何思銳，武 瑞，連 帥，王建發(fā)，張 迪，高 麗

（1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院， 黑龍江 大慶 163319；2. 黑龍江省牛病防制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 黑龍江 大慶163319）

牛白血病病毒（bovine leukemia virus，BLV）屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒， 主要引起牛地方流行性白血?。╡nzootic bovine leukosis，EBL）。 該病的特征主要包括持續(xù)性B 淋巴細(xì)胞增多及全身淋巴結(jié)腫大，潛伏期（一般為4～5 年）臨床癥狀不明顯，臨床發(fā)病后死亡率較高。 BLV 可將自身RNA 轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA，并整合至宿主基因組中以前病毒形式存在，且大多數(shù)BLV 感染牛因無(wú)明顯臨床癥狀被忽略。BLV 感染造成的奶牛泌乳量下降、淘汰率增加、免疫功能受損、患病風(fēng)險(xiǎn)升高及進(jìn)出口限制等問(wèn)題，制約著奶牛養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。 有調(diào)查顯示，子宮內(nèi)傳播是垂直傳播的重要途徑，病毒載量（proviral load levels，PVL） 越高，BLV 傳播的風(fēng)險(xiǎn)越高［1］。 目前，牛白血病的常規(guī)檢測(cè)方法是采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清BLV 抗體，但檢測(cè)成本較高且易出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果的問(wèn)題［2-3］，因 此，將 熒 光 定 量PCR 檢 測(cè)BLV 前 病 毒DNA 作為牛感染BLV 的輔助檢測(cè)方法。

近年來(lái)，諸如芬蘭［4］、瑞士［5］、丹麥［6］、荷 蘭［6］等西歐發(fā)達(dá)國(guó)家已相繼在全國(guó)范圍內(nèi)消滅了該病毒。 但在世界上其他地區(qū)，BLV 的感染和傳播仍然非常普遍，諸如阿根廷、哥倫比亞、日本、韓國(guó)和中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)奶牛BLV 感染陽(yáng)性率均超過(guò)40%［7-11］。 楊奕［12］2018 年調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)大陸地區(qū)奶牛BLV 陽(yáng)性感染率為49.1%。 2014 年師慶偉等［13］通過(guò)ELISA 方法檢測(cè)黑龍江省規(guī)模化奶牛場(chǎng)BLV 感染率為9.76%。 Yu 等［14］2019 年調(diào)查了黑龍江地區(qū)的9 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的BLV 感染情況，感染率在0～31.00%，大慶地區(qū)感染率為10.00%。但隨著國(guó)內(nèi)規(guī)?；翀?chǎng)的快速發(fā)展和管理水平的提高，BLV 感染情況可能有所改變。 定期檢測(cè)、早期預(yù)防BLV 感染對(duì)規(guī)?；翀?chǎng)防控、凈化該病具有重要意義，因此，該試驗(yàn)采用ELISA 和熒光定量PCR 法對(duì)大慶某規(guī)?；翀?chǎng)進(jìn)行了BLV 感染情況調(diào)查。

1 材料

1.1 試驗(yàn)樣品

隨機(jī)選取大慶市某規(guī)?；翀?chǎng)泌乳期奶牛107 頭，于尾根靜脈采集5 mL 血液至含EDTA 真空采血管中， 一式兩份并做好標(biāo)記，2～8 ℃保存帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑

BLV 陽(yáng)性質(zhì)粒， 由哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)；BLV 抗體ELISA 檢測(cè)試劑盒 （P02110-5）， 購(gòu)自IDEXX 公司；天根DNA 提取試劑盒（DP304-03），購(gòu)自天根生化（北京）科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（2×），購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 主要儀器

熒光定量PCR 儀（CFX96） 產(chǎn)自美國(guó)伯樂(lè)公司； 核酸蛋白質(zhì)測(cè)定儀產(chǎn)自美國(guó)熱電公司； 移液器、離心機(jī)均產(chǎn)自德國(guó)Eppendorf 公司。

2 方法

2.1 ELISA 檢測(cè)BLV 抗體

①試劑準(zhǔn)備：用稀釋緩沖液N.2 對(duì)陰、陽(yáng)性對(duì)照品和樣品進(jìn)行20 倍稀釋；用去離子水對(duì)濃縮洗滌液N.2 進(jìn)行10 倍稀釋；用稀釋緩沖液N.1 對(duì)濃縮酶標(biāo)抗體進(jìn)行100 倍稀釋。

②陰性對(duì)照孔：任取兩孔加入100 μL 稀釋好的陰性對(duì)照品；陽(yáng)性對(duì)照孔：任取兩孔加入100 μL稀釋好的陽(yáng)性對(duì)照品；樣品孔：加入100 μL 待檢樣品。旋渦振蕩器振蕩，充分混勻，蓋上蓋板，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h。

③取出孔板，棄掉孔中液體，每孔加入300 μL洗滌液，洗滌3 次，在最后一次棄掉液體后，甩凈拍干。

④每孔加入100 μL 稀釋的酶標(biāo)抗體，蓋上蓋板，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min。

⑤重復(fù)步驟③。

⑥每孔加入100 μL TMB 底物溶液N.13，室溫條件下，避光孵育20 min，每孔加入100 μL 終止溶液N.3。 利用酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品和對(duì)照品在450 nm 下的吸光值。

2.2 熒光定量PCR 檢測(cè)

2.2.1 引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)中BLV pol 基因特異性引物序列［15］設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成， 上游引物序列：5′-CCTCAATTCCCTTTAAACTA-3′； 下游引物序列：5′-GTACCGGGAAGACTGGATTA-3′； 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為120 bp。

2.2.2 DNA 的提取吸取300 μL 全血樣本置于1.5 mL 離心管中， 加入900 μL 的紅細(xì)胞裂解液，顛倒混勻， 室溫放置5 min，10 000 r/min 離心1 min，吸取上清液，留下白細(xì)胞沉淀；加入200 μL 緩沖液GA，振蕩至徹底混勻；加入20 μL Proteinase K溶液，混勻；加入200 μL 緩沖溶液GB，混勻，70 ℃水浴10 min 至清亮，去除內(nèi)壁水珠；加入200 μL無(wú)水乙醇，混勻15 s 后，將所得溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱CB3，12 000 r/min 離心30 s； 倒掉廢液， 向吸附柱CB3 中加入500 μL 緩沖液GD，12 000 r/min 離心30 s；倒掉廢液，將CB3 放入收集管， 向吸附柱CB3 中加入600 μL 漂洗液PW，12 000 r/min 離心30 s， 倒掉廢液， 將吸附柱CB3放入收集管；重復(fù)上一步驟；12 000 r/min 離心2 min，倒掉廢液，徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；將吸附柱CB3 轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的無(wú)RNA 酶離心管， 向吸附柱中間部位懸空滴加50 μL 洗脫緩沖液TE， 室溫5 min 后扯掉吸附柱CB3 的蓋子，將離心管管蓋扣在吸附柱CB3 上，12 000 r/min 離心2 min，將溶液收集到離心管中。

2.2.3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備用核酸蛋白質(zhì)測(cè)定儀測(cè)定BLV 陽(yáng)性質(zhì)粒濃度， 根據(jù)拷貝數(shù)計(jì)算公式［ 拷 貝/μL =（6.02 ×1023） ×（ng/μL ×10-9）/（DNA Length×660）］計(jì)算拷貝數(shù)為4.17×1010拷貝/μL。并進(jìn)行10 倍倍比稀釋（102～108），作為熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品。 反應(yīng)程序：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。

2.2.4 樣品檢測(cè)以提取的樣品DNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增， 總體系為25 μL。 反應(yīng)體系：ddH2O 9.5 μL， 上、 下游引物各0.5 μL （10 μmol/L），SYBR Premix Ex Taq（Tli RnaseH Plus）（2×）12.5 μL，DNA模板2 μL，按上述熒光定量PCR 反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)，并與ELISA 檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

3 結(jié)果

3.1 ELISA 與熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果

將107 份牛血清樣品進(jìn)行ELISA 檢測(cè)， 共檢出陽(yáng)性樣品34 份，ELISA 檢測(cè)陽(yáng)性率為31.78%；利用上述熒光定量PCR 檢測(cè)方法加以驗(yàn)證，對(duì)107 份DNA 樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，陽(yáng)性樣本數(shù)為40 份，陽(yáng)性率為37.38%；兩種檢驗(yàn)方法的陽(yáng)性重合率為85.00%（見(jiàn)表1）。

表1 ELISA 檢測(cè)與熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果

3.2 熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以665 ng/μL 的BLV 標(biāo)準(zhǔn)品為模板， 以起始模板濃度的對(duì)數(shù)為橫軸、Ct 值為縱軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 曲線方程為y＝-3.478x＋36.157， 相關(guān)性系數(shù)R2＝0.999 8。 在102～108拷貝/μL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（見(jiàn)圖1）。

圖1 熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3 熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果中的陽(yáng)性牛Cq值計(jì)算前病毒DNA 拷貝數(shù)，按照“高載量病毒＞1 000 拷貝數(shù)/ng＞低載量病毒”標(biāo)準(zhǔn)分出高、低病毒載量牛，高載量牛28 頭，占?？倲?shù)的26.17%，低載量牛12 頭，占陽(yáng)性?？倲?shù)的11.21%，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果

4 討論

為了解大慶市某規(guī)?；翀?chǎng)牛白血病病毒感染情況， 對(duì)采集的107 份樣品進(jìn)行了ELISA 檢測(cè)與熒光定量PCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示，ELISA 與熒光定量PCR 檢出率基本一致， 分別為31.78%和37.38%， 表明該牧場(chǎng)牛群中存在一定程度的BLV感染。 目前，OIE 規(guī)定的國(guó)際動(dòng)物貿(mào)易牛白血病檢疫指定試驗(yàn)為ELISA 試驗(yàn)［16］，ELISA 試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單便捷、敏感、快速，但對(duì)于處在感染早期的動(dòng)物，檢測(cè)靈敏度較低， 特異性抗體的檢出通常需要1個(gè)月以上［17-18］，圍產(chǎn)期母?？蓪LV 母源抗體通過(guò)初乳轉(zhuǎn)移給新生犢牛［19］，用血清學(xué)方法檢測(cè)早期和處于圍產(chǎn)期的BLV 感染牛易產(chǎn)生假陰性結(jié)果。 已知外源性BLV 感染牛后主要侵害B 淋巴細(xì)胞，以前病毒DNA 形式終生存在于宿主細(xì)胞染色體中［20-21］，檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞（PBMC）中的BLV前病毒DNA 可作為牛感染BLV 的證據(jù)。 該試驗(yàn)除采用ELISA 檢測(cè)外，又使用熒光定量PCR 法進(jìn)行了輔助確認(rèn)。 一些國(guó)家也通過(guò)ELISA 試驗(yàn)結(jié)合熒光定量PCR 檢測(cè)的措施篩查BLV 感染牛［22］。

該牧場(chǎng)存在一定程度的BLV 感染，可能與牧場(chǎng)動(dòng)物之間頻繁接觸有直接關(guān)系， 這會(huì)導(dǎo)致病毒在牛群中水平傳播。美國(guó)一項(xiàng)報(bào)告顯示，有65%的BLV 感染牛呈高病毒載量， 而且高病毒載量的牛傳染性高于低病毒載量牛［23］。 由于病毒載量是EBL 進(jìn)展的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素，將感染BLV 的奶牛進(jìn)行高、低病毒載量篩選，對(duì)防止病毒傳播有重要意義。 該次試驗(yàn)中，除檢測(cè)BLV 感染率外，通過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)，BLV 陽(yáng)性牛中70%（28/40）是高病毒載量牛，30%（12/40）是低病毒載量牛，這一結(jié)果與此前日本的一項(xiàng)報(bào)道結(jié)果相似［24］。 澳大利亞某牧場(chǎng)曾將BLV 感染牛，尤其是BLV 高病毒載量牛單獨(dú)飼養(yǎng)， 遠(yuǎn)離健康牛群從而使牧場(chǎng)BLV 感染率從63.8%下降到13.9%［25］。 由此可知，有效的BLV 監(jiān)測(cè)、BLV 陽(yáng)性牛的隔離以及良好的管理是將BLV傳播風(fēng)險(xiǎn)降至最低的關(guān)鍵。 BLV 對(duì)畜牧行業(yè)的影響還處在研究階段， 基于EBL 亞臨床性流行的特點(diǎn)，EBL 的流行性調(diào)查對(duì)養(yǎng)殖業(yè)凈化該病有著重大的意義。在今后的研究中，應(yīng)擴(kuò)大檢測(cè)范圍，明確東北地區(qū)乃至全國(guó)范圍BLV 感染情況。

5 結(jié)論

通過(guò)ELISA 方法對(duì)大慶市某牧場(chǎng)107 頭奶牛白血病病毒感染情況進(jìn)行調(diào)查， 并用熒光定量PCR 法加以驗(yàn)證。ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示：BLV 感染陽(yáng)性率為31.78%（34/107）；熒光定量PCR 結(jié)果顯示：BLV 感染陽(yáng)性率為37.38%（40/107）。 此外，通過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)，BLV 高載量牛占總數(shù)的26.17%（28/107），低載量牛占總數(shù)的11.21%（12/107），說(shuō)明該牛群中的BLV 可能存在較高傳染性。