MDR1 與BCRP 相對活性的影響Table 5 Effect of Shengmai Injection on relative activity of MDR1 and BCRP

表5 生脈注射液對MDR1 與BCRP 相對活性的影響Table 5 Effect of Shengmai Injection on relative activity of MDR1 and BCRP

組別 劑量/% 相對活性/%MDR1 BCRP陰性對照 — 100.00±3.82 100.00±7.53陽性對照 — 1.48±0.27 2.90±2.51生脈注射液 0.1 66.48±6.68 95.04±3.51 0.5 17.22±2.32 60.93±3.51 2.0 0.08±0.14 26.20±1.30 5.0 0.99±1.17 7.15±0.30 20.0 0 0.60±0.36

3.3 生脈注射液對轉(zhuǎn)運體OATP1B1 的抑制作用

陰性對照組轉(zhuǎn)運體OATP1B1 介導(dǎo)的探針底物的攝取率為23.9，陽性對照組加入選擇性抑制劑后，底物的轉(zhuǎn)運活性降低至陰性對照組的0.889%，表明轉(zhuǎn)運體的測試系統(tǒng)適合于本實驗。如表6所示，生脈注射液（0.1%、0.5%、2.0%、5.0%、20.0%）抑制OATP1B1 轉(zhuǎn)運活性，呈劑量相關(guān)性，其IC50值為2.03%。

表6 生脈注射液對 OATP1B1 相對活性的影響Table 6 Effect of Shengmai Injection on relative activity of OATP1B1

表6 生脈注射液對 OATP1B1 相對活性的影響Table 6 Effect of Shengmai Injection on relative activity of OATP1B1

組別劑量/% 相對活性/%陰性對照 — 99.90±2.04陽性對照 — 0.90±1.54生脈注射液 0.1 99.51±0.84 0.5 99.27±2.08 2.0 61.51±0.77 5.0 2.64±0.16 20.0 2.10±0.30

4 討論

隨著臨床藥物聯(lián)用的日益普遍，藥物相互作用已成為現(xiàn)今臨床醫(yī)療中不可回避的實際問題。目前臨床上藥物相互作用問題主要表現(xiàn)在代謝性藥物相互作用方面。據(jù)統(tǒng)計，臨床90%以上的代謝性藥物相互作用均由CYP450 酶活性的改變引起。1980—1998年，由于嚴重不良反應(yīng)的陸續(xù)發(fā)生，F(xiàn)DA 先后將其批準問世的13 種新藥從市場上撤出，其中有5 種藥物與CYP450 介導(dǎo)的代謝性藥物相互作用相關(guān)[16-18]。CYP3A4 的抑制劑酮康唑與特非那定聯(lián)合使用時，酮康唑抑制了特非那定的代謝，使特非那定積累到高水平，導(dǎo)致RR 間期和QT 間期顯著延長，最終可能造成尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速[19]。因此，當聯(lián)用藥物共同為CYP450 酶系的底物、抑制劑或激動劑時，容易出現(xiàn)藥物相互作用的可能，導(dǎo)致活性代謝產(chǎn)物或毒性代謝產(chǎn)物生成增多，從而減少藥效或增加不良反應(yīng)，影響藥物聯(lián)用的安全性或有效性[20-21]。在臨床診治過程中，為了使患者獲得更好的療效，中藥與西藥一般結(jié)合使用[22-24]，但大部分中藥無論以何種形式使用，在體內(nèi)均以化合物形式發(fā)揮其藥理作用，在代謝過程中，均可能與西藥發(fā)生作用，從而改變藥物的藥理學(xué)特性，產(chǎn)生代謝性藥物相互作用[25]。生脈注射液的應(yīng)用極為廣泛，不僅可以用于心力衰竭、冠心病心絞痛與心肌梗死等疾病的治療，而且還具有抗休克、輔助治療腫瘤等作用。Meta 分析顯示，較單純使用常規(guī)西藥相比，生脈注射液與常規(guī)西藥聯(lián)合使用時，不僅提高了心衰患者的臨床療效，而且對左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）和心功能分級（New York heart association classification，NYHA）心功能也有明顯改善[26]。但是，基于CYP450 酶與轉(zhuǎn)運體的代謝性藥物相互作用的相關(guān)研究幾乎空白，因此，無法評估生脈注射液與其他西藥聯(lián)用時的有效性和安全性。

本研究考察了生脈注射液對CYP450 酶系的影響，發(fā)現(xiàn)較對照組相比，生脈注射液在30%（v/v）濃度范圍內(nèi)可以抑制CYP450 酶底物非那西汀、安非他酮、阿莫地喹、雙氯芬酸鈉、S-美芬妥因、右美沙芬與睪酮分別向?qū)σ阴０被印⒘u基安非他酮、N-去乙基阿莫地喹、4-羥基雙氯酚酸、4-羥基美芬妥因、右啡烷、6β-羥基睪酮的生物轉(zhuǎn)化，表明生脈注射液對CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6 與CYP3A4 的活性具有抑制作用，其IC50值分別為6.12%、2.72%、10.00%～30.00%、14.31%、12.96%、12.26%、3.72%，其中對CYP2B6 的抑制作用最顯著。上述IC50值均顯著超過生脈注射液在人體內(nèi)的最大血藥濃度1.20%，表明生脈注射液在臨床常用劑量范圍內(nèi)，與上述酶底物聯(lián)用時發(fā)生藥物相互作用的可能性較小。

維拉帕米是經(jīng)FDA 批準的藥物相互作用臨床研究的MDR1 的抑制劑，與MDR1 底物地高辛聯(lián)合使用時，使地高辛的清除減少，導(dǎo)致地高辛血藥濃度升高40%～80%，容易造成地高辛中毒反應(yīng)[27]。替米沙坦通常用于高血壓的治療，研究表明替米沙坦可以通過抑制腸道BCRP，使腸細胞對瑞舒伐他汀的攝取量增加2.2 倍[28]。本研究發(fā)現(xiàn)生脈注射液對轉(zhuǎn)運體MDR1、BCRP、OATP1B1 均具有抑制作用，IC50值分別為0.15%、0.75%、2.03%，其中對MDR1 與BCRP 的抑制作用較顯著，其IC50值均未超過生脈注射液在人體內(nèi)的最大血藥濃度。因此，同樣作為MDR1 與BCRP 的抑制劑，生脈注射液與MDR1 及BCRP 底物結(jié)合應(yīng)用時可能存在藥物代謝性相互作用的風(fēng)險，但是否會產(chǎn)生由代謝性相互作用引起的藥物不良反應(yīng)，需要進一步的體內(nèi)實驗研究證實。

當前，隨著中西聯(lián)合用藥普遍性的增加，由此產(chǎn)生的藥物相互作用和不良反應(yīng)事件也隨之增加，因此，中藥與其他藥物間的聯(lián)合應(yīng)用的安全性和合理性受到越來越多關(guān)注。目前關(guān)于中藥對CYP450酶和轉(zhuǎn)運體活性影響的研究較少，缺乏指南指導(dǎo)下的系統(tǒng)性研究。為了使臨床上合理、安全、有效地聯(lián)合使用中西藥物，應(yīng)當加強中藥在藥物代謝方面的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突