王廣成，王紹平，邵 銳 ，賈亞文，楊 程，王麗行，潘 鑫

(1．安徽馬鋼礦業(yè)資源集團(tuán)南山礦業(yè)有限責(zé)任公司，安徽 馬鞍山 243000；2．合肥工業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；3．中鋼集團(tuán)馬鞍山礦山研究總院股份有限公司，安徽 馬鞍山 243000)

1 引言

酸性礦山廢水(Acid mine drainage，AMD)是礦山開采過程中/開才結(jié)束后金屬硫化礦物(如黃銅礦、黃鐵礦)長期暴露于露天環(huán)境，在微生物驅(qū)動(dòng)下，經(jīng)大氣、水共同作用發(fā)生的氧化性溶解形成的酸性廢水，是世界上普遍的環(huán)境問題[1，2]。其典型特征為低pH(一般pH<3)，含有高濃度溶解性有毒金屬離子(Fe、Mg、Mn、Al等)和高濃度硫酸鹽[1～3]。未經(jīng)處理的酸性礦山廢水若直接排放到環(huán)境中會(huì)污染周邊水生、陸生環(huán)境，抑制動(dòng)植物生長甚至危害人類健康[4]。由于危害性大，成份復(fù)雜，處理難度高，AMD長期受到廣泛的關(guān)注研究。

作為典型的極端生態(tài)環(huán)，AMD中的微生物群落結(jié)構(gòu)特征一直是研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域[5～8]。極端微生物對(duì)于AMD的形成，演化與修復(fù)過程至關(guān)重要，如Acidithiobacillusferrooxidans能加速礦物的氧化溶解、水體酸化過程，是促進(jìn)AMD形成的最普遍的菌種之一[9]。硫酸鹽還原菌是目前AMD生物反應(yīng)器中最常用的功能菌屬，具有廣泛的應(yīng)用前景[10～12]。因此，關(guān)注極端環(huán)境中的微生物種類對(duì)于AMD的源頭生態(tài)治理和末端治理至關(guān)重要。為全面了解酸性礦山廢水的水質(zhì)和微生物結(jié)構(gòu)的空間分布特征，本研究從某安徽省某酸水庫采集了不同水深的樣品進(jìn)行了理化指標(biāo)的表征和微生物群落的分析。

2 材料與方法

2.1 采樣位點(diǎn)及樣本采集

采樣點(diǎn)為安徽省馬鞍山市某礦山開采結(jié)束后遺留礦坑形成的酸水庫，該水庫面積約為0.1268 km2。本研究為全面監(jiān)測酸水庫的動(dòng)態(tài)變化和了解嗜酸微生物在不同水深空間處的分布情況，采集了不同深度梯度(水下0.5 m、5 m、10 m、15 m)的水樣和微生物樣品。水樣采用有機(jī)玻璃采樣器進(jìn)行采集并使用500 mL干凈的聚乙烯采樣瓶分裝儲(chǔ)存；生物樣品利用0.22 μm混合纖維素脂濾膜富集。所有樣品于4 ℃低溫冷藏保存運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室測量相關(guān)理化指標(biāo)。

2.2 理化指標(biāo)測定

每個(gè)位點(diǎn)的溫度(T，temperature)、pH值、溶解氧(DO，dissolved oxygen)、氧化還原電位(ORP，redox potential)利用六位參數(shù)儀進(jìn)行現(xiàn)場測定。經(jīng)預(yù)處理低溫冷藏保存的水樣過膜后采用TOC儀(耶拿multi N/C 3000，德國)測定TN、DOC、DIC含量；磷酸鹽和總磷采用鉬酸銨光譜法測定；氨氮濃度通過納氏試劑分光光度發(fā)獲得；Fe(Ⅱ)采用鄰菲羅啉分光光度法測定；硫酸鹽用離子色譜法(戴安 ICS-900，美國)進(jìn)行測定；溶解性重金屬離子Cu、Zn、Mn、Mg、Ca等采用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)進(jìn)行測定。

2.3 DNA提取，PCR擴(kuò)增和高通量測序

所有樣品DNA采用FastDNA Spin Kit for Soil (MP Biomedical)試劑盒進(jìn)行提取，用微量分光光度計(jì)測定DNA濃度。原核生物利用通用引物F515和R806擴(kuò)增細(xì)菌。樣品送往廣州美格公司進(jìn)微生物測序。

3 結(jié)果和討論

3.1 非金屬理化指標(biāo)的垂向分布

結(jié)果表水和下層水各理化指標(biāo)均存在差異，相同水深的水樣差異較小(圖1)。酸水庫表水溫度為17.0～17.2 ℃，下層水溫度為16.6～17.0 ℃，表水高于下層水并且隨著深度的增加，溫度逐漸降低，光照時(shí)間的長短和光照強(qiáng)度對(duì)水體溫度影響最大。表水pH值為3.33～3.46，下層水為3.51～3.69，表水pH值相對(duì)較低，隨著深度增加，pH值逐漸升高。此外，表水的溶解氧和氧化還原電位相對(duì)較高，下層水隨著深度增加溶解氧濃度和氧化還原電位降低。總體上，酸水庫呈現(xiàn)出明顯的水質(zhì)分層。表水層為氧化環(huán)境，pH值更低，這可能是由于以下三個(gè)原因：①酸水庫周邊堆放的尾礦(以硫鐵礦為主)在水和大氣的共同作用下產(chǎn)生酸水并向酸水庫表水輸入[13]；②酸水庫表水亞鐵氧化為三價(jià)鐵后水解產(chǎn)酸：Fe3++H2O-—Fe(OH)3(s)+3H+；③次生礦物(主要為黃鉀鐵礬和施氏礦物等)的形成過程也會(huì)產(chǎn)生氫離子。表水中氮磷等營養(yǎng)元素的含量更少，可能是由于藻類的繁殖吸收了大量營養(yǎng)元素[14]。此外，藻類死亡后沉積至酸水庫底部，其生物質(zhì)被微生物降解，從而在下水層釋放更多的營養(yǎng)物質(zhì)。

圖1 酸水庫中物理性指標(biāo)的垂向變化

3.2 金屬離子濃度的垂向分布

酸水庫表水與下層水存在較大差異(圖2)。除了鈣離子和銅離子，其他金屬離子基本表現(xiàn)為表水濃度遠(yuǎn)小于下層水。表水中亞鐵和總鐵濃度分別為1.6～2.4 mg/L和98.4～119.1 mg/L，相對(duì)于下層濃度326.2～442.9 mg/L和355.4～586.0 mg/L較低，并且二價(jià)鐵在表水中占的比例較小，說明水體中鐵離子主要以三價(jià)鐵及其他形式存在。水體無機(jī)營養(yǎng)鹽充足，表水中的藻類微生物生長較好，使得表水溶解氧維持在較高濃度，加速了亞鐵離子的氧化，三價(jià)鐵在水中發(fā)生水解等一系列反應(yīng)，導(dǎo)致亞鐵離子濃度遠(yuǎn)小于下層水體。同時(shí)，該水體中含有大量硫酸根等，可促進(jìn)鐵離子形成施氏礦物等，向下沉降或吸附于岸邊，使得表水中鐵離子濃度小于下層水。表水中的錳、鎂、鋁、鋅離子濃度分別為348.0～420.3 mg/L、2447.0～3184.0 mg/L、759.6～796.0 mg/L、18.2～22.2 mg/L低于下層水的濃度為669.5～852.5mg/L、4931.0～7036.0 mg/L、920.6～1169.0 mg/L、30.0～41.6 mg/L。這些金屬離子可能被水體中形成的施氏礦物等聚集體吸附，向下層水沉降[15]。另外，酸水庫表面存在豐富的微生物，經(jīng)過長期馴化，已經(jīng)適應(yīng)低pH、高金屬離子濃度的環(huán)境，這些微生物可以通過自身分泌出的有機(jī)物上的陰離子官能團(tuán)與金屬陽離子結(jié)合從而對(duì)金屬離子進(jìn)行富集，并且隨著微生物消亡逐漸向下層累積。

圖2 酸水庫中金屬離子濃度的垂向變化

3.3 原核細(xì)菌的微生物分布

原核微生物測定結(jié)果如圖3所示。酸水庫中的微生物群落存在顯著分層特征，主要分為好氧異養(yǎng)的表層微生物和下層耐受性強(qiáng)的微生物。其中表水主要為變形菌門(Proteobacteria)，放線菌門(Actinobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)的微生物，相對(duì)豐度分別為68.9%，24.7%，3.6%。這些微生物是水體酸化的主要承擔(dān)者，能促進(jìn)硫鐵礦物的氧化溶解過程，釋放H+，金屬陽離子和硫酸鹽，以鐵和/或硫氧化菌屬，鐵還原菌屬，碳循環(huán)代謝菌屬為主[6，7]。下層水主要為厚壁菌門(Firmicutes)，變形菌門(Proteobacteria)，放線菌門(Actinobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)，相對(duì)豐度依次分別為34.5%～58.0%，23.7%～49.3%，4.3%～4.9%，4.5%～6.4%。原本在表水占據(jù)優(yōu)勢的酸桿菌門和放線菌門在此處豐度顯著降低，該區(qū)域微生物數(shù)量有所降低，但多樣性有著極大的提高。下層水中的厚壁菌門豐度迅速增加，其主要成員為梭菌綱和桿菌綱生物，梭菌綱中的微生物大多能通過發(fā)酵呼吸進(jìn)行有機(jī)質(zhì)降解，但由于嗜酸性的梭菌研究相對(duì)較少，水庫中大多為未鑒定的梭菌類菌屬；桿菌菌綱主要為Acidibacillus和Alicyclobacillus，前者為異養(yǎng)的鐵硫氧化菌屬，后者重金屬耐受能力強(qiáng)，主要通過利用有機(jī)質(zhì)和其它菌屬的代謝產(chǎn)物進(jìn)行生長，能促進(jìn)鐵氧化/還原菌屬的生長[16，17]。此外，在下層水區(qū)域，能降解植物聚合物、降解纖維素和反硝化細(xì)菌的相對(duì)豐度顯著升高，這些微生物通過分解動(dòng)植物植物殘骸中的有機(jī)質(zhì)來為酸水庫提供碳源，同時(shí)參與水庫中的氮循化過程[18]。

圖3 門水平微生物相對(duì)豐度的垂向變化

4 結(jié)論

酸水庫中存在含量豐富，種群多樣，功能各異的嗜酸微生物，且表現(xiàn)出了明顯的空間結(jié)構(gòu)差異。表層水中細(xì)菌主要為鐵硫氧化還原功能的變形菌門，下層水則以對(duì)環(huán)境壓力耐受性強(qiáng)的厚壁菌門，及參與厭氧代謝過程的變形菌門和放線菌門為主，微生物空間分層的主要推動(dòng)力為水質(zhì)的pH值，DO和Fe2+濃度，下層水體pH值高，亞鐵含量高，溶解氧低，適宜多種微生物生長代謝，生物多樣性更為平均；而表層水體pH值較低，受溫度，大氣氧化影響，同時(shí)水體中的固氮固碳生物能利用大氣中的氮?dú)夂虲O2支持自身生長繁殖，該區(qū)域占據(jù)優(yōu)勢的大多為好氧的嗜酸異養(yǎng)菌屬。