梁涵子 ， 李雨涵 ， 李家瑞 ， 李建寧 ， 宋 輝 ， 楊 怡

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)內(nèi)分泌學(xué)研究所，銀川 750004； 3.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)系，銀川 750004）

肝纖維化是指因各種慢性肝損傷引起的肝臟內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度沉積，導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)和肝功能異常輕度改變的病理過程。目前研究[1]認(rèn)為，肝纖維化的發(fā)病機(jī)制主要是在各種損肝因素作用下，組織發(fā)生修復(fù)時(shí)ECM 合成與降解失衡。近年來，隨著生活方式的改變，肥胖患者比例大幅度上升，進(jìn)而導(dǎo)致代謝性肝病發(fā)病率迅速增加[2-3]，脂肪性肝病進(jìn)一步發(fā)展而來的脂肪性肝炎、肝纖維化等已成為肝癌進(jìn)一步發(fā)展、惡化的重要環(huán)節(jié)[4]。而肝纖維化作為一種可逆性疾病，給予病因消除并經(jīng)適當(dāng)?shù)闹委煟淅w維化是可以逐漸被吸收的[5]。由于目前對(duì)于脂肪性肝纖維化的發(fā)病機(jī)制缺乏明確的認(rèn)識(shí)，從而限制了治療方式的選擇。因此，探究脂肪性肝纖維化的發(fā)病機(jī)制能夠?yàn)榕R床脂肪性肝纖維化的治療提供新的理論基礎(chǔ)。

目前認(rèn)為，肝星狀細(xì)胞仍是各種臨床和實(shí)驗(yàn)性肝纖維化模型中肌成纖維細(xì)胞（MFs）的主要來源[6]。在肝纖維化疾病進(jìn)展中，HSCs 發(fā)揮著重要作用，HSCs 的活化、增殖及分化是纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[7]。因此研究多集中于以肝星狀為靶細(xì)胞，利用轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）建立肝纖維化模型，從而研究肝纖維化的作用機(jī)制[8-9]。但是這種方式并不能完全模擬脂肪性纖維化，為了探究脂肪性肝纖維化的發(fā)病機(jī)制，本研究選用棕櫚酸（palmitic acid，PA）及 TGF-β1 作為誘導(dǎo)手段，分別給予人肝星狀細(xì)胞（LX-2）及人肝癌細(xì)胞（HepG2）不同濃度的 PA 及 TGF-β1 誘導(dǎo)，構(gòu)建脂肪性肝纖維化細(xì)胞模型，以期為后續(xù)探究脂肪性肝纖維化疾病的分子機(jī)制及治療手段提供模型基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LX-2 細(xì)胞購自上海中喬新舟細(xì)胞庫；HepG2細(xì)胞購自北京腫瘤細(xì)胞庫；胎牛血清購自美國Gibco 公司（10099-141）；DMEM 高糖培養(yǎng)基購自Hyclone 公司（SH30022）；PA（P5585）和油紅 O染液（O1391）購自美國 Sigma 公司；TGF-β1 購自PEPROTECH 公司；cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒及qRTPCR 試劑盒購自 TaKaRa 公司；α-SMA（#19245）與 CollagenⅠ（#39952）抗體購自 Cell Signaling Technology 公司，GAPDH 抗體（10494-1-AP）購自PEPROTECH 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) LX-2 細(xì)胞、HepG2 細(xì)胞以適當(dāng)密度接種于培養(yǎng)瓶中，使用含有10%胎牛血清，100 U·mL-1青霉素及 100 U·mL-1鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 主要試劑配方 ①重組人 TGF-β1：將TGF-β1 粉末用10 mmol·L-（1pH 3.0）的檸檬酸鈉試劑溶解至 0.5 mg·mL-1，再使用 0.1%BSA 溶液稀釋至終濃度為10 ng·mL-1的儲(chǔ)備液，分裝后于-20 ℃保存。使用時(shí)，通過DMEM 完全培養(yǎng)液稀釋成為 2、5、10 ng·mL-1的終濃度。②PA 工作液：0.25 g PA，加入1 mL 無水乙醇在熱水浴中助溶，用 500 mmol·L-1NaOH 調(diào)節(jié) pH 至 7.4，用0.22 μmo·lL-1微孔濾膜除菌后分裝，-20 ℃保存。使用時(shí)，通過DMEM 完全培養(yǎng)液稀釋成為100、200 及 400 μmol·L-1的終濃度。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 選用 100、200、400 μmol·L-1PA分別誘導(dǎo)LX-2 細(xì)胞及HepG2 細(xì)胞，選用 2、5、10 ng·mL-1TGF-β1 分別誘導(dǎo) LX-2 細(xì)胞及 HepG2細(xì)胞，兩種誘導(dǎo)方式均誘導(dǎo)24 h。

1.2.4 MTT 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞存活率 將LX-2 細(xì)胞、HepG2 細(xì)胞分別接種于96 孔板，密度為1×104/孔，分別給予不同濃度PA 及TGF-β1 誘導(dǎo)24 h，隨后利用MTT 檢測試劑盒檢測細(xì)胞存活率。計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組A 值-空白調(diào)零A 值）（/對(duì)照組A 值-空白調(diào)零A 值）×100%。

1.2.5 油紅O 染色法檢測脂滴含量 分別接種兩種細(xì)胞于6 孔板內(nèi)，密度為2×105/孔，分別給予不同濃度PA 及TGF-β1 誘導(dǎo)24 h 后，使用預(yù)冷的PBS清洗3 次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，每孔滴加油紅 O 染液 1 mL，室溫反應(yīng) 10～15 min，65%的異丙醇快速脫色，使用蘇木素染核30 s 后用蒸餾水沖洗2~3 次，于倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.6 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)檢測 α-SMA、CollagenⅠ的mRNA 表達(dá)水平 PA 及 TGF-β1 誘導(dǎo)兩種細(xì)胞后，采用Trizol 法提取細(xì)胞內(nèi)RNA 并將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)檢測各組α-SMA 和CollagenⅠ的mRNA 表達(dá)水平。引物序列分別為β-Acting：Forward-CATGTACGTTGCTATCCAGG，Reverse-CTCCTTAATGTCACGCACGAT；α-SMA：Forward-CAGGGCTGTTTTCCCATCCAT，Reverse-G CCATGTTCTATCGGGTACTT；CollagenⅠ：Forward-CATGTACGTTGCTATCCAGGC，Reverse-CTCCTT AATGTCACGCACGAT。

1.2.7 Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測 α-SMA、Collagen Ⅰ的蛋白表達(dá)水平 分別收集經(jīng)PA 及TGF-β1 誘導(dǎo)后的 LX-2 細(xì)胞和 HepG2 細(xì)胞，蛋白制樣后，利用10% SDS-PAGE 垂直電泳進(jìn)行蛋白分離，隨后檢測α-SMA 及CollagenⅠ的蛋白表達(dá)水平，通過Image J 軟件分析條帶的灰度值，以目標(biāo)蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH 灰度值的比值評(píng)價(jià)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間兩兩比較采用Dunnett-t 檢驗(yàn)，P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1 誘導(dǎo)較PA 誘導(dǎo)細(xì)胞存活率更高

MTT 結(jié)果顯示，100、200、400 μmol·L-1PA分別誘導(dǎo) HepG2 與 LX-2 細(xì)胞 24 h 后，細(xì)胞存活率出現(xiàn)不同程度降低（P 均＜0.01）；TGF-β1分別誘導(dǎo)兩組細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞存活率在5、10 ng·mL-1TGF-β1 誘導(dǎo)下出現(xiàn)不同程度降低（P均＜0.05），見圖 1、圖 2。

2.2 PA 誘導(dǎo)組細(xì)胞內(nèi)脂滴增多

油紅O 染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同濃度 PA 誘導(dǎo) 24 h 后，HepG2、LX-2 細(xì)胞均隨PA 濃度的增大，脂滴形成增多，具有明顯的濃度依賴性。不同濃度TGF-β1 誘導(dǎo)24 h 后，HepG2組細(xì)胞內(nèi)未見明顯脂滴；2、5 ng·mL-1TGF-β1 誘導(dǎo)后 LX-2 細(xì)胞內(nèi)可見少量脂滴，10 ng·mL-1TGF-β1 誘導(dǎo)后可見LX-2 細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯增多，見圖 3、圖 4。

圖1 MTT 分析PA 對(duì)HepG2 細(xì)胞與LX-2 細(xì)胞存活率的影響

圖2 MTT 分析TGF-β1 對(duì)HepG2 細(xì)胞與LX-2 細(xì)胞存活率的影響

圖3 油紅O 染色法顯示不同濃度PA 對(duì)HepG2、LX-2 細(xì)胞內(nèi)脂滴形成的誘導(dǎo)效應(yīng)（×400）

圖4 油紅O 染色法顯示不同濃度TGF-β1 對(duì)HepG2、LX-2 細(xì)胞內(nèi)脂滴形成的誘導(dǎo)效應(yīng)（×400）

2.3 PA 與 TGF-β1 誘導(dǎo)兩種細(xì)胞內(nèi) α-SMA、CollagenⅠ的mRNA 表達(dá)增加

qRT-PCR 結(jié)果顯示，200、400 μmol·L-1PA組誘導(dǎo) HepG2 細(xì)胞內(nèi)α-SMA、CollagenⅠmRNA相對(duì)表達(dá)水平均上調(diào)（P 均＜0.05）；200 μmol·L-1PA 誘導(dǎo)LX-2 細(xì)胞內(nèi)CollagenⅠ mRNA 相對(duì)表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.01），400 μmol·L-1PA 誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞內(nèi)α-SMA、CollagenⅠmRNA 相對(duì)表達(dá)水平均上調(diào)（P 均＜0.01）；10 ng·mL-1TGF-β1 誘導(dǎo)HepG2 組細(xì)胞內(nèi)α-SMA、CollagenⅠmRNA 相對(duì)表達(dá)水平均上調(diào)（P 均＜0.05）；5、10 ng·mL-1TGF-β1 誘導(dǎo)LX-2 細(xì)胞內(nèi) α-SMA、CollagenⅠmRNA 相對(duì)表達(dá)水平均上調(diào)（P 均＜0.01），見圖 5、圖 6。

圖5 qRT-PCR 檢測不同濃度PA 誘導(dǎo)24 h 后α-SMA、CollagenⅠ mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平

圖6 qRT-PCR 檢測不同濃度TGF-β1 濃度誘導(dǎo)后兩組細(xì)胞內(nèi)α-SMA、CollagenⅠ mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平

2.4 PA 與 TGF-β1 誘導(dǎo)兩種細(xì)胞內(nèi) α-SMA、CollagenⅠ蛋白表達(dá)增加

Western blot 結(jié)果顯示，200、400 μmol·L-1PA組誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞內(nèi)α-SMA 及CollagenⅠ的蛋白相對(duì)表達(dá)水平均升高（P 均＜0.05）；400 μmol·L-1PA 誘導(dǎo)LX-2 細(xì)胞內(nèi)CollagenⅠ蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.01）；2、5、10 ng·mL-1TGF-β1 組誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞內(nèi)α-SMA 蛋白相對(duì)表達(dá)水平均升高（P 均＜0.05），10 ng·mL-1TGF-β1 組誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞內(nèi)CollagenⅠ蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.05）；2 ng·mL-1TGF-β1 組誘導(dǎo) LX-2 細(xì)胞內(nèi)CollagenⅠ蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.01），5、10 ng·mL-1TGF-β1 組誘導(dǎo) LX-2 內(nèi) α-SMA及CollagenⅠ的蛋白相對(duì)表達(dá)水平均升高（P 均＜0.01），見圖 7～圖 10。

圖7 Western blot 檢測不同濃度PA 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞24 h 后α-SMA 及Collagen Ⅰ的蛋白相對(duì)表達(dá)水平

圖8 Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度PA 誘導(dǎo)LX-2 細(xì)胞24 h 后α-SMA 及Collagen Ⅰ的蛋白相對(duì)表達(dá)水平

圖9 Western blot 檢測不同濃度TGF-β1 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞24 h 后α-SMA 及CollagenⅠ的蛋白相對(duì)表達(dá)水平

圖10 Western blot 檢測不同濃度TGF-β1 誘導(dǎo)LX-2 細(xì)胞24 h 后α-SMA 及Collagen Ⅰ的蛋白相對(duì)表達(dá)水平

3 討論

目前，非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的患病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球24%左右的人口患有NAFLD[10]，我國成年人中NAFLD 的患病率高達(dá)15%[11]，而脂肪肝纖維化是NASH 進(jìn)展為終末期肝病的重要階段，晚期肝纖維化最終可導(dǎo)致肝硬化和肝功能衰竭，然而目前除了肝移植外沒有其他更有效的治療策略[12]。因此，預(yù)防肝纖維化是阻止該病進(jìn)展和預(yù)后的關(guān)鍵。

肝纖維化作為一種復(fù)雜的肝臟疾病，其具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，一般認(rèn)為遺傳因素、環(huán)境因素、脂質(zhì)代謝異常、氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化損傷、免疫反應(yīng)損害等可能參與了其發(fā)病。脂質(zhì)代謝紊亂作為重要的致病因素，對(duì)于NAFLD、NASH以及肝細(xì)胞癌的進(jìn)展發(fā)揮著重要的作用[13]。肝纖維化作為肝臟疾病惡化的關(guān)鍵階段，其發(fā)生、發(fā)展中脂質(zhì)代謝的變化目前尚不清楚，進(jìn)而限制了由NAFLD、NASH 進(jìn)展而來的肝纖維化治療方式的選擇。為了更好地研究脂肪性肝纖維發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，建立良好的研究模型非常關(guān)鍵。目前對(duì)肝纖維化模型的研究多集中于利用能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的因子TGF-β1 活化肝星狀細(xì)胞，從而促進(jìn)膠原基因表達(dá)，最終誘導(dǎo)肝纖維化細(xì)胞模型[14-15]。PA 是我們?nèi)粘ｏ嬍持凶畛渥愕娘柡椭舅幔赏ㄟ^氧化應(yīng)激及改變線粒體膜電位等機(jī)制引起脂質(zhì)沉積進(jìn)而導(dǎo)致脂毒性[16-17]，經(jīng)常用于NAFLD 細(xì)胞模型的制備。PA 處理過的肝細(xì)胞能夠增加外泌體的產(chǎn)生，并將肝纖維化誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至肝星狀細(xì)胞[18]。因此，為了探索脂肪性肝纖維化的最適細(xì)胞模型，本文選用PA 與TGF-β1 兩種誘導(dǎo)方式進(jìn)行細(xì)胞處理，旨在模擬脂肪性肝纖維化，從而探究脂肪性肝纖維化發(fā)展的分子機(jī)制。

基于以上實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，本文進(jìn)行了PA 及TGF-β1 實(shí)驗(yàn)作用濃度的摸索。首先通過MTT 實(shí)驗(yàn)篩選對(duì)細(xì)胞毒性最小的作用濃度，結(jié)果顯示不同濃度的PA 及TGF-β1 誘導(dǎo)后，兩組細(xì)胞的存活率出現(xiàn)不同程度的下降，100 μmol·L-1PA，2、5、10 ng·mL-1TGF-β1 誘導(dǎo)組對(duì) HepG2 細(xì)胞、LX-2 細(xì)胞的存活率影響較小。隨后通過油紅O 染色檢測細(xì)胞內(nèi)脂滴含量的變化，篩選使得肝細(xì)胞發(fā)生脂肪性變化的作用濃度，結(jié)果顯示 200、400 μmol·L-1PA誘導(dǎo)后兩組細(xì)胞內(nèi)均見明顯脂滴，10 ng·mL-1TGF-β1 誘導(dǎo)LX-2 細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)可見明顯脂滴。此外，通過檢測纖維化標(biāo)志性因子α-SMA 及CollageⅠ的mRNA 與蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示400 μmol·L-1PA，5、10 ng·mL-1TGF-β1 誘導(dǎo)HepG2 與LX-2 后細(xì)胞內(nèi)纖維化標(biāo)志因子表達(dá)水平增高。隨著濃度的增加，PA 誘導(dǎo)后細(xì)胞存活率較低。相比較而言，TGF-β1 是一種更為安全的誘導(dǎo)手段。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，200 μmol·L-1PA誘導(dǎo) HepG2 細(xì)胞、10 ng·mL-1TGF-β1 誘導(dǎo) LX-2 細(xì)胞與HepG2 細(xì)胞24 h 是成功構(gòu)建脂肪性肝纖維化細(xì)胞模型的適宜條件。