秦 天，田 媛，楊延周，張淑雅，王燕蓉，裴秀英，3

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)系，銀川 750004；3.寧夏回族自治區(qū)生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004）

隨著癌癥診療技術(shù)的發(fā)展，癌癥患者的存活率有了較大的提高。而惡性腫瘤也呈現(xiàn)出低齡化趨勢(shì)，約4%的女性惡性腫瘤確診時(shí)不到35歲，大約75%的年輕女性癌癥患者未來(lái)仍有生育愿望[1]。然而，包括化療和放療在內(nèi)的癌癥治療可能會(huì)損害癌癥幸存者的卵巢功能和未來(lái)的生育能力。研究表明，40%~80%的女性腫瘤患者會(huì)面臨不孕的風(fēng)險(xiǎn)[2]。因此，為了恢復(fù)年輕腫瘤患者未來(lái)的生育能力和內(nèi)分泌功能，這些癌癥患者可進(jìn)行卵巢組織冷凍保存（ovarian tissue cryopreservation，OTC）[3]。卵巢組織玻璃化冷凍保存是一種借助玻璃化凍存液通過(guò)快速冷卻，使細(xì)胞處于玻璃化狀態(tài)從而避免冰晶形成的技術(shù)，該技術(shù)易于執(zhí)行，可以簡(jiǎn)單、快速地保存復(fù)雜結(jié)構(gòu)[4-5]。但凍存過(guò)程中的卵泡丟失及損傷仍是該技術(shù)面臨的巨大挑戰(zhàn)[6]。卵巢組織凍存過(guò)程中的損傷以及移植后血管的再生是觸發(fā)卵泡凋亡的關(guān)鍵步驟，而凋亡是卵泡閉鎖的重要原因[7]。如果細(xì)胞凋亡程序可以被抵抗，細(xì)胞死亡可能被阻止[8]。鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P）是一種重要的具有生物活性的鞘氨脂，可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞增殖過(guò)程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞分化[9]，并平衡由神經(jīng)酰胺水平升高而導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡[10]。小鼠實(shí)驗(yàn)表明，注射S1P可以保護(hù)卵巢免受放射治療引起的損傷[11]。在本研究中，本文旨在評(píng)估S1P對(duì)小鼠玻璃化凍融卵巢移植后卵泡凋亡的影響，為抑制凍存卵巢移植后凋亡提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物21日齡及6～8周齡清潔級(jí)ICR雌性小鼠，購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［許可證號(hào)：SCXK（寧）2020-0001］，所有涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及程序均獲得寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)，并嚴(yán)格按照國(guó)家研究委員會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南的要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物移植后暫時(shí)飼養(yǎng)于動(dòng)物周轉(zhuǎn)單元。光照時(shí)間周期為12 h照明/12 h黑暗，動(dòng)物室室溫保持在22～24℃，濕度保持在40%～50%，自由取食飲水，定期更換鼠籠和墊料并消毒。

1.1.2 主要試劑S1P（sigma，型號(hào)：S9666），DMEM/F12培養(yǎng)基（HyClone公司），二甲基亞砜（DMSO）（MP Biomedicals公司，型號(hào)：196055），牛血清白蛋白（BSA）（Solarbio公司，型號(hào)：A8020），1%戊巴比妥鈉，組織冰凍包埋劑（美國(guó)SAKURA公司），HE試劑盒（LEAGENE公司，型號(hào)：DH0006），TUNEL檢 測(cè) 試 劑 盒（Vazyme公司，型號(hào)：A113-02），DAPI溶液（Solarbio公司，型號(hào)：C0065），Trizol（Ambion公司，型號(hào)：15596206），5x AII-In-One RTMasterMix（abm公司），EvaGreen 2x QPCR MasterMix-Low ROX（abm公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 液體的配制 基礎(chǔ)培養(yǎng)液：DMEM/F-12培養(yǎng)基+1%青霉素-鏈霉素+1% DMSO；培養(yǎng)液：含有10%牛血清白蛋白（BSA）的基液；預(yù)平衡液：含有1.5 mol·L-1乙二醇（EG）的基液；玻璃化液：實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的EG5.5-30玻璃化液。復(fù)蘇液一、復(fù)蘇液二、復(fù)蘇液三：分別含0.5 mol·L-1、0.25 mol·L-1、0.125 mol·L-1的蔗糖液。

1.2.2 卵巢的獲取21日齡ICR雌性小鼠按體質(zhì)量（0.1 mL/10 g）腹腔注射1%戊巴比妥鈉，待麻醉之后頸椎脫臼處死，用75%酒精棉球擦拭背部皮毛，剪開(kāi)小鼠背部皮膚及背膜，剝離雙側(cè)完整卵巢。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 新鮮對(duì)照組；凍存對(duì)照組；S1P干預(yù)組（凍存及解凍過(guò)程全程添加2μmol·L-1S1P）。每組24枚卵巢，移植的2 d及14 d各12枚卵巢，6枚進(jìn)行HE染色后的卵泡百分比計(jì)數(shù)，另外6枚進(jìn)行TUNEL法及q-PCR法檢測(cè)凋亡。

1.2.4 玻璃化凍存及解凍過(guò)程 將各凍存液于37℃CO2培養(yǎng)箱中提前預(yù)熱1 h，將卵巢隨機(jī)置于各組（n=24）的培養(yǎng)液中培養(yǎng)1 h，再放入預(yù)平衡液中7 min，接著在玻璃化液3 min之后迅速投入液氮罐中保存，凍存至少3 d以后，將卵巢從液氮中取出復(fù)蘇，置于37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)熱的復(fù)蘇液一、復(fù)蘇液二、復(fù)蘇液三各10 min，最后放入培養(yǎng)液中置于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。

1.2.5 卵巢腎被膜下移植 將6～8周齡雌鼠按0.1 mL/10 g小鼠體質(zhì)量腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，75%酒精擦拭背部，剔除背部絨毛，剪開(kāi)約1.5 cm皮膚，剪開(kāi)腎臟兩側(cè)的肌膜約0.5 cm，找到卵巢及腎臟，摘除卵巢并結(jié)扎輸卵管以去勢(shì)；在體視顯微鏡下輕柔緩慢的將復(fù)蘇后的玻璃化凍存卵巢塞入腎被膜下?？p合傷口，等待蘇醒。分別于2 d、14 d后取材。

1.2.6 組織切片及HE染色 移植卵巢取出后，4%多聚甲醛固定過(guò)夜（18～24 h），梯度酒精脫水，石蠟包埋后連續(xù)切片（5μm），每5張切片選取1張，進(jìn)行HE染色。

1.2.7 正常卵泡計(jì)數(shù)HE染色后每張切片選取5個(gè)高倍視野，根據(jù)卵泡形態(tài)計(jì)數(shù)原始卵泡、初級(jí)卵泡、正常卵泡、閉鎖卵泡的百分?jǐn)?shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.8 TUNEL檢測(cè)凋亡 按照Vazyme A113-02 TUNEL試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。卵巢取材后冰凍切片，4%多聚甲醛溶液固定30 min，PBS清洗三次，每次5 min；輕輕去掉多余液體，用1×PBS制備濃度為0.2%的TrionX-100溶液，室溫孵育15 min；PBS溶液潤(rùn)洗3次，每次5 min；滴加100μL 1×Equilibration Buffer，室溫平衡孵育30 min。然后在樣本上滴加50μL TdT孵育緩沖液，置于濕盒內(nèi)37℃孵育60 min，PBS洗3次，每次5 min；用1×PBS配制濃度為2μg·mL-1的DAPI黑暗中復(fù)染5 min，PBS洗3次，每次5 min；抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡在620 nm熒光下觀察BrightRed紅色熒光；在460 nm下觀察DAPI的藍(lán)光熒光。于高倍鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算凋亡指數(shù)；凋亡指數(shù)=（凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.2.9 凋亡基因mRNA的檢測(cè)Trizol提取卵巢總RNA并反轉(zhuǎn)成cDNA，實(shí)驗(yàn)步驟依據(jù)試劑盒要求進(jìn)行；然后以cDNA為模板，β-actin作為內(nèi)參，以Caspase3、Bax、Bcl-2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1。mRNA表達(dá)水平根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算。

表1 PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 S1P干預(yù)改善玻璃化凍存卵巢移植后的卵巢組織形態(tài)，維持卵泡數(shù)量

HE染色結(jié)果表明，移植2 d后，各組大卵泡形態(tài)均出現(xiàn)不同程度的變形，且不易著色，顆粒細(xì)胞稀疏成片狀，卵母細(xì)胞皺縮加重。凍存對(duì)照組卵泡閉鎖較多，S1P干預(yù)組閉鎖卵泡少于凍存對(duì)照組（P<0.01），高于新鮮對(duì)照組（P<0.01）；正常卵泡數(shù)目高于凍存對(duì)照組，低于新鮮對(duì)照組（P<0.01）。與凍存對(duì)照組相比，S1P干預(yù)組有較多的原始卵泡及初級(jí)卵泡（P均<0.05）；與新鮮對(duì)照組相比，原始卵泡及初級(jí)卵泡數(shù)目較少（P均<0.01）。見(jiàn)圖1、圖2A。

移植14 d后，凍存對(duì)照組卵巢結(jié)構(gòu)松散，大量卵泡丟失，隨著移植周期的延長(zhǎng)，閉鎖卵泡增加，卵巢結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重打擊。與凍存對(duì)照組相比，S1P干預(yù)組卵巢結(jié)構(gòu)較完好，部分卵泡發(fā)育為有腔卵泡，正常卵泡、原始卵泡及初級(jí)卵泡數(shù)目較多（P<0.05），閉鎖卵泡較少（P<0.01）。與新鮮對(duì)照組相比，S1P干預(yù)組正常卵泡、原始卵泡及初級(jí)卵泡數(shù)目較少（P<0.01），閉鎖卵泡較多（P<0.01）。見(jiàn)圖1、圖2B。

圖1 小鼠凍存卵巢移植后卵巢組織切片HE染色

圖2 小鼠凍存卵巢移植后各級(jí)卵泡百分比（n=6）

2.2 S1P干預(yù)降低玻璃化凍存卵巢移植后的卵巢凋亡

TUNEL紅色熒光表示凋亡細(xì)胞，移植2 d后，凋亡主要集中于大卵泡的顆粒細(xì)胞中，與凍存對(duì)照組相比，S1P干預(yù)組熒光強(qiáng)度明顯減弱，與新鮮對(duì)照組相比，熒光較強(qiáng)。見(jiàn)圖3A。各移植組卵巢組織細(xì)胞凋亡率表明：S1P干預(yù)組卵巢凋亡率低于凍存對(duì)照組（P<0.01），而高于新鮮對(duì)照組（P<0.01）。可見(jiàn)凍融過(guò)程中添加S1P后有效抑制了凍融卵巢移植后顆粒細(xì)胞的凋亡。見(jiàn)圖3B。

圖3 小鼠凍存卵巢移植2 d后卵巢組織TUNEL染色

2.3 Real-time PCR檢測(cè)凋亡基因Caspase3、Bax、Bcl-2的表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果表明，移植2 d后，S1P干預(yù)組凋亡基因Caspase3及促凋亡基因Bax mRNA表達(dá)均低于凍存對(duì)照組（P<0.01），但高于新鮮對(duì)照組（P<0.01）；抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表達(dá)高于凍存對(duì)照組（P<0.05），而低于新鮮對(duì)照組（P<0.05）。移植14 d后，S1P干預(yù)組Caspase3、Bax mRNA表達(dá)低于凍存對(duì)照組（P<0.05），但高于新鮮對(duì)照組（P<0.05）；Bcl-2 mRNA表達(dá)高于凍存對(duì)照組（P<0.01），低于新鮮對(duì)照組（P<0.05）。從mRNA水平上證明S1P干預(yù)組卵巢凍融移植后凋亡低于凍存對(duì)照組。見(jiàn)圖4。

圖4 小鼠凍存卵巢移植后卵巢Caspase3、Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)

3 討論

截至目前，全球通過(guò)OTC和卵巢組織移植技術(shù)（ovarian tissue transplantation，OTT）分娩的新生兒已經(jīng)超過(guò)145例[12]。在接受治療的318名患者中，95%的患者能夠恢復(fù)月經(jīng)和正常激素水平[13]。這些研究結(jié)果給眾多抗癌的年輕患者及青春期前的女孩帶來(lái)了生育的希望，但是在此技術(shù)發(fā)展的十余年，仍然處于實(shí)驗(yàn)階段，面臨著巨大挑戰(zhàn)。凍存及移植過(guò)程引起的卵泡凋亡導(dǎo)致卵泡發(fā)育停滯和閉鎖以及移植后缺血再灌注及氧化應(yīng)激引起的原始卵泡丟失是OTC和OTT面臨的兩個(gè)重要挑戰(zhàn)。S1P在哺乳動(dòng)物的生理和病理過(guò)程中起著重要的作用，它調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、細(xì)胞存活、遷移和血管生成[14]。有研究指出，細(xì)胞的生存與死亡是由神經(jīng)酰胺（Cer）、鞘氨醇（Sp）及S1P相對(duì)量的水平?jīng)Q定。Cer是一種細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)分子，細(xì)胞內(nèi)Cer水平升高能直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15]。應(yīng)激、射線照射、細(xì)胞毒性物質(zhì)刺激等因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡都與細(xì)胞內(nèi)Cer水平升高有關(guān)，而S1P是一個(gè)重要的存活因子，能直接對(duì)抗Cer和Sp誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[15-16]。S1P可顯著降低多種刺激因素如化療藥物、輻射、熱休克等誘發(fā)的卵母細(xì)胞凋亡，有效保護(hù)卵巢組織[17]。因此，本研究為了評(píng)估S1P在小鼠卵巢玻璃化凍融移植過(guò)程中是否具有抗卵泡凋亡作用，給予了凍存前、凍存及凍存后全過(guò)程的S1P干預(yù)。

HE染色形態(tài)學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：移植后2 d，凍存對(duì)照組及S1P干預(yù)組卵巢組織均出現(xiàn)不同程度上的大卵泡變形的情況，其顆粒細(xì)胞間質(zhì)疏松，卵母細(xì)胞出現(xiàn)固縮，絕大多數(shù)大卵泡出現(xiàn)凋亡趨勢(shì)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，卵巢組織在移植后的早期至少有75%的卵泡丟失[18]。本次實(shí)驗(yàn)中，凍存對(duì)照組卵泡發(fā)生閉鎖，添加S1P后，與凍存對(duì)照組相比，閉鎖卵泡較少，原始及初級(jí)卵泡較多。移植14 d后，隨著移植周期的延長(zhǎng)，凍存對(duì)照組卵巢結(jié)構(gòu)松散，大量卵泡丟失，閉鎖卵泡增加，卵巢結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重打擊。較凍存對(duì)照組，S1P干預(yù)組卵巢結(jié)構(gòu)較完好，部分卵泡發(fā)育為有腔卵泡，原始卵泡及初級(jí)卵泡數(shù)目相對(duì)較多。在形態(tài)上，卵巢得到較好的保護(hù)。原始卵泡是整個(gè)生殖壽命中發(fā)育卵泡和卵母細(xì)胞的來(lái)源。研究表明，絕大多數(shù)原始卵泡會(huì)在卵巢組織凍存和移植過(guò)程中丟失[19]，而最終決定移植卵巢壽命的是移植卵巢組織中存活下來(lái)的原始卵泡的數(shù)量[20]。形態(tài)學(xué)研究結(jié)果提示，S1P的干預(yù)較單純的玻璃化凍存組能夠保留盡可能多的原始卵泡。

為了探究這種保留較多的原始卵泡的機(jī)制是否與S1P的抗凋亡相關(guān)，本研究觀察了TUNEL熒光結(jié)果，發(fā)現(xiàn)移植2 d后，S1P干預(yù)組顆粒細(xì)胞凋亡率低于單純玻璃化凍存組，說(shuō)明添加了S1P后，有效抑制了顆粒細(xì)胞的凋亡。移植14 d后TUNEL檢測(cè)無(wú)法檢測(cè)到凋亡細(xì)胞，這可能是由于移植后2周死亡卵泡已經(jīng)消失，此現(xiàn)象在以往研究中也有相似報(bào)道[21]。移植2 d和14 d后，凍存組凋亡基因Caspase3以及促凋亡基因Bax表達(dá)均高于S1P組，而抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)均低于S1P組，從mRNA水平驗(yàn)證S1P的干預(yù)對(duì)卵巢凍融移植后的抗凋亡作用。

綜上所述，小鼠卵巢玻璃化凍存過(guò)程中給予2μmol·L-1S1P的干預(yù)可提高卵巢移植后的卵泡存活，可能的機(jī)制與其抗凋亡作用有關(guān)。