李煒?gòu)? 任艷婷 張亞楠 李欣鑫 喬佳欣 尹靈潔 馮彩平

摘 要：為了解銀杏葉多糖對(duì)發(fā)酵乳品質(zhì)及其抗氧化活性的影響，采用水提法從銀杏葉中提取多糖，研究不同銀杏葉多糖溶液濃度（0%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、025%）對(duì)1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）和羥基自由基（·OH）清除的能力。結(jié)果表明：銀杏葉多糖溶液在濃度為3.0mg/mL對(duì)DPPH的清除率為58.8%，在濃度為2.5mg/mL對(duì)·OH的清除率為61.3%，說(shuō)明銀杏葉多糖有較好的抗氧化性，可進(jìn)行加工開(kāi)發(fā)利用。

關(guān)鍵詞：銀杏葉;多糖;抗氧化活性

中圖分類號(hào) R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2021）09-0027-03

Abstract： In order to study the effect of Ginkgo biloba polysaccharide on the quality of fermented milk and its antioxidant activity， the polysaccharide was extracted by water extraction and alcohol precipitation， The scavenging ability of 1， 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical （DPPH） and hydroxyl radical （·OH） at 0%， 0.05%， 0.10%， 0.15%， 0.20% and 025% concentration of Ginkgo biloba polysaccharide solution was studied.The results showed that the scavenging rate of DPPH free radical was 58.8% at the concentration of 3.0mg/mL， and the scavenging rate of OH- free radical was 61.3% at the concentration of 2.5mg/mL， which indicated that Ginkgo biloba polysaccharides had good antioxidant activity， which could provide a basis for the development and utilization of Ginkgo biloba leaves.

Key words： Ginkgo biloba; Polysaccharide; Antioxidant activity.

銀杏（Ginkgo Biloba L.），是一種裸子植物，具有很高的藥物食用價(jià)值。在生物演化史上被稱為“活化石”，喜歡生長(zhǎng)在沙壤土中。銀杏葉多糖的主要活性化學(xué)成分為黃酮類、萜內(nèi)脂、聚戊烯醇、有機(jī)酸、花青素和多糖類化合物，具有較好的藥學(xué)功能，能幫助人們活血和止疼，還有降脂的功能[1]。銀杏葉多糖（GBEP）主要成分是萜內(nèi)酯、黃酮類等具有活性功能的化學(xué)成分，其對(duì)自由基有清除作用，具有延緩衰老、擴(kuò)張腦血管、改善毛細(xì)血管促進(jìn)血液循環(huán)等作用。最新的研究表明，GBEP對(duì)人急性早幼粒白血病細(xì)胞增殖也有抑制作用，抑制癌細(xì)胞的增殖[2]。GBEP具有廣闊的發(fā)展前景，因此，筆者對(duì)銀杏多糖進(jìn)行了深入研究，分析其抗氧化性[3]。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑 銀杏葉：購(gòu)自學(xué)校校醫(yī)室;DPPH、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、無(wú)水乙醇均來(lái)自天津航科科技公司，試驗(yàn)用水均為蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備 BSA124S電子分析天平：賽多利斯科技有限公司;HS電熱鼓風(fēng)干燥箱：蘇州達(dá)瑞電熱有限公司;UV-670紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司;SGZ離心機(jī)：長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司

1.3 方法

1.3.1 銀杏葉多糖的提取 將清洗過(guò)的新鮮銀杏葉風(fēng)干、粉碎，準(zhǔn)確稱取1g的樣品置于燒杯中，將裝有樣品的燒杯放入60℃恒溫鍋，向燒杯中加入30g水?dāng)嚢枞芙?。將溶解后的粗體液在放入高速離心機(jī)中，8000r/min下離心25min，重復(fù)3次，合并3次上清液。將上清液加入乙醇，沉淀即為多糖，裝入真空盤中，用真空干燥進(jìn)行濃縮。

1.3.2 銀杏葉多糖含量的測(cè)定 銀杏葉多糖的含量的測(cè)定可以利用苯酚-硫酸法。取1.0mL銀杏葉多糖溶液，加蒸餾水定容至2mL，再加入1mL的苯酚，混勻后，快速向其中加入5mL的濃硫酸，立即搖勻，放置30min后在490nm處測(cè)定其吸光度[3]。

1.3.3 銀杏葉多糖抗氧化性的測(cè)定

1.3.3.1 ·OH清除能力 將提前配好的95%乙醇放入比色管中，在一定濃度的1mL樣品溶液放入比色管測(cè)定，其吸光度為A1。蒸餾水1mL放入另一種空白管中作為對(duì)照，其吸光度為A0。分別加入硫酸亞鐵溶液和H2O2溶液各5mL，放入漩渦混合器旋渦3min，再加入已經(jīng)配好的3mmol/L水楊酸溶液定容至刻度，立刻放入預(yù)熱好的37℃的恒溫水中反應(yīng)15min后，分別在510nm下的波長(zhǎng)下，記錄各自的吸光度值，將各值代入公式計(jì)算，分別平行做三次實(shí)驗(yàn)。按如下公式計(jì)算清除率[4]：

式中：A0—以蒸餾水代替待測(cè)液所得的吸光度;A1—樣品液與H2O2反應(yīng)后測(cè)得的吸光度;A2—水代替H2O2溶液測(cè)得的吸光度。

1.3.3.2 清除DPPH能力 DPPH自由基具有單電子，在可見(jiàn)光520nm處有很強(qiáng)的吸收光譜，其顏色是典型的紫色。在DPPH溶液中把銀杏葉多糖清除劑加入，當(dāng)其把里面的自由基清除掉以后，會(huì)使先前的溶液由紫色向黃色或無(wú)色變化，吸收值也會(huì)相應(yīng)減小，銀杏葉多糖清除劑能使單電子配對(duì)，在520nm用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量定時(shí)，吸光度值也相應(yīng)減少，溶液褪色。這種變化使其接受電子數(shù)量成定量關(guān)系，因此可以用這種方法測(cè)定。檢測(cè)不同濃度的銀杏葉多糖對(duì)DPPH的清除能力，以相同濃度VC溶液作陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算DPPH的清除率[5-6]。

取1mL0.1mmoL/L的DPPH乙醇溶液于比色管中，分別加入2mL不同比例濃度的多糖樣品液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL），搖勻，暗處?kù)o置30min后于520nm條件下測(cè)其吸光度。以VC做陽(yáng)性對(duì)照組，計(jì)算DPPH的清除率。DPPH清除率的計(jì)算公式如下[7-8]：

式中：A0—蒸餾水與DPPH混合后的吸光度;A1—樣品液與DPPH溶液混合后的吸光度;A2—樣品液與蒸餾水混合后的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀杏葉多糖的含量 如圖1所示，求得線性回歸方程即為葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程為Y=1.3137X+0.2795，（R2=0.9824）。經(jīng)檢測(cè)銀杏葉多糖的含量為5.52%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果較李化強(qiáng)、吳菲菲等人測(cè)得的銀杏葉粗多糖的結(jié)果稍大[3]，原因可能是利用水提醇沉法提取的銀杏葉多糖中含有少量蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)。

2.2 銀杏葉多糖的抗氧化性

2.2.1 對(duì)DPPH的清除作用 由圖2可知銀杏葉多糖溶液的濃度差影響著DPPH的清除能力。銀杏葉多糖溶液濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH的清除率分別為23.4%、28.2%、30.8%、42.7%、52.9%、58.6%。當(dāng)銀杏葉的多糖濃度大于1.5mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH的清除率顯著升高。說(shuō)明當(dāng)銀杏葉多糖的濃度增大時(shí)，對(duì)DPPH的清除能力也增強(qiáng)。相同溶液濃度下，以VC溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)DPPH的清除率為82.9%、87.4%、88.2%、90.8%、92.6%、95.4%。說(shuō)明陽(yáng)性對(duì)照VC對(duì)DPPH也具有較好的清除作用。

2.2.2 對(duì)·OH的清除作用 羥自由基系活性氧一種，是人體內(nèi)目前所知活性強(qiáng)，壽命短的自由基?？墒辜?xì)胞膜被破壞，血清抗蛋白酶失去活性，損傷基因?qū)е录?xì)胞變異的出現(xiàn)和蓄積，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生，嚴(yán)重者會(huì)對(duì)基因造成破壞，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生系統(tǒng)紊亂。加入自由基清除劑后其破壞明顯降低，以Vc做陽(yáng)性對(duì)照，研究制備的不同濃度的銀杏葉多糖溶液對(duì)·OH的清除作用，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，銀杏葉多糖溶液在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL時(shí)，對(duì)·OH的清除率分別為17.7%、39.0%、48.8%、51.9%、61.3%、59.5%。當(dāng)銀杏葉多糖濃度在2.5mg/mL時(shí)，其清除率為61.3%，而當(dāng)銀杏葉多糖濃度在3.0mg/mL時(shí)，清除率卻有所下降，為59.5%。原因可能是使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)時(shí)造成了誤差。陽(yáng)性對(duì)照VC在濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL時(shí)，·OH的清除率分別為72.9%、77.8%、82.8%、87.4%、89.7%、95.3%。可以看出陽(yáng)性對(duì)照VC具有很好的抗氧化性。

3 結(jié)論與討論

利用水提醇沉的方法提取銀杏葉中的多糖，研究不同濃度銀杏葉多糖的抗氧化性。結(jié)果表明，銀杏葉多糖濃度在0～3mg/mL內(nèi)，當(dāng)濃度增加時(shí)，對(duì)DPPH的清除能力在逐漸增大，·OH的清除率也在逐漸增高，表明銀杏葉多糖具有良好的抗氧化活性，但銀杏葉多糖對(duì)DPPH的清除率明顯低于VC，這與許春雨的研究結(jié)果一致[5]。

參考文獻(xiàn)

[1]楊電增，鄒蘭蘭，錢志偉.馬齒莧多糖雙酶法提取工藝優(yōu)化及其抗氧化性研究[J].保鮮與加工，2021，21（02）：88-93.

[2]陳群，劉天驕.銀杏葉多糖的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用[J].中藥藥理與臨床，2003.19（5）：18-19.

[3]楊俊游.銀杏葉多糖提取、純化及其含量的測(cè)定[J]海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，19（6）：735-737.

[4]張瑾，王文婷，王國(guó)霞.銀杏外種皮及銀杏葉提取液對(duì)冬棗保鮮的影響研究[J].寧夏農(nóng)林科技，2018，59（07）：55-57.

[5]蘆蓮，戴余軍，李長(zhǎng)春.銀杏葉多糖提取工藝的研究[J].中國(guó)釀造，2012，31（10）：106-108.

[6]Om P. Sharma，Tej K. Bhat. DPPH antioxidant assay revisited[J]. Food Chemistry，2009，113（4）：1202–1205.

[7]鄧加聰，曾銹華，陳婕，郭婷婷，王志輝，鄭虹.牛肝菌多糖的提取及抗氧化性研究[J].中國(guó)釀造，2019，38（10）：158-161.

[8]馮書(shū)珍，盧宇鳳，劉南英，徐暢，謝廣燕，馮學(xué)珍.海藻多糖的單糖組成對(duì)體外抗氧化活性的影響[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2019，31（01）：116-121+169.

（責(zé)編：王慧晴）