楊 紅 ， 賈 偉 ， 康 佳 ， 周云花 ， 楊寧愛 ， 康宇婷 ， 蘇雅靜 ，喬 霞 ， 汪澎濤 ， 趙志軍

（1.寧夏醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學臨床病原微生物重點實驗室，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院醫(yī)學實驗中心，銀川 750004）

急性髓系白血病是成人最常見的急性白血病[1]，屬于造血系統(tǒng)惡性腫瘤。黃芪甲苷是從中藥黃芪中提取出來的一種高純度藥物，具有增強機體免疫力、改善心肺功能、提高機體抗病能力等作用[2-3]。近年來，有研究[4-9]報道，黃芪甲苷對多種腫瘤細胞具有抑制增殖、誘導凋亡、抑制腫瘤侵襲和遷移等作用。黃芪甲苷對急性髓系白血病HL60 細胞的作用尚不清楚，因此本研究以急性髓系白血病HL60 細胞為模型，觀察黃芪甲苷對其增殖和凋亡的影響，以期為臨床用黃芪甲苷治療急性髓系白血病提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人急性髓系白血病HL60 細胞，購買于上海名勁生物科技有限公司，起始來源ATCC，已進行STR 鑒定。黃芪甲苷購買于成都普瑞法生物科技有限公司（批號：84687-43-4，HPLC：98%，規(guī)格：250 mg），避光保存。配制方法：實驗前將黃芪甲苷溶于 DMSO 中，使其濃度為 25 mmol·L-1，臨用時用含血清培養(yǎng)液稀釋至實驗所需濃度，使DMSO 濃度＜0.1%。IMDM 基礎培養(yǎng)液購于上海BasalMedia 公司；胎牛血清購于以色列BI 公司；青鏈霉素混合液購于北京索萊寶公司；Trizol購于美國Ambion 公司；反轉錄試劑盒（批號：RR036A）和 Real-Time PCR 試劑盒（批號：RR820）購于日本TaKaRa 公司；BCA 蛋白含量檢測試劑盒、全蛋白檢測試劑盒和SDS-PAGE 快速凝膠配制試劑盒購于凱基生物公司；CCK-8 細胞增殖檢測試劑盒購于北京全式金生物公司；Annexin Ⅴ-APC/7-AAD 凋亡試劑盒（批號：AP105-60）購于聯(lián)科生物公司，Hochest 33258 染色液（批號：C1018）購于上海碧云天生物技術有限公司。兔抗Bax（批號：A7626）、兔抗 Bcl-2（批號：A19693）和山羊抗兔IgG 二抗（批號：AS014）均購于武漢愛博泰克生物科技有限公司；β-actin 一抗（批號：bs-0061R）購自北京博奧森生物技術有限公司；Real Time PCR 所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將凍存的HL60 細胞于37 ℃水浴迅速解凍，接種于含20% FBS 和1%青鏈霉素混合液的IMDM 培養(yǎng)液中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d 更換1 次培養(yǎng)液，待細胞密度增高時傳代，取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 CCK-8 實驗檢測細胞增殖情況 取對數(shù)生長期 HL60 細胞，按 6×104個/mL 細胞密度接種于含不同濃度黃芪甲苷（5、10、20、40、80、160、320 μmol·L-1）的 96 孔板中，每孔 100 μL，同時設定空白對照組（只含100 μL 完全培養(yǎng)液）和溶劑對照組（溶劑濃度與最大濃度藥物組所含溶劑濃度一致），接種后 48 h 加入 10 μL CCK-8 試劑，37 ℃孵育2 h，酶標儀檢測波長450 nm 處吸光度（A）值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=［（A對照孔-A實驗孔）（/A對照孔-A空白孔）］×100%。每組設3 個復孔，實驗重復3 次。

1.2.3 臺盼藍染色計數(shù)法繪制細胞生長曲線 取對數(shù)生長期 HL60 細胞，按 2×105個/mL 密度接種于含不同濃度黃芪甲苷（10、20、40、80 μmol·L-1）的24 孔板中，每孔1 mL，同時設定溶劑對照組（同1.2.2 項），每組設21 個復孔，每天從各組取3 孔細胞進行臺盼藍染色計數(shù)，連續(xù)7 d，繪制HL60 細胞生長曲線。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡情況 取對數(shù)生長期 HL60 細胞，按 1×105個/mL 細胞密度接種于含不同濃度黃芪甲苷（10、20、40、80 μmol·L-1）的6 孔板中，每孔2.5 mL，同時設定溶劑對照組（同 1.2.2 項），每組設 3 個復孔，培養(yǎng) 72 h 后，離心收集細胞，預冷 PBS 清洗 2 遍，加入 500 μL 結合緩沖液重懸細胞后加入5 μL Annexin Ⅴ-APC和10 μL 7-AAD 輕柔渦旋混勻，室溫避光孵育15 min 后上機檢測。

1.2.5 Hochest 33258 染色實驗檢測細胞凋亡形態(tài)變化 取對數(shù)生長期 HL60 細胞，按 2×105個/mL 密度接種于含不同濃度黃芪甲苷（10、20、40、80 μmol·L-1）的 24 孔板中，每孔 1 mL，同時設定溶劑對照組（同1.2.2 項），培養(yǎng)72 h后離心收集細胞，用固定液固定后滴加至載玻片，加入0.5 mL Hochest 332558 染色液避光染色5 min，置于熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)變化。

1.2.6 Real Time PCR 檢測細胞 Bax 和 Bcl-2 mRNA 表達情況 取對數(shù)生長期HL60 細胞，按1×105個/mL 細胞密度接種于含不同濃度黃芪甲苷（10、20、40、80 μmol·L-1）的 6 孔板中，每孔2.5 mL，同時設定溶劑對照組（同1.2.2 項），培養(yǎng)72 h 后離心收集細胞，加入Trizol 試劑抽提RNA，按照TaKaRa 反轉錄試劑盒操作合成cDNA，按照TB Green?Premix Ex TaqTMII 操作說明進行Real Time PCR 實驗。反應體系：上游引物、下游引物各 1 μL，cDNA 1 μL，Master Mix 10 μL，RNase Free ddH2O 7 μL，總體積 20 μL。反應條件：95 ℃預變性 30 s；95 ℃變性 5 s，60 ℃退火 30 s，70 ℃延伸30 s，共40 個循環(huán)；65 ℃徹底延伸1 min。Bax 上游引物：5′-ATCAGAACCATCATGGGCTGGACA-3′，下游引物：5′-AGCCCATCTTCTTCCAGATGGTGA-3′；Bcl-2 上游引物：5′-TTGTGGCCTTCTTTGAGTTCGGTG-3′，下游引物：5′-ACTCACATCACCAAGTGCACCTAC-3′；GAPDH 上游引物：5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′。實驗以 GAPDH 為內參，以 2-ΔΔct計算 Bax 和 Bcl-2 mRNA 表達量。

1.2.7 Western blot 檢測細胞 Bax 和 Bcl-2 蛋白表達情況 細胞培養(yǎng)、分組同1.2.4 項，培養(yǎng)72 h后，離心收集細胞，用全蛋白提取試劑盒提取各組細胞蛋白后按照Western blot 實驗說明進行電泳、轉膜、封閉、一抗（兔抗Bax 和兔抗Bcl-2 以1∶1000 比例稀釋，β-actin 一抗以 1∶20000 比例稀釋）孵育、二抗（山羊抗兔 IgG 二抗以 1∶10000 比例稀釋）孵育及曝光等步驟，結果用Image J 2.0進行灰度掃描及分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 黃芪甲苷對HL60 細胞增殖的影響

CCK-8 結果顯示，經(jīng)黃芪甲苷干預48 h 后，與對照組相比，當黃芪甲苷濃度≤40 μmol·L-1時，黃芪甲苷對HL60 細胞存活率無影響；當黃芪甲苷濃度>40 μmol·L-1時，HL60 細胞存活率出現(xiàn)降低趨勢，160 μmol·L-1和 320 μmol·L-1時最為明顯（P 均＜0.01），見圖 1。因此，后續(xù)實驗選擇的黃芪甲苷濃度為 10、20、40、80 μmol·L-1。

圖1 黃芪甲苷對HL60 細胞存活率的影響

2.2 黃芪甲苷對HL60 細胞生長曲線的影響

連續(xù)7 d 臺盼藍染色計數(shù)法結果顯示，與對照組相比，隨著黃芪甲苷濃度升高，HL60 細胞增殖能力越弱。培養(yǎng)細胞至第7 天時，溶劑對照組細胞增殖倍數(shù)達11.207；含黃芪甲苷終濃度為80 μmol·L-1的實驗組細胞增殖倍數(shù)僅為 0.310，見圖2。

圖2 黃芪甲苷對HL60 細胞生長曲線的影響

2.3 黃芪甲苷對HL60 細胞凋亡的影響

Hochest 33258 染色結果顯示，與對照組相比，HL60 細胞經(jīng)不同濃度黃芪甲苷干預后，出現(xiàn)不同程度細胞核固縮、核碎裂，80 μmol·L-1黃芪甲苷干預細胞組最明顯，結果見圖3A。流式細胞術結果顯示，與對照組相比，HL60 細胞凋亡比率隨著黃芪甲苷濃度的升高而增高（P＜0.01），見圖3B、圖 C。

圖3 黃芪甲苷對HL60 細胞凋亡的影響

2.4 黃芪甲苷對HL60 細胞Bax 及Bcl-2 mRNA表達水平的影響

Real Time PCR 結果顯示，與對照組相比，HL60 細胞經(jīng)含 10、20、40、80 μmol·L-1黃芪甲苷濃度培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h 后，Bax mRNA 表達水平隨黃芪甲苷濃度升高而增高，Bcl-2 mRNA 表達水平隨黃芪甲苷濃度升高而降低（P 均＜0.05），見圖4。

2.5 黃芪甲苷對HL60 細胞Bax 及 Bcl-2 蛋白表達水平的影響

Western blot 結果顯示，與對照組相比，隨著黃芪甲苷藥物濃度的升高，Bax 的蛋白表達量上調，Bcl-2 的蛋白表達量下調（P 均＜0.01），見圖5。

3 討論

近年來，由于中醫(yī)藥具有標本兼治、毒副作用小等優(yōu)點逐漸被各研究者重視，中藥黃芪具有補氣、止汗、利尿消腫、排膿等功效，被廣泛應用于急性腎炎、高血壓、糖尿病、缺血性心臟病等疾病的治療[10]。黃芪甲苷是中藥黃芪的有效成分之一，被認為是黃芪質量的判斷標準[11]。黃芪甲苷可通過 PI3K/Akt 信號通路[12-13]、JNK/Nrf2 信號通路[14]、Wnt/β-catenin 信號通路[15]、Nrf2/HO-1 信號通路[16]等多個作用位點抑制腫瘤細胞增殖、誘導其凋亡或降低其侵襲力和遷移力等。

本研究結果顯示，經(jīng) 10、20、40、80 μmol·L-1濃度黃芪甲苷干預72 h 后，HL60 細胞存活率下降，細胞凋亡比率逐漸升高，出現(xiàn)細胞核固縮等典型凋亡形態(tài)變化，細胞凋亡基因Bax 和Bcl-2轉錄水平和蛋白水平表達均發(fā)生了相應變化，表明黃芪甲苷可抑制急性髓系白血病HL60 細胞增殖，誘導其凋亡。有研究[17]通過MTT 實驗方法發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷對HL60 細胞增殖無明顯抑制作，分析原因可能與其實驗藥物來源、濃度、干預時間、實驗方法等均與本文不同有關，其中藥物干預時間不同的影響可能最大，本文中Real Time PCR 和Western blot 實驗藥物干預時間均為72 h，藥物作用時間更長。

圖 4 Real time PCR 檢測Bax 及Bcl-2 mRNA 表達情況變化

圖5 Western blot 檢測凋亡比較相關因子蛋白表達變化情況

外界環(huán)境和遺傳因素等原因均可引起DNA損害，從而導致腫瘤的發(fā)生，其本質是基因病，涉及原癌基因、抑癌基因、DNA 修復基因、細胞凋亡等相關基因的改變，其中，細胞凋亡是通過細胞的主動有序死亡使機體中細胞數(shù)量保持基本恒定的正常生理過程，Bax 和Bcl-2 是目前細胞凋亡研究中功能對立的最重要一對細胞凋亡因子，二者的比率決定細胞凋亡過程是否啟動[18]。有研究[19]表明，黃芪甲苷作用后可明顯促進Bax的表達，抑制Bcl-2 的表達，提高肝癌細胞HepG 2 凋亡率，與本實驗結果一致。但黃芪甲苷誘導HL60 細胞凋亡的具體作用及機制仍需通過體內實驗等進行深入探究。

綜上，在體外黃芪甲苷可抑制急性髓系白血病HL60 細胞增殖，誘導其凋亡，這可能與調節(jié)Bax/Bcl-2 凋亡信號通路有關。