梁敬崎，姜 蕾，王冰潔，潘 波，林 勇 ，崔玉東

(1 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江大慶，163319；2 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物有害生物綜合治理重點實驗室，?？冢?71101)

柑桔目前是我國栽培面積及產(chǎn)量最大的水果[1]，柑桔產(chǎn)業(yè)是我國南方農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)之一，也是我國柑桔主產(chǎn)區(qū)農(nóng)民增收的主要來源[2]。然而，在我國南方地區(qū)高溫高濕的氣候條件下，雜草生長旺盛，除草劑用量大，而草甘膦憑借劑型較多且高效、廣譜、適用范圍極廣的特點成為目前桔園除草的首選除草劑[3-5]。草甘膦在柑桔園里大量使用[5-7]，源源不斷地進入土壤，不僅造成土壤污染和生態(tài)失衡，而且藥害問題(影響柑桔生長，造成果實品質(zhì)和產(chǎn)量下降[8])也日益顯現(xiàn)。如何降低草甘膦對柑桔樹的生物可利用性，從而降低其對農(nóng)作物造成的藥害，提高果實品質(zhì)和食品安全，已經(jīng)是柑桔生產(chǎn)需要直面的課題。已有的研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓糞不僅是營養(yǎng)豐富的有機肥，而且能夠顯著改變土壤中殘留有機污染物的環(huán)境行為[9]，增強農(nóng)作物植株的抗逆能力[10]。筆者在前期研究的基礎(chǔ)上，對比研究了施用蚯蚓糞與否，土壤殘留草甘膦對柑桔幼苗的生物有效性和生物毒性效應(yīng)差異，以期為草甘膦污染土壤的修復(fù)與高效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

Acquity UPLC I-class 型超高效液相色譜儀。XEVO TQ-MS 型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀。色譜柱：Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)、 Waters HSS T3 (100 mm×2.1 mm,1.8 μm)。固相萃取小柱：C18(500 mg 6cc)、HLB(200 mg 6cc)。以上均購于美國Waters。甲醇、乙腈、甲酸(色譜純，美國Fisher)，丙酮、硼酸鈉、無水乙酸銨(分析純，廣東化學(xué)試劑廠)，9-芴基甲基三氯甲烷(99.0%，美國Sigma)，草甘膦標(biāo)準(zhǔn)品(98.6%，德國DR)，試驗用水(超純水系統(tǒng)制備)。

試驗用未污染表層土取自海南省儋州市國家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)(19.50°N, 109.48°E)。蚯蚓糞取自蚯蚓養(yǎng)殖場。土壤和蚯蚓糞樣品經(jīng)風(fēng)干，去除枯枝等，研磨過3 mm篩備用。

1.2 方法

1.2.1 柑桔幼苗培養(yǎng) 預(yù)試驗1：設(shè)計7個濃度的草甘膦處理，分別為0、0.15、0.45、1.35、4.05、12.15和36.45 mg/kg。在12.15 mg/kg時，抗氧化酶和丙二醛含量有明顯的變化，同時，基于田間草甘膦實際施用量及草甘膦在農(nóng)田產(chǎn)生的累積殘留情況[11]，決定選取12.15 mg/kg為最適的草甘膦濃度。

預(yù)試驗2：設(shè)計系列含量的蚯蚓糞處理，分別為2.5%、5%、10%和15%，草甘膦含量依據(jù)預(yù)試驗1確定為12.15 mg/kg。種植柑桔幼苗的生長情況顯示，5%處理組與10%處理組無顯著差異。綜合考慮經(jīng)濟性和實用性，選取了5%蚯蚓糞為試驗濃度。

正式試驗：依據(jù)預(yù)試驗1和預(yù)試驗2，設(shè)計了4個處理——CK，空白對照，即土壤不含草甘膦和蚯蚓糞；EWC，土壤中添加蚯蚓糞，含量為5.0%(質(zhì)量百分比)；Gly，土壤中添加草甘膦，含量12.15 mg/kg；Gly+EWC，土壤中同時添加蚯蚓糞和草甘膦，含量分別為5.0%和12.15 mg/kg。在1 L的塑料罐中，裝有1 200 g的上述不同處理的土壤，選取萌芽一致的紅桔種子播種到塑料罐中(每罐5株)，1罐為小區(qū)，每個處理重復(fù)5次。放置在人工氣候箱里培養(yǎng)，調(diào)節(jié)濕度為70%，明/暗循環(huán)(14/10 h，27/22 ℃，光照強度300 μmol·m-2·s-1)，每天定時補充水分。培養(yǎng)6周后，采集樣品進行相關(guān)檢測。

1.2.2 土壤和植物組織中草甘膦檢測 土壤中草甘膦的檢測：將土壤樣品按照固液比1∶5(m/v)與0.6 mol/L的KOH混合，超聲提取40 min，4 025 g離心20 min，取上清液，過HLB固相萃取小柱，收集流出液，取1 mL，參照Aparicio等[12]的方法進行衍生化，通過0.22 μm膜過濾，使用Waters Acquity UPLC I-class型超高效液相色譜/XEVO TQ-MS型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀進行檢測。

植物組織中草甘膦的檢測：取0.5 g植物組織，經(jīng)液氮研磨后與5 mL超純水混勻，加入2 mL二氯甲烷，超聲提取30 min，4 025 g離心20 min，取上清液。后續(xù)步驟與上述土壤中草甘膦的檢測相應(yīng)操作一致。

1.2.3 柑桔幼苗生長量測定 用皮尺測量從根基部到植株頂部的長度作為株高；量取主根長度作為根長[13]。新鮮的植物樣品在105 ℃恒溫烘箱中干燥20 min，80 ℃烘干48 h，稱量干質(zhì)量。

1.2.4 柑桔葉片葉綠素含量測定 取0.2 g新鮮葉片剪碎，浸泡在15 mL的丙酮∶無水乙醇∶超純水為4.5∶4.5∶1的浸提液中，避光浸提24 h，用分光光度計測定上清液中總?cè)~綠素含量[10]。

1.2.5 柑桔組織膜脂過氧化水平測定 參照Wang等[14]方法，通過測定硫代巴比妥酸反應(yīng)底物(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)來表征植物膜脂過氧化水平。新鮮的柑桔幼苗組織樣品于1 g/L三氯乙酸(TCA)中研磨勻漿，10 000 g 離心30 min，取上清液加入等體積5 g/L的硫代巴比妥酸(TBA)，混合后沸水浴中保溫30 min，迅速用冰水浴降溫至室溫，最后4 ℃、15 000 g 離心5 min。用分光光度計分別測定上清液在450、532和600 nm處的吸光度值，按公式：C (μmol/L)= 6.45 (A532-A600)-0.56A450計算TBARS含量。

1.2.6 柑桔組織抗氧化酶活力測定 參照Jiang等[10]的方法，將新鮮的柑桔幼苗葉和根經(jīng)50 mmol/L 磷酸鈉緩沖提取液勻漿提取獲得粗酶液。采用考馬斯亮蘭法[15]測定蛋白質(zhì)含量。超氧化物歧化酶(SOD，EC 1.15.11)活力測定采用氮藍四唑(NBT)光化還原法。過氧化氫酶(CAT，EC1.11.1.6)活力測定采用紫外吸收法。過氧化物酶(POD，EC 1.11.1.7)活力測定采用愈創(chuàng)木酚比色法。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST，EC 2.5.1.18)能催化GSH與CDNB結(jié)合，其結(jié)合產(chǎn)物的光吸收峰波長為340 nm，通過測定340 nm波長處吸光度上升速率即可計算出GST活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤中草甘膦的生物有效性

如表1所示，存在蚯蚓糞(Gly+EWC)時，土壤和柑桔幼苗中草甘膦的殘留量均較單施草甘膦(Gly)處理組有所下降，尤其是土壤中草甘膦含量下降了44.85%(p<0.01)。分析認為，由于蚯蚓糞不僅可以為土壤中微生物提供豐富的營養(yǎng)，能夠增強其對有機污染物的代謝能力[16]，而且蚯蚓糞本身富含多種微生物群落和酶能夠分解有機污染物[17]，使土壤中殘留的草甘膦減少，從而土壤中殘留的可供柑桔幼苗吸收富集的草甘膦總量明顯下降。然而，柑桔幼苗中草甘膦的積累量(含量)并未發(fā)生大幅下降，尤其根系中未發(fā)生顯著性變化，從草甘膦的生物富集系數(shù)(Bioconcentration factors,BCF)[9]來看，添加蚯蚓糞處理(Gly+EWC)柑桔樹幼苗地上部分的BCF值反而比未添加蚯蚓糞處理(Gly)的增加77.61%，同樣地，根的BCF值也增加78.49%。其原因可能是蚯蚓糞中高含量的速效磷會與草甘膦競爭土壤吸附位點，促進草甘膦的解吸，使其生物可利用性增強，從而更易于被植物吸收富集[18]。

表1 蚯蚓糞作用下草甘膦在土壤和柑桔樹幼苗中的蓄積情況

2.2 柑桔幼苗的生長

如圖1所示，不同處理柑桔幼苗生長由強到弱的排序如下：蚯蚓糞處理(EWC)>蚯蚓糞+草甘膦處理(Gly+EWC)>對照(CK)>草甘膦處理(Gly)。在沒有草甘膦脅迫條件下添加蚯蚓糞(EWC)，使柑桔幼苗的生長顯著優(yōu)于對照，株高及其干質(zhì)量分別增長了28.72%和25.00%，根長(主根)及其干質(zhì)量也分別為對照的1.10倍和1.60倍。與對照(CK)相比，草甘膦處理顯著抑制了柑桔樹幼苗的生長，使株高和根系(主根)的長度較對照分別降低了11.18%和35.22%，使柑桔樹幼苗莖葉和根系(主根)的干質(zhì)量分別降低了53.57%和42.49%。在草甘膦脅迫條件下添加蚯蚓糞(Gly + EWC)，使柑桔樹幼苗株高和根系(主根)的長度和干質(zhì)量均較草甘膦處理(Gly)明顯增加，其中株高及其干質(zhì)量分別增加了26.23%和140.11%，是對照的1.12和1.11倍；根系(主根)長度和干質(zhì)量分別增長了58.66%和96.73%，是對照的1.03和1.13倍，均達到顯著性差異(p<0.05)(見圖1)?？梢姡┯抿球炯S既能顯著促進柑桔幼苗生長，也能幫助柑桔幼苗應(yīng)對草甘膦脅迫，完全克服其不利影響。這可能與蚯蚓糞中富含植物生長所需的養(yǎng)分(如腐殖質(zhì)、N、P和K)以及有利于植物生長的微生物群落有關(guān)[10，19，20]。

2.3 柑桔幼苗對草甘膦脅迫的生理反應(yīng)

光合作用是植物生長發(fā)育的基礎(chǔ)。葉綠素是光合作用器官的重要組成部分，具有雙重功能，它捕捉光線，同時作為分離和傳輸電子的介質(zhì)，為隨后的光合產(chǎn)物的合成奠定了基礎(chǔ)[21]。因此，葉綠素含量可以直觀地反映植物光合作用是否受到外界影響。在本試驗條件下，柑桔樹幼苗培養(yǎng)42 d后的結(jié)果顯示，4種處理柑桔幼苗葉片總?cè)~綠素含量按照由大到小排列如下：EWC>Gly+EWC>CK>Gly。與CK相比，Gly處理總?cè)~綠素含量下降了16.63%；Gly+EWC處理的總?cè)~綠素含量是Gly處理的1.25倍，是CK的1.04倍(見圖2)。這說明，施用蚯蚓糞能夠促進柑桔幼苗的茁壯成長，在面對草甘膦脅迫時，總?cè)~綠素含量不降反升。

注：不同字母表示相同部位不同處理之間差異顯著(p<0.05)。

丙二醛(MDA)是膜脂過氧化作用的最終分解產(chǎn)物，它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷。在植物衰老生理和抗性生理研究中，丙二醛含量是一個常用指標(biāo)，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度，也可間接反映植物組織的抗氧化能力的強弱[22]。本研究采用硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBARS)法表征MDA水平，結(jié)果如圖2B所示。EWC處理柑桔幼苗的葉片和根系中的TBARS水平分別比CK顯著降低，說明施用蚯蚓糞有利于農(nóng)作物植株保持旺盛的新陳代謝，降低柑桔樹幼苗植株的MDA水平，延緩其衰老，這可能是由于蚯蚓糞有機肥具有供應(yīng)養(yǎng)分和改良土壤的雙重作用。單獨用草甘膦處理(Gly)使柑桔幼苗葉片和根系中TBARS含量較CK顯著增加，分別是CK的1.19倍和1.84倍，在蚯蚓糞參與下(Gly+EWC)，抑制了的TBARS含量的升高，葉和根中降幅分別達到12.09%和28.68%。這表明，施用蚯蚓糞能增強柑桔幼苗抗逆能力，緩解草甘膦毒害。

圖2 蚯蚓糞作用下草甘膦對柑桔樹幼苗總?cè)~綠素(A)和TBARS(B)含量的影響

在植物中，非生物脅迫(如農(nóng)藥等環(huán)境污染物)所導(dǎo)致植物體中活性氧的爆發(fā)和大量蓄積，除了會造成細胞膜脂過氧化加劇，細胞膜損傷和程序性凋亡，還會作為信號激活植物體內(nèi)的防御系統(tǒng)來應(yīng)對外界脅迫。由多種抗氧化酶組成的抗氧化酶系統(tǒng)是其中重要的途徑，它通過多種抗氧化酶的協(xié)同作用清除大量產(chǎn)生的以超氧陰離子(O2·-)和過氧化氫(H2O2)為代表的活性氧[23]。超氧化物歧化酶(SOD)被認為是植物抗氧化防御系統(tǒng)的第一道防線，它通過催化O2·-發(fā)生歧化反應(yīng)生成H2O2和O2，清除細胞中多余的O2·-[24]。對于H2O2，植物細胞器中存在一系列H2O2處理酶，通過調(diào)節(jié)H2O2水平來保護植物免受氧化應(yīng)激引起的細胞損傷[25]。其中，CAT在H2O2的清除效率上具有明顯優(yōu)勢，它大量存在于植物過氧化物酶體中，發(fā)揮著快速去除H2O2中的主導(dǎo)作用[26]。大量研究表明，CAT活力的變化對于處于逆境(如環(huán)境污染等)中的植物所承受的氧化脅迫水平具有指示作用[27,28]。POD也能夠清除過氧化氫，是另一種常用來指示植物中氧化應(yīng)激程度的關(guān)鍵酶[28]。植物GST通過催化谷胱甘肽對各種親電反應(yīng)底物的親核進攻，參與植物對各種生物或非生物脅迫的抵抗，包括外源性有毒物質(zhì)的解毒和植物組織中內(nèi)源性有毒代謝產(chǎn)物(如H2O2)的去除[10,28]。從圖3中可以看出，不同處理柑桔幼苗組織的多種抗氧化酶(SOD、POD、CAT、GST)活力從大到小排序均為：Gly>Gly+EWC>EWC>CK(p<0.05)?？梢姡跊]有草甘膦脅迫條件下施用蚯蚓糞，可以提高柑桔幼苗的抗氧化酶系統(tǒng)活力，從而使柑桔幼苗具備更強的抗氧化應(yīng)激能力，抗逆能力增強；在草甘膦脅迫條件下施用蚯蚓糞，可以使草甘膦誘導(dǎo)升高的酶活性明顯降低，氧化應(yīng)激得到緩解，與TBARS含量的變化趨勢一致，即施用蚯蚓糞可減輕草甘膦帶來的氧化脅迫傷害，從而削弱對抗氧化酶系統(tǒng)功能的需求[10]。植物體中的POD除了清除H2O2，還能引發(fā)色素變性和脂質(zhì)過氧化[29]。在Gly處理下，總?cè)~綠素含量下調(diào)和TBARS含量上調(diào)可能與POD活性過高有關(guān)。

圖3 蚯蚓糞作用下草甘膦對柑桔樹幼苗組織超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)活性的影響

3 結(jié)論

施用蚯蚓糞，雖然能增強土壤中草甘膦的生物可利用性，使其生物富集系數(shù)增大，從而更易于向農(nóng)作物植株傳輸富集，但是在蚯蚓糞的參與下土壤中草甘膦殘留大幅減少，柑桔幼苗蓄積的草甘膦不增反降，因此，總體上減輕了草甘膦脅迫壓力。施用蚯蚓糞，能提高柑桔幼苗葉綠素含量、抗氧化酶系統(tǒng)活力和抗逆能力，維持旺盛的新陳代謝，促進柑桔幼苗生長，能夠克服一定程度草甘膦脅迫造成的不利影響。以上發(fā)現(xiàn)對于草甘膦污染土壤的修復(fù)和高效利用具有參考意義。