孫惠萍 王 劍 張小芳

肝纖維化損傷是各種新陳代謝、病毒和毒性刺激引起的肝臟急性或慢性損傷，最終會(huì)導(dǎo)致肝硬化和各種并發(fā)癥，如門脈高壓、肝衰竭和肝細(xì)胞癌等[1]。目前肝纖維化損傷發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不明確。核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）是一種轉(zhuǎn)錄因子，控制參與多種生物過程，抑制NF-κB 信號(hào)通路可改善肝纖維化損傷[2-3]。在NF-κB 靶基因中，環(huán)氧合酶-2（Cyclooxygenase-2，COX-2）可促進(jìn)包括肝細(xì)胞癌和肝纖維化在內(nèi)的炎性疾病發(fā)生[4-5]。因此，抑制NF-κB 和COX-2 可能是肝損傷的潛在治療策略。五味子乙素是五味子的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤和保肝等多種藥理活性[6-7]。研究表明，五味子乙素通過多種調(diào)節(jié)機(jī)制減輕四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）誘導(dǎo)的肝損傷[1]。本研究探討五味子乙素對CCl4誘導(dǎo)大鼠肝損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1動(dòng)物 雄性SPF 級(jí)Wistar 大鼠18 只，體質(zhì)量（180±20）g，購自北京維通利華有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：201907005，許可證號(hào)：SYXK（浙）2018-0017。本實(shí)驗(yàn)通過浙江省溫州市溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審核，倫理審批號(hào)：WYDW2019-0232。所有大鼠在恒定溫度（18～25℃）、濕度（40%～70%）和12h明/12h 暗循環(huán)的環(huán)境中，自由飲水和進(jìn)食，飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。

1.2細(xì)胞 人肝癌HepG2 細(xì)胞系（批號(hào)HB-8065）購于美國模式培養(yǎng)物保存中心（ATCC）。

1.3主要試劑及儀器 Dulbecco 改良Eagle 培養(yǎng)基（DMEM）和胎牛血清（FBS，批號(hào)61870044）購自美國Gibco 公司。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，批號(hào)257621） 購自Sigma 公司，五味子乙素（批號(hào)1910028）購自成都瑞芬思生物科技有限公司，CCl4（批號(hào)40006861）和橄欖油（批號(hào)69018028）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。NF-κB（批號(hào)sc-8008）、COX-2（批號(hào)sc-376861）和β 肌動(dòng)蛋白（β-actin，批號(hào)sc-8432）購自美國Santa Cruz 公司，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗鼠二抗（批號(hào)#7076）購自美國Cell Signaling 公司。蘇木精-伊紅（HE，批號(hào)20190517）試劑盒購自北京博奧森生物科技有限公司）。細(xì)胞計(jì)數(shù)-8（CCK-8）試劑盒（批號(hào)20190414）、BCA 蛋白質(zhì)分析試劑盒（批號(hào)20190405）、增強(qiáng)型ECL 化學(xué)發(fā)光試劑（批號(hào)20190528）、堿性磷酸酶（ALP，批號(hào)20190115）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT，批號(hào)20190517）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST，批號(hào)20190606）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。倒置光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：AI09）購自日本奧林巴斯公司。酶標(biāo)儀（Multiskan MS 型） 購自美國Thermo Scientific 公司，紫外可見分光光度計(jì)（UV-2800）購自上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞活力測定 人肝癌HepG2 細(xì)胞系在含有10% FBS 的DMEM 中培養(yǎng)，置于37℃的5%CO2環(huán)境下。使用CCK-8 測定法來測量HepG2 細(xì)胞活力，將細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種在96 孔板中，并將細(xì)胞暴露于不同濃度（0、5、10、20、40 和80μM）五味子乙素24h。然后，將細(xì)胞與10μL CCK-8 在37℃下再孵育1h。使用酶標(biāo)儀在450nm 下測量。

2.2五味子乙素的抗氧化活性 采用DPPH 自由基清除活性測量五味子乙素的抗氧化活性。采用文獻(xiàn)[8]方法測定五味子乙素對DPPH 自由基的清除作用，稱取DPPH 10mg，95%乙醇配制成0.2mmol/L 溶液備用。五味子乙素配制不同濃度（50、100、150 和200μM） 樣品溶液備用。50μL 樣品溶液和50μL DPPH 溶液加到96 孔板中，在避光處靜置30min，UV-VIS 分光光度計(jì)于517nm 處測定其吸光值（Ai）。同一條件下，乙醇＋樣品溶液的吸光度為Aj，DPPH溶液+乙醇的吸光度為A0。DPPH 自由基清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2.3動(dòng)物分組及給藥 18 只大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組和五味子乙素組，每組6 只。模型組和五味子乙素組大鼠每周3 次腹腔注射溶于橄欖油（20%，2mL/kg）的CCl4處理，持續(xù)8 周以誘導(dǎo)肝損傷。8 周后五味子乙素組每天予50mg/kg 五味子乙素灌胃，對照組和模型組每天給予等體積0.9%氯化鈉溶液，持續(xù)4 周。末次處理后，頸脫位處死，收集大鼠肝臟和血清樣品用于生化和分子分析。

2.4組織學(xué)分析及肝功能指標(biāo)檢測 將肝組織在10%甲醛中固定，石蠟包埋切片（厚度3μm），并將其安裝在載玻片上。將切片用HE 染色，通過倒置光學(xué)顯微鏡成像。使用比色法檢測大鼠血清AST、ALT 和ALP 含量。

2.5蛋白質(zhì)印跡 根據(jù)制造商的說明，使用裂解緩沖液試劑盒從肝臟組織和HepG2 細(xì)胞中制備總蛋白，并使用BCA 蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。在SDS-PAGE 凝膠上分離總蛋白，電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂牛奶封閉1h。將膜與一抗在4℃孵育過夜，一抗包括NF-κB、COX-2 和βactin（1∶1000），TBST 溶液洗膜3 次，加入抗鼠二抗在室溫下孵育1h，使用ECL 試劑進(jìn)行顯像，條帶灰度值通過Image J 軟件進(jìn)行分析，β-actin 為內(nèi)參。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），采用單因素方差分析（ANOVA）和LSD 事后檢驗(yàn)確定組間差異，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1不同濃度五味子乙素的抗氧化活性 五味子乙素的抗氧化活性隨濃度增加而增強(qiáng)（P＜0.05），見表1。

表1 不同濃度五味子乙素的抗氧化活性（%，±s）

注：DPPH 為1，1-二苯基-2-三硝基苯肼；與50μM 組比較，aP＜0.05；與100μM 組比較，bP＜0.05；與150μM 組比較，cP＜0.05

3.2不同濃度五味子乙素抑制HepG2 細(xì)胞活力五味子乙素（40 和80μM）處理可降低HepG2 細(xì)胞活力，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。見表2。

表2 不同濃度五味子乙素對HepG2 細(xì)胞活力影響（%，±s）

表2 不同濃度五味子乙素對HepG2 細(xì)胞活力影響（%，±s）

注：與0μM 組比較，aP＜0.05；與40μM 組比較，bP＜0.05

3.3三組大鼠體質(zhì)量、肝臟重量和肝指數(shù)比較 與對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量降低，肝臟重量和肝指數(shù)顯著升高（P 均＜0.05）。與模型組比較，五味子乙素組大鼠體質(zhì)量升高，肝臟重量和肝指數(shù)降低（P均＜0.05）。見表3。

表3 三組大鼠體質(zhì)量、肝臟重量和肝指數(shù)比較（±s）

表3 三組大鼠體質(zhì)量、肝臟重量和肝指數(shù)比較（±s）

注：對照組為健康大鼠，予生理鹽水；模型組為肝損傷模型大鼠，予生理鹽水；五味子乙素組為肝損傷模型大鼠，予50mg/kg 五味子乙素灌胃；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

3.4三組大鼠肝組織肝功能比較 對照組大鼠肝細(xì)胞具有正常結(jié)構(gòu)，沒有明顯炎癥跡象，在模型組中觀察到炎性細(xì)胞浸潤，提示五味子乙素處理可明顯減輕CCl4引起的損害（見圖1）。與對照組比較，模型組大鼠血清ALP、ALT、AST 水平均升高（P 均＜0.05）。與模型組比較，五味子乙素組血清ALP、ALT、AST 水平降低（P 均＜0.05），見表4。

圖1 三組大鼠肝組織病理切片（蘇木精-伊紅染色×100）

表4 三組大鼠血清ALT、AST 和ALP 水平比較（U/L，±s）

表4 三組大鼠血清ALT、AST 和ALP 水平比較（U/L，±s）

注：對照組為健康大鼠，予生理鹽水；模型組為肝損傷模型大鼠，予生理鹽水；五味子乙素組為肝損傷模型大鼠，予50mg/kg 五味子乙素灌胃；ALP 為血清堿性磷酸酶；ALT 為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；AST 為天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

3.5各組體外和體內(nèi)NF-κB 和COX-2 蛋白表達(dá)水平比較 體外實(shí)驗(yàn)中，20、40μM 五味子乙素顯著降低細(xì)胞NF-κB 和COX-2 的蛋白表達(dá)（見圖2A、表5，P＜0.05）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，與對照組比較，模型組大鼠肝組織NF-κB 和COX-2 蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05）。與模型組比較，五味子乙素組NF-κB、COX-2 蛋白表達(dá)減弱（P＜0.05），見圖2B、表6。

圖2 各組體外和體內(nèi)NF-κB 和COX-2 的蛋白表達(dá)

表5 不同濃度五味子乙素對外HepG2 細(xì)胞NF-κB和COX-2 蛋白表達(dá)的影響（±s）

表5 不同濃度五味子乙素對外HepG2 細(xì)胞NF-κB和COX-2 蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：NF-κB 為胞核因子-κB；COX-2 為環(huán)氧化酶-2；與0μM 組比較，aP＜0.05

表6 三組大鼠肝組織NF-κB 和COX-2 蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表6 三組大鼠肝組織NF-κB 和COX-2 蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：對照組為健康大鼠，予生理鹽水；模型組為肝損傷模型大鼠，予生理鹽水；五味子乙素組為肝損傷模型大鼠，予50mg/kg 五味子乙素灌胃；NF-κB 為核因子-κB；COX-2 為環(huán)氧化酶-2；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

4 討論

炎癥是免疫系統(tǒng)針對各種有害刺激（如病原體、毒素、輻射和創(chuàng)傷、有毒化學(xué)物質(zhì)、礦物質(zhì)和抗原）的自然保護(hù)機(jī)制[9]。但是，持續(xù)性急性炎癥可能會(huì)導(dǎo)致心血管、肝臟、代謝類疾病和癌癥[10]。本研究表明，在CCl4誘導(dǎo)的肝損傷模型中，使用五味子乙素可降低肝癌HepG2 細(xì)胞活力、炎性介質(zhì)NF-κB 和COX-2的表達(dá)以及血清ALT、AST 和ALP 的水平，同樣，形態(tài)學(xué)檢查證實(shí)，五味子乙素處理可減少模型組炎癥細(xì)胞浸潤并改善肝損傷。這些結(jié)果表明，五味子乙素可以有效保護(hù)肝臟免受CCl4毒性的影響，其機(jī)制可能與其對炎癥通路NF-κB/COX-2 的抑制作用有關(guān)。

肝炎、肝硬化、脂肪肝、肝癌等肝病的發(fā)生發(fā)展與自由基密切相關(guān)[8]。本研究通過使用DPPH 自由基清除活性來證實(shí)五味子乙素的體外抗氧化功效。CCl4因在動(dòng)物和人類中表現(xiàn)出相似的病理變化，已被用作建立肝損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚3，11]。研究表明，使用CCl4會(huì)增加炎癥細(xì)胞因子，破壞免疫系統(tǒng)和淋巴器官，從而導(dǎo)致慢性炎癥性肝纖維化[3]。此外，本研究中CCl4增加了血清ALP、AST 和ALT 水平，反映肝損傷的程度[12-13]。而五味子乙素治療降低了這些酶的水平，表明五味子乙素可減輕CCl4誘導(dǎo)的肝損傷并改善肝功能。

NF-κB 在肝臟中產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子，并調(diào)控免疫應(yīng)答，繼而引起肝病，是炎癥的主要調(diào)節(jié)劑[3]。CCl4誘導(dǎo)肝損傷大鼠肝組織NF-κB 及IκBα 蛋白表達(dá)[12]，而五味子乙素處理可顯著抑制CCl4誘導(dǎo)的NF-κB 活化。抑制NF-κB 誘導(dǎo)的促炎因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、前列腺素E2（PGE2）及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、COX-2 和基質(zhì)金屬肽酶的活化，可以改善肝功能。因此，阻斷NF-κB/COX-2 途徑的激活可以阻止炎癥介質(zhì)在肝臟疾病中的募集。此外，本研究中五味子乙素降低了CCl4誘導(dǎo)的COX-2 活化，從而減少炎癥，壞死和纖維化。研究表明，五味子乙素能抑制NF-κB 活化及炎性細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β 和IL-6）來對抗炎癥損傷[14]，且對巨噬細(xì)胞中脂多糖誘導(dǎo)的炎癥具有保護(hù)作用，主要通過抑制一氧化氮和PGE2 的產(chǎn)生及NF-κB 通路表達(dá)[15]。

綜上所述，體外實(shí)驗(yàn)五味子乙素可降低體外肝癌細(xì)胞活力以及炎性介質(zhì)NF-κB 和COX-2 表達(dá)，在體內(nèi)，五味子乙素降低CCl4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠血清ALT、AST 和ALP 水平及炎性介質(zhì)NF-κB 和COX-2 表達(dá)，減少炎癥細(xì)胞浸潤，改善肝損傷，表明五味子乙素可能通過抑制NF-κB/COX-2 信號(hào)傳導(dǎo)途徑減輕炎癥，從而減輕肝損傷發(fā)展。