趙曉雨，蘇浩昌，徐 煜，徐武杰，胡曉娟，文國樑，曹煜成，余招龍

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306； 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300； 3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所深圳試驗(yàn)基地，廣東 深圳 518121； 4.廣東冠利海洋生物有限責(zé)任公司，廣東 茂名 525400）

抗生素的大量使用及其在生物體內(nèi)的不完全代謝使其在自然界水體環(huán)境中殘留[1-2]，并通過養(yǎng)殖水源水的傳播途徑進(jìn)入養(yǎng)殖環(huán)境，還可能誘導(dǎo)形成抗生素抗性菌 (Antibiotic resistant bacteria, ARB) 和抗性基因 (Antibiotic resistant genes, ARGs)。近年來，ARGs已成為環(huán)境中的新型污染物，其借助可移動(dòng)遺傳元件轉(zhuǎn)移到病原菌的基因組中，使病原菌產(chǎn)生抗生素耐藥性，對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物甚至人體健康造成潛在威脅[3-5]。因此，抗生素及其ARGs的環(huán)境殘留問題受到廣泛關(guān)注。黃志堅(jiān)等[6]選取了139 株分離自水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的細(xì)菌，對(duì)氟氯霉素、磺胺、鏈霉素和甲氧芐啶等多種抗生素的抗性基因進(jìn)行了特征分析，結(jié)果顯示上述ARGs在所測菌株中均被檢出。據(jù)Su等[7]和Wang等[8]報(bào)道，在中國南方對(duì)蝦養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)，sul1和cmlA等多種ARGs在養(yǎng)殖水源水、池塘水、底泥和對(duì)蝦腸道中均有檢出。可見，已有不同種類的ARGs在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中傳播。

有學(xué)者認(rèn)為造成水產(chǎn)品中抗生素抗性殘留的主要原因是未經(jīng)處理的養(yǎng)殖尾水在養(yǎng)殖生產(chǎn)中被重復(fù)使用[9]?？茖W(xué)使用氧化劑對(duì)養(yǎng)殖水環(huán)境和相關(guān)設(shè)施進(jìn)行有效消毒，可防止水產(chǎn)病原菌積累，促進(jìn)養(yǎng)殖生物健康生長。漁用氧化劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的使用量大，且目前常用漁用氧化劑主要有氯制劑、溴制劑以及高錳酸鉀 (KMnO4)等[10]。漁用氧化劑中，含氯消毒劑 [ 次氯酸鈉 (NaClO) 和漂白粉等]價(jià)格較低、殺菌廣譜，其通過次氯酸的氧化作用對(duì)水體環(huán)境中的細(xì)菌起到殺滅作用；溴類消毒劑的主要作用成分是次溴酸，具有廣譜殺菌作用[10-11]；KMnO4是強(qiáng)氧化劑，溶于水后釋放新生態(tài)氧，使有機(jī)物氧化從而起到殺菌作用，在改良水質(zhì)方面也有很好的效果[12]。這些消毒劑因價(jià)格低廉、殺菌廣譜且高效，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用廣泛[11-12]。氧化劑對(duì)水體中微生物的不同細(xì)胞成分 (如氨基酸、脂類和核酸等) 的氧化能力存在較大差別，這也使得其對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗性基因 (Intracellular antibiotic resistant genes,iARGs) 和細(xì)胞外抗性基因 (Extracellular antibiotic resistant genes, eARGs) 的去除作用差異顯著[13]。隨著qPCR技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，ARGs的檢測與定量不再受限于抗性菌的可培養(yǎng)性，該技術(shù)也被廣泛用于定量研究ARGs的去除[13-14]。近年來，城市污水處理領(lǐng)域的相關(guān)研究顯示，活性氯和臭氧等普通氧化劑以及紫外線或過渡金屬離子參與的高級(jí)氧化作用均對(duì)ARGs產(chǎn)生了較強(qiáng)的去除效果[13-18]。這表明氧化消毒技術(shù)可以有效去除并控制水環(huán)境中ARGs的傳播。

水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中所用的氧化劑、消毒方法以及對(duì)水體環(huán)境的水質(zhì)需求，都與污水處理行業(yè)存在巨大差異，目前有關(guān)漁用氧化劑與消毒方法對(duì)水環(huán)境中ARGs的作用效果少見報(bào)道。對(duì)此，基于水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中氧化消毒技術(shù)的生產(chǎn)實(shí)踐，本研究選用NaClO、二溴海因 (C5H6Br2N2O2) 和KMnO43種常用漁用氧化劑，探討其對(duì)養(yǎng)殖水源水和池塘體水中常見的磺胺類抗性基因sul1的去除作用，探討從源頭上控制水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs傳播的可行性，為今后進(jìn)一步建立養(yǎng)殖環(huán)境質(zhì)量安全控制技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 KMnO4，磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鈉 (NaH2PO4)、氯化鈉(NaCl)、硫代硫酸鈉 (Na2S2O3)、濃硫酸 (H2SO4)、無水乙醇 (C2H6O)、異丙醇 (C3H8O)均為分析純(AR)，購自廣州化學(xué)試劑廠。C5H6Br2N2O2(純度≥98%) 購自麥克林 (上海)。NaClO儲(chǔ)備液 (質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥7.5%) 購自廣州化學(xué)試劑廠，用于產(chǎn)生活性氯 (Free available chlorine, FAC)[14]。N,N'-二乙基-1,4-苯二胺硫酸鹽 (C10H18N2O4S, ≥98%) 和 2,2'-聯(lián)氨-雙 (3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) 二胺鹽 (C18H24N6O6S4,＞98%) 購自梯希愛 (上海) 化成工業(yè)發(fā)展有限公司。TB Green Real Time qPCR Kit 購自日本TaKaRa公司。Power Soil Kit購自美國MOBIO公司，十六烷基三甲基溴化銨 (C19H42BrN, ≥99%) 購自阿拉丁。實(shí)驗(yàn)用水均為屈臣氏蒸餾水。實(shí)驗(yàn)主要使用儀器為LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 (Roche，瑞士)和紫外分光光度計(jì)(AOE instrument，上海)。

1.1.2 養(yǎng)殖水源水和池塘養(yǎng)殖水準(zhǔn)備 本實(shí)驗(yàn)所使用的養(yǎng)殖水源水和池塘養(yǎng)殖水體，均采自廣東冠利海洋生物有限責(zé)任公司的集約化養(yǎng)殖基地。對(duì)采水器具進(jìn)行提前消毒并用水源水或池塘水清洗3次，從水源和對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘選3個(gè)采水點(diǎn)，使用不銹鋼采水器采集水樣并分別混合到一起，裝入聚乙烯塑料桶中。用塑料瓶 (1 L) 收集采集到的水樣用于測定水質(zhì) (全程低溫放置至實(shí)驗(yàn)室)。水源水和池塘水的pH值均為6.6，其氨氮亞硝酸鹽氮和總有機(jī)碳 (TOC) 質(zhì)量濃度見表1。

表1 水源水和池塘水中氨氮、亞硝酸鹽氮和總有機(jī)碳質(zhì)量濃度Table 1 Concentrations of NH4+ -N, NO2? -N and TOC in water source and pond water mg·L?1

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氧化劑濃度的測定 根據(jù)養(yǎng)殖生產(chǎn)中所使用漁用氧化劑的實(shí)際濃度范圍，將其使用質(zhì)量濃度設(shè)為15 mg·L?1。實(shí)驗(yàn)前對(duì)所用KMnO4儲(chǔ)備液(5 g·L?1)、C5H6Br2N2O2儲(chǔ)備液 (0.2 g·L?1)和 NaClO儲(chǔ)備液 (質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥7.5%) 進(jìn)行有效濃度測定。其中，以ABTS分光光度法測定KMnO4濃度[19]和有效溴濃度[20]，以DPD分光光度法測定有效氯濃度[21]。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與樣品采集 分別按養(yǎng)殖水源水和池塘水設(shè)置NaClO組、C5H6Br2N2O2組、KMnO4組和對(duì)照組，每組3個(gè)平行。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別為未添加任何氧化劑和添加相應(yīng)氧化劑的養(yǎng)殖水源水和池塘養(yǎng)殖水體。將測試的養(yǎng)殖水源水和池塘水分別注入滅菌的200 mL帶蓋圓口瓶中，采集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的樣品用于檢測各組中的初始eARGs和iARGs。隨后加入相應(yīng)的氧化劑并緩慢攪拌使其達(dá)到設(shè)定的初始濃度。實(shí)驗(yàn)體系設(shè)為50 mL，環(huán)境溫度為25 ℃，樣品瓶置于暗處反應(yīng)2 h。取樣時(shí)間設(shè)為第5、第10、第30、第80和第120分鐘，測定各樣品瓶水體中的殘留氧化劑濃度，氧化劑作用效果以常用于消毒工程中的單位濃時(shí)積 (Cumulative integrated exposures, CT values) 表示[14]。反應(yīng) 2 h后，即時(shí)在水樣中加入大于氧化劑20倍摩爾濃度的 Na2S2O3溶液 (60 mmol·L?1) 中止反應(yīng)，并將水樣以0.22 μm孔徑濾膜過濾。所得濾膜與水樣置于?20 ℃保存，分別用于iARGs和eARGs檢測。

1.2.3 ARGs的檢測 以qPCR技術(shù)測定各樣品中ARGs的拷貝數(shù)，定量監(jiān)測sul1在漁用氧化劑作用下的含量變化。其中，用Power Soil Kit提取濾膜中的總DNA作為iARGs樣品。用CTAB法提取水樣中的總DNA作為eARGs樣品[22]。

所有樣品的qPCR檢測參考SYBR Green Real Time qPCR試劑盒、LightCycler 480熒光定量PCR儀的產(chǎn)品使用方法。本研究檢測的ARG為磺胺類抗性基因sul1，將克隆有目標(biāo)抗性基因的大腸桿菌(Escherichia coli) 標(biāo)準(zhǔn)菌株SR1在微生物培養(yǎng)箱(37 ℃) 中培養(yǎng)20 h，用天根質(zhì)粒提取試劑盒 (上海) 提取標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒并用NanoDrop2000測定提取質(zhì)粒的濃度以及純度。參照Wang等[8]的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以及確定qPCR的反應(yīng)體系。目的基因的引物序列以及退火溫度見表2。反應(yīng)結(jié)束后，查看熔解曲線以確定檢測的為目標(biāo)基因，查看擴(kuò)增曲線的反應(yīng)效率，獲得目標(biāo)基因拷貝數(shù)，并換算為所測樣品中目標(biāo)基因的絕對(duì)濃度(拷貝·mL?1)。

表2 qPCR所需引物Table 2 Primers used for quantitative PCR

1.3 數(shù)據(jù)分析

濃時(shí)積和對(duì)數(shù)去除值的計(jì)算公式為[17]：濃時(shí)積(mg·L?1·min) =氧化劑質(zhì)量濃度 (mg·L?1)×反應(yīng)時(shí)間(min)；對(duì)數(shù)去除值 (拷貝·mL?1) =log(C0·C?1)。其中，C0為反應(yīng)開始時(shí)ARGs的濃度，C為反應(yīng)結(jié)束時(shí)的濃度。

以Excel 2010軟件繪制圖表。圖中數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (±SD)”表示，采用SPSS 22.0軟件以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性水平設(shè)為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 3種漁用氧化劑對(duì)ARGs的去除效果

sul1在水源水和池塘水中檢出量均較高。水源水中細(xì)胞內(nèi)sul1 (i-sul1) 濃度和細(xì)胞外sul1 (e-sul1)濃度分別約為 2.67×105和 1.15×105拷貝·mL?1。漁用氧化劑作用2 h后，水源水中的i-sul1和e-sul1均有不同程度的去除。其中i-sul1的去除效果為NaClO 組 (1.2 log,P＜0.05) ＞C5H6Br2N2O2組 (0.4 log,P＜0.05) ＞KMnO4組 (0.2 log,P=0.184) (圖1-a)。e-sul1的去除效果為NaClO組 (1.4 log,P＜0.01)=C5H6Br2N2O2組 (1.4 log,P＜0.01) ＞KMnO4組(1.3 log,P＜0.01) (圖1-b)。

池塘水中細(xì)胞內(nèi)i-sul1和e-sul1濃度分別約為3.57×106和 7.88×104拷貝·mL?1。漁用氧化劑作用2 h后，池塘水中的i-sul1和e-sul1均有不同程度的去除。其中，僅NaClO組表現(xiàn)出對(duì)池塘水中isul1的去除能力，對(duì)應(yīng)的對(duì)數(shù)去除值為1.3 log(P＜0.01，圖2-a)。e-sul1的去除效果為KMnO4組(1.2 log,P＜0.01) ＞NaClO組 (0.5 log,P=0.065) ＞C5H6Br2N2O2組 (0.1 log,P=0.751，圖2-b)。

圖1 消毒前后水源水中i-sul1 (a) 和e-sul1 (b) 濃度的變化同一圖中標(biāo)有不同字母代表有顯著差異 (P＜0.05)；圖2同此Figure 1 Change in concentrations of i-sul1 (a) and e-sul1 (b) in water source before and after disinfectionDifferent letters in the same figure indicate significant difference (P＜0.05).The same case in Figure 2.

圖2 消毒前后池塘水中i-sul1 (a) 和e-sul1 (b) 濃度的變化Figure 2 Change in concentrations of i-sul1 (a) and e-sul1 (b) in pond water before and after disinfection

2.2 漁用氧化劑在養(yǎng)殖水源水和池塘水中的濃度變化

在水源水和池塘水中，活性氯的質(zhì)量濃度在初始階段變化最快。反應(yīng)5 min時(shí)，活性氯在水源水和池塘水中的質(zhì)量濃度分別降低了72%和66%(圖3-a)；2 h后活性氯濃度僅為其初始濃度的12%(1.8 mg·L?1，水源水) 和 3% (0.4 mg·L?1，池塘水)。過程中活性氯在水源水中所達(dá)到的最高CT值(215.3 mg·L?1·min) 為池塘水中相應(yīng)值 (75.2 mg·L?1·min)的 2.86 倍 (圖3-b)。

圖3 消毒過程中活性氯質(zhì)量濃度 (a) 及其所達(dá)到的濃時(shí)積 (b) 的變化Figure 3 Change in concentration of FAC (a) and reached CT value (b) during disinfection

KMnO4的質(zhì)量濃度在初始階段變化最快。反應(yīng)5 min時(shí)，KMnO4在水源水和池塘水中的質(zhì)量濃度分別降低了 18% (2.3 mg·L?1) 和 30% (4.5 mg·L?1，圖4-a)；2 h后KMnO4質(zhì)量濃度為其初始濃度的61% (9.1 mg·L?1，水源水) 和 46% (6.9 mg·L?1，水源水)。相較于活性氯，KMnO4在養(yǎng)殖水體系中均能保持較高濃度，且其在水源水中所能達(dá)到的最高 CT 值 (1 095.9 mg·L?1·min) 為池塘水中相應(yīng)值(825.2 mg·L?1·min) 的 1.33 倍 (圖4-b)。

圖4 消毒過程中高錳酸鉀質(zhì)量濃度 (a) 及其所達(dá)到的濃時(shí)積 (b) 的變化Figure 4 Change in concentration of KMnO4 (a) and reached CT value (b) during disinfection

3 討論

3.1 漁用氧化劑對(duì)iARGs和eARGs的去除效果

氧化劑被廣泛用于殺菌消毒和改善水質(zhì)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中發(fā)揮著重要作用。本研究選用3種常用的漁用氧化劑NaClO、C5H6Br2N2O2和KMnO4，研究了其在養(yǎng)殖相關(guān)水環(huán)境中對(duì)ARGs (iARGs和eARGs) 的去除作用。結(jié)果顯示，水源水和池塘水中i-sul1濃度遠(yuǎn)高于e-sul1 (P＜0.01)，說明養(yǎng)殖相關(guān)的水環(huán)境中，i-sul1是水環(huán)境中sul1的主要存在形式，抗性菌是sul1在水環(huán)境中傳播的主要介質(zhì)，這與Mao等[24]報(bào)道的多種自然水體環(huán)境中iARGs濃度遠(yuǎn)高于eARGs濃度的結(jié)果一致，可見，盡管eARGs不容忽視，但養(yǎng)殖水環(huán)境中ARGs的去除主要取決于iARGs的去除。Jeon等[25]研究表明池塘養(yǎng)殖環(huán)境中的和有機(jī)質(zhì)等還原性物質(zhì)均會(huì)與次氯酸和次溴酸反應(yīng)生成氯胺(NH2Cl)、溴胺 (NH2Br) 及有機(jī)氯 (溴) 化物，且其過程的反應(yīng)速率 (高水平) 快于DNA與氧化劑的反應(yīng)速率 (中等水平)，從而對(duì)所添加的氧化劑造成消耗，高錳酸鉀也會(huì)與無機(jī)氮和醇、醛、酯、酸等多種有機(jī)物反應(yīng)且被廣泛用于水環(huán)境中污染物的去除[26]。有研究報(bào)道，污水體系中上述還原性物質(zhì)含量顯著影響ARGs的氧化去除效率[17]。表1顯示池塘水中還原性物質(zhì)濃度高于水源水，表明池塘水還原性強(qiáng)于水源水。此外，化學(xué)需氧量 (COD) 是衡量水環(huán)境還原性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，是特定條件下水環(huán)境中還原性物質(zhì)的需氧量。COD可由水環(huán)境中KMnO4的消耗量換算為O2的消耗量得出，此情況下其被稱為KMnO4指數(shù)。在本研究的養(yǎng)殖水體系中，水源水中KMnO4消耗量 (5.9 mg·L?1)低于池塘水 (8.1 mg·L?1)，這間接反映了COD的高低，從而也表明池塘水還原性強(qiáng)于水源水。

標(biāo)準(zhǔn)電極電勢數(shù)據(jù) (25 ℃) 表明：Mn7+/Mn4+(1.68 V) ＞ Cl+/Cl?(1.48 V) ＞ Br+/Br?(1.33 V)，故本研究所選3種氧化劑中，次氯酸的氧化性強(qiáng)于次溴酸，且Mn7+氧化能力最強(qiáng)。水源水和池塘水中，NaClO對(duì)i-sul1的去除效果強(qiáng)于C5H6Br2N2O2和KMnO4[水源水 (1.2 log＞0.4 log＞0.2 log) 和池塘水(1.3 log＞0 log)]，i-sul1位于抗性菌內(nèi)，因此漁用氧化劑必須首先作用于細(xì)胞且進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)才可與其反應(yīng)?；钚月扰c細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的多種物質(zhì)都有較強(qiáng)的反應(yīng)活性，同時(shí)它還可以穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，而不會(huì)造成顯著的細(xì)胞膜損傷[27]，這保證了其對(duì)iARGs的去除效果。C5H6Br2N2O2的主要活性成分為次溴酸，其與NaClO同屬鹵素類消毒劑，雖性質(zhì)相似，但次溴酸氧化能力弱于次氯酸，這可能是本研究中其對(duì)ARGs的去除能力低于NaClO的原因。雖然Mn7+/Mn4+氧化還原電勢最高，但其氧化性在酸性條件下較強(qiáng)且受體系pH影響最大 (由能斯特方程得出)。本研究中氧化作用在接近于中性的體系中進(jìn)行 (所選水源水和池塘水的pH均為6.6)，這解釋了本研究中KMnO4對(duì)i-sul1的去除效果最弱的原因，說明其在養(yǎng)殖水體系中對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗性基因的氧化能力較弱。

在水源水中，漁用氧化劑NaClO、C5H6Br2N2O2和KMnO4均對(duì)e-sul1有較強(qiáng)的去除效果 (1.4 log、1.4 log和1.3 log)；在池塘水中，NaClO和C5H6Br2N2O2對(duì)e-sul1的去除效果相對(duì)較弱 (分別為0.5 log和0.1 log)，而KMnO4對(duì)e-sul1的去除效果為1.2 log，顯著強(qiáng)于另外兩種漁用氧化劑 (P＜0.05)。這表明池塘水中還原性較強(qiáng)的特點(diǎn)并未影響KMnO4對(duì)eARGs的去除效果，卻顯著減弱了NaClO和C5H6Br2N2O2對(duì)eARGs的去除效果。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，KMnO4不僅可以滅活微生物，還有促進(jìn)絮凝、改善水質(zhì)的作用[12]，這是因?yàn)镵MnO4氧化還原性物質(zhì)的過程會(huì)生成促凝劑，其主要包括二氧化錳 (MnO2) 或水合氧化錳等一些錳氧化物[28]，這些促凝劑會(huì)增強(qiáng)KMnO4對(duì)污染物的去除作用。有研究報(bào)道，KMnO4在中性條件下會(huì)生成溶解性較低且吸附作用強(qiáng)的水合MnO2膠體，使得該條件下水環(huán)境中有機(jī)污染物的去除效果超過50%，明顯優(yōu)于酸性或堿性條件下的相應(yīng)效果[26]。Zhang等[15]的研究也表明KMnO4單獨(dú)作用對(duì)ARGs無去除效果，而錳氧化物的絮凝作用和KMnO4的氧化作用相結(jié)合時(shí)，卻表現(xiàn)出較強(qiáng)的ARGs去除效果 (0.6～4.23 log)。故本研究所選養(yǎng)殖水中還原性物質(zhì)含量較高的特點(diǎn)有利于KMnO4對(duì)ARGs的去除，這可能是KMnO4在還原性較強(qiáng)的池塘水中仍能有效去除e-sul1的原因，也是與NaClO和C5H6Br2N2O2相比，KMnO4去除eARGs過程的特點(diǎn)。然而本研究的KMnO4組中，i-sul1的去除效果弱于e-sul1，這也與Zhang等[15]的結(jié)論一致，這可能與細(xì)胞結(jié)構(gòu)對(duì)iARGs的保護(hù)作用有關(guān)，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

3.2 消毒過程中漁用氧化劑濃時(shí)積的變化

從消毒劑濃度變化的角度看，反應(yīng)2 h后池塘水中活性氯質(zhì)量濃度僅為0.4 mg·L?1，而水源水中則為1.8 mg·L?1，說明活性氯在池塘水中的消耗大于其在水源水中的消耗，這可能與池塘水還原性較強(qiáng)有關(guān) (表2)?；钚月仍谶€原性較弱的水源水中所達(dá)到的最高濃時(shí)積約為池塘水中相應(yīng)值的2.86倍(P＜0.05)，說明其濃時(shí)積受水環(huán)境還原性影響顯著。水處理工藝中常規(guī)氯化作用濃時(shí)積范圍為10～100 mg·L?1·min (25 ℃)[13]，而水產(chǎn)養(yǎng)殖研究領(lǐng)域暫未見關(guān)于消毒過程中濃時(shí)積的相關(guān)報(bào)道，本研究中初始質(zhì)量濃度為15 mg·L?1的活性氯在水源水和池塘水中達(dá)到的濃時(shí)積范圍遠(yuǎn)高于污水處理 (75.2～215.3 mg·L?1·min)。有研究顯示，在還原性弱的中性磷酸鹽緩沖液體系中，上述濃時(shí)積范圍內(nèi)的氯化作用對(duì)ARGs去除效果可達(dá)到4 log[17-18]。而還原性強(qiáng)的污水體系中ARGs的去除效果相對(duì)較低，15 mg·L?1活性氯對(duì)城市污水體系中e-amp和iamp的去除效果為 1～1.5 log，且 12.5 mg·L?1以上的活性氯才對(duì)eARGs和iARGs均有去除效果[17]；15 mg·L?1活性氯對(duì)另一污水體系中i-sul1的去除效果僅為0.19～0.27 log，所對(duì)應(yīng)的CT值卻高達(dá)450 mg·L?1·min[29]。以上研究表明，不同的水介質(zhì)由于還原性不同，氧化作用對(duì)ARGs的去除效果及其對(duì)應(yīng)的濃時(shí)積也不同。本研究中NaClO在水產(chǎn)養(yǎng)殖相關(guān)的水環(huán)境中也可去除eARGs (0.5～1.4 log)和iARGs (1.2～1.3 log)，其效果與對(duì)應(yīng)的CT值可為實(shí)際養(yǎng)殖中的消毒過程提供參考。

養(yǎng)殖水中C5H6Br2N2O2的濃度未被檢出，但其僅在還原性較弱的水源水中表現(xiàn)出較強(qiáng)的ARGs去除效果 (0.4～1.4 log)，表明其可能在還原性強(qiáng)的池塘水中被迅速消耗。盡管有研究報(bào)道10 mg·L?1的C5H6Br2N2O2可有效滅活養(yǎng)殖水環(huán)境中的細(xì)菌和弧菌[30]，但本研究表明 15 mg·L?1的 C5H6Br2N2O2對(duì)池塘水中ARGs的去除能力有限。與NaClO組一致，KMnO4在兩種體系中的濃時(shí)積值差異顯著(P＜0.05)，但均持續(xù)升高，最高值僅相差1.33倍(差異小于NaClO組對(duì)應(yīng)的2.86倍)，這與Fan等[31]的研究結(jié)果一致，說明其氧化性受還原性物質(zhì)的影響小于NaClO，其氧化持久性的特點(diǎn)有利于其對(duì)養(yǎng)殖水中的eARGs表現(xiàn)出更強(qiáng)的去除作用。

此外，反應(yīng)第2小時(shí)氧化劑的濃度已趨于穩(wěn)定，按照其此時(shí)的消耗量，水源水和池塘水中所需的活性氯質(zhì)量濃度需分別高于13.2和14.6 mg·L?1，所需的KMnO4質(zhì)量濃度需分別高于5.9和8.1 mg·L?1。這有助于氧化劑游離活性成分的產(chǎn)生 (如發(fā)生折點(diǎn)氯化作用)，從而實(shí)現(xiàn)更好的ARGs氧化去除效果。從該角度看，對(duì)于所選質(zhì)量濃度15 mg·L?1，兩種體系中NaClO的劑量適中，而KMnO4劑量則相對(duì)過高。結(jié)合本研究中氧化劑去除ARGs效果，養(yǎng)殖清塘中可使用價(jià)格較低、效果較好的含氯氧化劑去除ARGs，但本研究表明其濃時(shí)積受水體還原性影響較大 (相差2.86倍)，在池塘水中需要過量使用以達(dá)到持久氧化的效果。KMnO4在清塘環(huán)節(jié)可以持久、有效地去除eARGs，從而切斷其水平傳播途徑，且KMnO4濃時(shí)積受水體還原性影響較小 (相差1.33倍)，無需過量使用。

3.3 影響?zhàn)B殖水環(huán)境中ARGs去除的因素

首先，本研究所用氧化劑的質(zhì)量濃度均為15 mg·L?1，通常的水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，在苗種放養(yǎng)前的清塘消毒環(huán)節(jié)會(huì)使用到如此高濃度的氧化劑，即利用漁用氧化劑去除養(yǎng)殖水環(huán)境中的ARGs可以在清塘環(huán)節(jié)實(shí)現(xiàn)，且選擇含氯氧化劑效果更佳[32]。此外，本研究表明NaClO和C5H6Br2N2O2在水源水環(huán)境中可有效去除iARGs (0.4～1.2 log) 和eARGs(1.4 log)，即養(yǎng)殖前使用高濃度鹵族氧化劑對(duì)水源水進(jìn)行消毒可實(shí)現(xiàn)從水源途徑控制ARGs的傳播。而在池塘水環(huán)境中，NaClO對(duì)iARGs和eARGs的去除效果均較好，故而應(yīng)被選用。其次，本研究表明水源水和池塘水體系還原性的不同影響了ARGs的去除效果，強(qiáng)還原性減弱了NaClO和C5H6Br2N2O2對(duì)eARGs的去除效果，但有利于KMnO4去除eARGs。所以，在考慮ARGs的去除時(shí)，計(jì)算氧化劑實(shí)際用量時(shí)應(yīng)將環(huán)境中還原性物質(zhì)的影響考慮在內(nèi)。使用含氯氧化劑前，可以采取一些措施 (如預(yù)氧化、增氧和曝氣等) 盡可能降低養(yǎng)殖水中的還原性，使得ARGs的去除效果更佳，另外還可以結(jié)合KMnO4的持久氧化作用更好地去除eARGs。再者，本研究表明iARGs為ARGs的主要存在形式，因此應(yīng)將iARGs的去除作為控制ARGs在養(yǎng)殖水環(huán)境中傳播的重要因素。

水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，其水質(zhì)和底質(zhì)的環(huán)境狀況和生物群落組成等因素有可能影響氧化劑去除ARGs的效果，ARGs在不同環(huán)境條件下的響應(yīng)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。