徐麗偉，周凱旋，薛嘉寶，辛 國，李麗靜*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長春130021；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春130117）

免疫性血小板減少癥（ITP）是一種由于血小板自身免疫性破壞，外周血中血小板減少的自身免疫性出血性綜合征[1]，主要臨床表現(xiàn)為皮膚黏膜瘀點(diǎn)、瘀斑、月經(jīng)量多、尿血，嚴(yán)重者可因顱內(nèi)出血而危及生命[2]，在臨床上常用地塞米松進(jìn)行治療，抑制患者免疫功能，恢復(fù)細(xì)胞亞群間的平衡[3]。豨薟草是菊科植物豨薟（Siegesbeckia orientalis L）、腺梗豨薟（Siegesbeckia pubescens Makino）和毛梗豨薟（Siegesbeckia glabrescens Makino）的干燥地上部分，性寒，味辛、苦，歸肝、腎經(jīng)，可利關(guān)節(jié)、抗血栓、解毒、祛風(fēng)濕等[4]，研究顯示，豨薟草對關(guān)節(jié)腫痛具有良好的治療作用，具有一定的免疫抑制作用[5]，豨薟精醇是豨薟草中的有效成分[6]，在實(shí)驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)其具有一定的抗炎、調(diào)節(jié)免疫的作用[7]。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，分析豨薟精醇對免疫性血小板減少癥的作用及作用機(jī)制，并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對其作用進(jìn)行初步探究。

1 材料與方法

1.1 豨薟精醇靶點(diǎn)預(yù)測

通過Pubchem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索豨薟精醇的化合物結(jié)構(gòu)，復(fù)制Isomeric SMILES號至SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測。

1.2 ITP靶點(diǎn)獲得

使用GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org）以“Immune Thrombocytopenia”為關(guān)鍵詞對疾病的靶點(diǎn)進(jìn)行檢索，并使用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）對靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

應(yīng)用Cytoscape3.5.0軟件，將共有靶點(diǎn)基因?qū)耄L制化合物-靶點(diǎn)-疾病互作網(wǎng)絡(luò)圖并對共有靶點(diǎn)基因進(jìn)行匯總。

1.4 基因富集分析

利用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）對上述篩選出的共有靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（Gene ontology,GO）生物過程分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and gnomes,KEGG)通路富集分析。并選取前20個(gè)基因，使用易漢博生物信息在線作圖（www.ehbio.com）進(jìn)行氣泡圖的繪制。

1.5 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵靶點(diǎn)的獲取

運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），將共有靶點(diǎn)基因?qū)?，對Organism限定為homo sapiens，進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用分析，并選取三個(gè)參數(shù)（Degree、Betweenness和Closeness），設(shè)定條件為Degree大于中位數(shù)的2倍，Betweenness和Closeness大于中位數(shù)，所獲得的靶點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白。

1.6 豨薟精醇對刀豆蛋白誘導(dǎo)的脾細(xì)胞影響

1.6.1 動物

SPF級雄性Balb/C小鼠，體重為18～22g，6～8周齡，購于遼寧長生實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，合格證號:SCXK(遼)-2020-0001。

1.6.2 試劑與儀器

豨薟精醇 （B21355，上海源葉生物科技有限公司）；刀豆蛋白A（ConA）（C8110，北京索萊寶科技有限公司）；RPMI 1640培養(yǎng)液（31800，北京索萊寶科技有限公司）CCK-8試劑盒（KR675，同仁化學(xué)研究所）；胎牛血清（1861242，購于Gibco）；二氧化碳培養(yǎng)箱（311，ThermoFisher）；酶標(biāo)儀（EPOCH，Bio-Tek）。

1.6.3 脾細(xì)胞的制備

小鼠斷頸椎處死，超凈臺中無菌取脾臟。取出的脾臟用D-Hank's液沖洗3次，在D-Hank's液的培養(yǎng)皿中，用5 mL注射器柄研磨脾臟，使用200目的鋼篩過濾，1000 rpm離心5 min，棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液靜置3min，去除血紅細(xì)胞，D-Hank's洗3次，離心棄上清，含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液重懸。

1.6.4 脾細(xì)胞增殖活性檢測

在96孔板接種脾細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)量5000/孔，并將細(xì)胞分為正常組 （10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液），模型組 （5mg/L的ConA+10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液），豨薟精醇低劑量組（5mg/L的ConA+10μmol/L豨薟精醇+10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液），豨薟精醇高劑量組 （5mg/L的ConA+20μmol/L豨薟精醇+10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液）。每組5個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，每孔加入10μL的CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1h后，用酶標(biāo)儀檢測各孔450nm處的吸光值。

1.6.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 靶點(diǎn)收集結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過對豨薟精醇進(jìn)行預(yù)測，共獲得靶點(diǎn)112個(gè)，收集獲得ITP相關(guān)靶點(diǎn)3759個(gè)，通過構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，獲得共有靶點(diǎn)56個(gè)，詳見圖1。

圖1 豨薟精醇與ITP網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 GO生物學(xué)過程分析

在DAVID6.8數(shù)據(jù)庫對豨薟精醇和ITP共有的靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO生物學(xué)過程分析，結(jié)果以P值升序排列，取前20個(gè)條目，進(jìn)行分析繪制氣泡圖，豨薟精醇治療ITP的生物學(xué)過程主要涉及調(diào)節(jié)多個(gè)蛋白通路的磷酸化、調(diào)節(jié)一氧化氮的合成、調(diào)控JAK-STAT級聯(lián)、調(diào)控細(xì)胞的增殖凋亡和遷移等，詳見圖2。

2.3 KEGG通路分析

對豨薟精醇和ITP共有的靶點(diǎn)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果以P值升序排列，取前20個(gè)條目進(jìn)行分析，繪制KEGG通路富集分析氣泡圖，豨薟草治療ITP的通路主要涉及癌癥的途徑、催乳素信號通路、PI3K-Akt信號通路、ErbB信號通路、膠質(zhì)瘤、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、FoxO信號通路、GnRH信號通路等，詳見圖3。

圖3 豨薟精醇和ITP的KEGG通路分析

2.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵靶點(diǎn)

在STRING數(shù)據(jù)庫導(dǎo)入獲得的56個(gè)共有靶點(diǎn)基因，得到蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，詳見圖4，通過對蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，獲得5個(gè)作用網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶 點(diǎn) ， 分 別 為STAT3、EGFR、ESR1、HSP90AA1、MAPK8，詳見表1。

圖4 共有靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

表1 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白

2.5 豨薟精醇對脾細(xì)胞增殖的影響

使用ConA誘導(dǎo)脾細(xì)胞后，相較于正常組，模型組對脾細(xì)胞有顯著的增殖作用（P＜0.01），而加入豨薟精醇后，與模型組比較，豨薟精醇對ConA誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用，且抑制作用與給藥劑量呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性（P＜0.05，P＜0.01），見表2。

表2 豨薟精醇對脾細(xì)胞增殖的影響（n=5,x±s）

3 討論

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對豨薟精醇在ITP的治療機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其機(jī)制涉及到多個(gè)方面，具有多靶點(diǎn)，多通路的特點(diǎn)。富集分析結(jié)果表明，豨薟精醇可通過影響蛋白質(zhì)的磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移，并對一氧化氮的合成具有調(diào)節(jié)作用，一氧化氮對平滑肌細(xì)胞增生、血管張力、細(xì)胞免疫、細(xì)胞毒等具有調(diào)節(jié)作用[8]。發(fā)揮這些作用涉及了多條通路，催乳素是一種垂體肽激素，通過它可以對細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞存活產(chǎn)生影響進(jìn)而調(diào)節(jié)多種生理功能[9]，ITP中可以通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號通路，控制mTOR來進(jìn)行血小板自噬的調(diào)控，研究表明，增強(qiáng)血小板自噬功能可減輕血小板破壞[10]，活化的Akt可使FoxO蛋白受到抑制，調(diào)節(jié)FoxO信號通路，進(jìn)而調(diào)控Treg細(xì)胞的增殖，在ITP的治療中具有重要作用[11]。在關(guān)鍵靶點(diǎn)中，處于第一位的STAT3在免疫細(xì)胞中，活化的STAT3可導(dǎo)致免疫介質(zhì)的抑制和免疫抑制因子的促進(jìn)[12]，對ITP的治療具有積極的意義，表皮生長因子受體（EGFR）在免疫過程中有著重要作用，通過調(diào)節(jié)EGFR的表達(dá)[13]，對ITP的治療同樣具有積極的意義MAPK8在治療免疫相關(guān)疾病中同樣具有積極的作用，通過調(diào)節(jié)該靶點(diǎn)，進(jìn)而可以調(diào)節(jié)Th1、Th2細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[14]，發(fā)揮治療作用。脾臟是免疫應(yīng)答的重要場所和重要調(diào)節(jié)器官，含有多種免疫細(xì)胞與細(xì)胞因子，主要的免疫細(xì)胞是淋巴細(xì)胞[15]，在臨床中，ITP患者常有脾臟增生的表現(xiàn)，可采用脾部分切除的方法進(jìn)行治療[16]，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，豨薟精醇對ConA誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用，表明了其在臨床應(yīng)用上的潛力。

綜上所述，豨薟精醇對ITP的治療是通過影響多個(gè)生理過程來發(fā)揮治療作用的，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探究了豨薟精醇對ITP治療的作用機(jī)制，為后續(xù)深入實(shí)驗(yàn)研究提供了較為可靠的理論基礎(chǔ)。