項豐娟，宋琳琳，秦仁炳，潘潤舒，康壯麗，趙 良,*

（1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003；2.河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003）

肉毒梭菌為芽孢桿菌屬，是革蘭氏陽性菌，厭氧生長，周身有鞭毛，無莢膜，能形成芽孢，芽孢位于菌體終端或近端，直徑大于菌體，呈現(xiàn)湯匙狀或網(wǎng)球拍狀，具有較強的抗逆性[1-3]。肉毒梭菌在厭氧條件下可以產(chǎn)生一種毒性極強的蛋白類毒素，即肉毒毒素。根據(jù)肉毒梭菌產(chǎn)生毒素的血清特異性，把肉毒梭菌分為7 個類型：A、B、C、D、E、F 和G 型[4]。根據(jù)生理學(xué)特征，把肉毒梭菌可分為蛋白分解菌株和非蛋白分解菌株。前者包括A 型及某些B、F 型肉毒梭菌；后者包括B 型及部分E、F 型肉毒梭菌[5]。肉毒毒素是目前已知的化學(xué)有毒物質(zhì)與生物毒物中毒性最強烈的一種[6-7]。每年都有大量關(guān)于肉毒梭菌導(dǎo)致的動物中毒事件報道[8-11]，對人和動物的身體健康造成嚴(yán)重影響。

芽孢桿菌的芽孢是芽孢桿菌細(xì)胞在營養(yǎng)供應(yīng)低下或代謝產(chǎn)物積累，或溫度變化等其他苛刻環(huán)境條件期間得以存活的一種手段，是芽孢桿菌的休眠體，在一定條件下，芽孢可以保持活力數(shù)年之久[12-13]。此外，芽孢對適宜于重新進入營養(yǎng)生長周期的條件能夠做出快速的特異性反應(yīng)，一旦檢測到外部存在適宜萌發(fā)的條件，芽孢就開始萌發(fā)、恢復(fù)到營養(yǎng)細(xì)胞狀態(tài)[14]。芽孢的萌發(fā)是芽孢桿菌的一種特殊的細(xì)胞發(fā)育過程，通過一系列復(fù)雜的生理生化反應(yīng)恢復(fù)正常的新陳代謝作用，芽孢萌發(fā)具有重要的生物學(xué)功能[15]。芽孢萌發(fā)是芽孢桿菌成長為營養(yǎng)體的必須條件，芽孢萌發(fā)后就喪失了對外界熱和其他條件的抵抗力。芽孢能對一些稱之為萌發(fā)劑的營養(yǎng)性物質(zhì)產(chǎn)生響應(yīng)而萌發(fā)。通常，這些營養(yǎng)性物質(zhì)包括L-氨基酸、糖類、AGFK、嘌呤核苷等[16-17]，除了營養(yǎng)萌發(fā)劑外，芽孢在其他因子，如溶菌酶、鹽、高壓、2,6-吡啶二羧酸鈣以及陽離子表面活性劑等作用下發(fā)生萌發(fā)。這些非營養(yǎng)性因子觸發(fā)孢子萌發(fā)是非生理性的，但是它們觸發(fā)孢子萌發(fā)的途徑和營養(yǎng)性萌發(fā)劑觸發(fā)的萌發(fā)途徑是相關(guān)聯(lián)的。另外，從一個孢子釋放出來的Ca2+-DPA可能刺激其他相鄰孢子的萌發(fā)。Setlow[18]研究報道，除了營養(yǎng)性萌發(fā)劑與孢子內(nèi)膜受體作用觸發(fā)桿菌孢子的萌發(fā)外，細(xì)胞壁肽聚糖通過與內(nèi)膜蛋白激酶結(jié)合也能引起孢子的萌發(fā)。本試驗只考慮營養(yǎng)性芽孢萌發(fā)劑對芽孢萌發(fā)的影響。

肉毒梭菌的芽孢對熱、化學(xué)藥物、放射線的抵抗力極強，肉毒梭菌的芽孢在沸水中可存活1～6 h，需經(jīng)180 ℃干熱5～15 min，或121 ℃高壓蒸汽30 min方可致死，是病原菌中抗熱力最強的一個菌種[19-21]。因此，肉毒梭菌在食品工業(yè)上是罐頭食品殺菌效果的指示菌。傳統(tǒng)上，使用高溫滅菌法（121 ℃，30 min）來達(dá)到徹底消滅芽孢的目的，然而該方法在實際應(yīng)用中有諸多不便，且會破壞食品的顏色、風(fēng)味、口味、質(zhì)地，降低某些有效成分的含量及生物可利用性[22]。此外很多高效化學(xué)消毒劑如：含氯消毒劑、甲基內(nèi)酰脲類化合物、臭氧、雙鏈季銨鹽、環(huán)氧乙烷等[23]雖可有效殺滅芽孢，但是化學(xué)類消毒劑在食品工業(yè)上使用時會對人體造成一定的危害，并且對環(huán)境造成一定程度的污染。在食品工業(yè)中應(yīng)用受到嚴(yán)格限制。因此，尋找新型、方便、安全和有效的方法用于致病性芽孢桿菌的消除和預(yù)防是十分必要的，本試驗通過添加不同濃度的芽孢萌發(fā)劑L-丙氨酸和KCl，結(jié)合不同處理溫度和時間，優(yōu)化芽孢萌發(fā)條件，降低其耐熱性，然后找到芽孢最大萌發(fā)率的處理方式，并通過常壓殺菌，達(dá)到殺菌的目的。以期為食品罐頭常溫殺菌提供一定的理論依據(jù)，同時也為更高效的調(diào)控罐頭中肉毒梭狀芽胞桿菌的芽孢，進而保證食品安全提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肉毒梭菌（C.botulinum）河南科技學(xué)院微生物實驗室分離所得；L-丙氨酸（99%）阿拉丁試劑（上海）有限公司；葡萄糖、凡士林、氯化鈉 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；牛肉膏、蛋白胨 北京澳博星生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉 天津大陸化學(xué)試劑廠；以上試劑均為國產(chǎn)分析純。

GH300 電熱恒溫水溫箱、101 型電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；SHP—250 型生化培養(yǎng)箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；H1850R 離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；FA224 電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；TU—1810 紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SW-CJ-2F（標(biāo)準(zhǔn)型）雙人雙面垂直凈化工作臺 中國蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 芽孢培養(yǎng)與收集 在無菌工作臺中，用移液槍取適量肉毒梭菌菌液接種于無菌液體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，并用凡士林液封，制造厭氧環(huán)境。于35 ℃條件下培養(yǎng)10～15 d，使肉毒梭菌大量繁殖并轉(zhuǎn)化為芽孢[23]。培養(yǎng)15 d 后取少量樣液做革蘭氏染色和芽孢染色，發(fā)現(xiàn)菌體基本都已解體，存在大量芽孢。在無菌操作臺中，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到無菌的離心管中，在4000 r/min，4 ℃條件下離心10 min，離心兩次，棄上清液，收集芽孢。

1.2.2 芽孢萌發(fā)的單因素實驗 采用芽孢染色，通過血球計數(shù)板計數(shù)確定實驗單元芽孢濃度為107CFU/mL，pH 為5.5 的2 mL 的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基液體。加入其他液體時，相應(yīng)的減少培養(yǎng)基的使用量。設(shè)定一定的水浴時間，一定的水浴溫度，一定濃度的L-丙氨酸，一定濃度的KCl 為單因素。不同實驗處理后，在35 ℃條件下培養(yǎng)12 h，進行芽孢染色，觀察并計算芽孢萌發(fā)率。萌發(fā)率（%）=（細(xì)菌總量-未萌發(fā)細(xì)菌量）/細(xì)菌總量×100

1.2.2.1 水浴時間對芽孢萌發(fā)的影響 在水浴溫度為75 ℃，L-丙氨酸為10 mmol/L、KCl 為 0.3%條件下，將樣品分別處理15、20、25、30 和35 min，然后冷卻至室溫，移至35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，進行芽孢染色，觀察芽孢萌發(fā)率。重復(fù)五次。

1.2.2.2 水浴溫度對芽孢萌發(fā)的影響 將樣品水浴溫度設(shè)置為：65、70、75、80 和85 ℃，分別處理25 min，后續(xù)處理同上1.2.2.1。

1.2.2.3 L-丙氨酸濃度對芽孢萌發(fā)的影響 添加L-丙氨酸濃度梯度為：5、10、15、20 和25 mmol/L，在最佳水浴溫度和時間下刺激萌發(fā)，后續(xù)處理同上1.2.2.1。

1.2.2.4 KCl 濃度對芽孢萌發(fā)的影響 添加KCl 濃度梯度為：0.1%、0.3%、0.5%、0.7%和0.9%，后續(xù)處理同上1.2.2.1。

1.2.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken 設(shè)計原理，以芽孢萌發(fā)率為響應(yīng)值，選取溫度（A）、時間（B）、L-丙氨酸（C）、KCl（D）為影響因子，每個因子三個水平，以（-1,0,1）編碼，進行4 因素3 水平響應(yīng)面實驗，試驗因素水平設(shè)計見表1[24]。

表1 Box-Behnken 設(shè)計試驗因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment design

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用Excel 2013、SPSS 19.0 和Origin 8.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)結(jié)果的表示方法為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用Duncan’s 多重比較進行了方差分析，P＜0.05 的說明平均值之間的顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 水浴時間對芽孢萌發(fā)的影響 由圖1 可知，經(jīng)不同水浴時間處理后，芽孢的萌發(fā)率有很大變化。在15～25 min 區(qū)間內(nèi)，芽孢的萌發(fā)率呈上升趨勢，芽孢的萌發(fā)率由45%升至85%。在25～35 min 區(qū)間內(nèi)，芽孢的萌發(fā)率呈下降趨勢，芽孢的萌發(fā)率由85%降至50%。根據(jù)實驗結(jié)果可知，隨著水浴時間的增加，芽孢萌發(fā)率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在水浴時間為25 min 時，芽孢萌發(fā)率達(dá)到最大85%。說明適宜的水浴時間刺激芽孢萌發(fā)，不適的水浴時間抑制芽孢萌發(fā)，甚至使芽孢恢復(fù)到休眠狀態(tài)。水浴時間在25 min 可以作為芽孢萌發(fā)的最佳水浴時間。

圖1 水浴時間對芽孢萌發(fā)率的影響Fig.1 Effect of treatment time on spore germination rate

2.1.2 水浴溫度對芽孢萌發(fā)的影響 由圖2 可知，經(jīng)不同溫度條件處理后，芽孢的萌發(fā)率有很大變化。在65～75 ℃區(qū)間內(nèi)，芽孢的萌發(fā)率呈上升趨勢，芽孢的萌發(fā)率由53%升至80%。在75～85 ℃區(qū)間內(nèi)，芽孢的萌發(fā)率呈下降趨勢，芽孢的萌發(fā)率由80%降至39%。根據(jù)實驗結(jié)果可知，隨著水浴溫度的升高，芽孢萌發(fā)率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在水浴溫度為75 ℃時，其細(xì)胞受到刺激，促使芽孢由代謝率極低的休眠狀態(tài)恢復(fù)到活化狀態(tài)，因此芽孢的萌發(fā)率顯著提高[25]，孢萌發(fā)率達(dá)到最大80%，隨著水浴溫度繼續(xù)升高，芽孢萌發(fā)率下降。說明適宜的溫度刺激芽孢萌發(fā)，不適的溫度抑制芽孢萌發(fā)，甚至使芽孢恢復(fù)到休眠狀態(tài)。水浴溫度75 ℃可以作為芽孢萌發(fā)的最佳溫度。

圖2 不同水浴溫度對芽孢萌發(fā)率的影響Fig.2 Effect of different water bath temperatures on spore germination rate

2.1.3 L-丙氨酸濃度對芽孢萌發(fā)的影響 由圖3 可知，經(jīng)不同濃度的L-丙氨酸處理后，芽孢的萌發(fā)率有很大變化。在5～15 mmol/L 區(qū)間內(nèi)，芽孢的萌發(fā)率呈上升趨勢，芽孢的萌發(fā)率由70%升至83.8%。在15～25 mmol/L 區(qū)間內(nèi)，芽孢的萌發(fā)率呈下降趨勢，芽孢的萌發(fā)率由83.8%降至81.9%。根據(jù)實驗結(jié)果可知，隨著L-丙氨酸濃度的升高，芽孢萌發(fā)率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在L-丙氨酸濃度為15 mmol/L時，芽孢萌發(fā)率達(dá)到最大83.8%。因此，選擇L-丙氨酸濃度為15 mmol/L。

圖3 L-丙氨酸濃度對芽孢萌發(fā)率的影響Fig.3 Effect of l-Alanine concentration on spore germination rate

2.1.4 KCl 濃度對芽孢萌發(fā)的影響 由圖4 可知，經(jīng)不同含量的KCl 處理后，芽孢的萌發(fā)率有很大變化。在0.1%～0.5%區(qū)間內(nèi)，芽孢的萌發(fā)率呈上升趨勢，芽孢的萌發(fā)率由67%升至77.9%。在0.5%～0.9%區(qū)間內(nèi)，芽孢的萌發(fā)率呈下降趨勢，芽孢的萌發(fā)率由77.9%降至77%。根據(jù)實驗結(jié)果可知，隨著添加KCl 百分比的升高，芽孢萌發(fā)率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在添加0.5%的KCl 時，芽孢萌發(fā)率達(dá)到最大77.9%，說明添加適宜的KCl 刺激芽孢萌發(fā)。故KCl 百分比的添加量選擇0.5%最佳。

圖4 添加KCl 比例對芽孢萌發(fā)率的影響Fig.4 Effect of adding KCl ratio on spore germination rate

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1 利用Box-Behnken 設(shè)計原理設(shè)計試驗結(jié)果根據(jù)表1 選定的響應(yīng)面考察因素和水平，通過Box-Behnken 方法以溫度（A）、時間（B）、L-丙氨酸（C）、KCl（D）為自變量，以芽孢萌發(fā)率為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面分析實驗，實驗分析方案結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗結(jié)果Table 2 Result and analysis of response surface method design

2.2.2 多元二次回歸擬合及方差分析 將利用Box-Behnken 設(shè)計原理設(shè)計實驗的結(jié)果進行分析，然后利用Design Expert 軟件對觀察到的芽孢萌發(fā)率進行回歸分析，所得方差分析結(jié)果見表3。

獲得的芽孢萌發(fā)率Y 對自變量水浴溫度（A）、水浴時間（B）、添加L-丙氨酸濃度（C）、添加KCl 濃度（%）（D）的多元回歸方程：

由表3 可知，模型P＜0.0001，決定系數(shù)R2=0.9719，則說明模型與實際情況擬合良好，試驗方法比較可靠，失擬項P=0.1652＞0.05，則不顯著，說明模型較準(zhǔn)確[26]；且C.V.%（變異系數(shù)）=1.63＜10%，AdeqPrecision（精密度）=19.496＞4，說明該模型可用且有較好的穩(wěn)定性。在該方差分析中，F(xiàn)值體現(xiàn)各單因素對芽孢萌發(fā)率影響的大小，F(xiàn)值越大，萌發(fā)率越好由F 值的大小可知，影響芽孢萌發(fā)率的主次因素為A＞D＞C＞B，即水浴溫度＞KCl 濃度（%）＞L-丙氨酸濃度＞水浴時間。因此，根據(jù)以上分析得知可用該模型對實驗結(jié)果進行分析和響應(yīng)值預(yù)測。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.3 響應(yīng)面分析 當(dāng)響應(yīng)面的等高線圖的形狀越接近于圓形時，說明兩因素之間的交互作用越不顯著；當(dāng)它為橢圓或鞍馬形時，表示兩者交互作用顯著[27]。另外，響應(yīng)面圖中曲面的陡峭程度能直觀反映單因素對響應(yīng)值提取率影響的大小。

2.2.4 因子兩兩交互作用分析 根據(jù)上述回歸方程，做出擬合響應(yīng)曲面的形狀，分析水浴溫度、水浴時間、L-丙氨酸濃度、KCl 濃度不同組合對芽孢萌發(fā)率的影響。

溫度與時間的交互作用3D 圖（圖5）表明，芽孢萌發(fā)率隨著水浴溫度的升高和水浴時間的延長而增加，在水浴溫度為75 ℃，水浴時間為25 min，芽孢萌發(fā)率達(dá)到最大值，隨后下降。等高線圖近似呈橢圓形，說明溫度與時間的交互作用不是很明顯。在溫度軸向等高線分布比時間軸向密集，說明溫度對萌發(fā)率影響較大。

圖5 溫度與時間交互作用對芽孢萌發(fā)率的影響Fig.5 Effect of temperature and time interaction on spore germination rate

溫度與L-丙氨酸的交互作用圖（圖6）表明，芽孢萌發(fā)率隨著水浴溫度的提高和L-丙氨酸的添加量的增大而增加，在水浴溫度為75 ℃，L-丙氨酸濃度為15 mmol/L，芽孢萌發(fā)率達(dá)到最大值，隨后下降。等高線圖近似呈橢圓形，說明溫度與L-丙氨酸的交互作用不是很顯著。在溫度軸向等高線分布比L-丙氨酸軸向密集，說明溫度對萌發(fā)率影響較大[28]。

圖6 溫度與L-丙氨酸交互作用對芽孢萌發(fā)率的影響Fig.6 Effect of temperature and l-alanine interaction on spore germination rate

溫度與KCl 的交互作用3D 圖（圖7）表明，芽孢萌發(fā)率隨著水浴溫度的提高和添加KCl 濃度的增加而增加，在水浴溫度為75 ℃，KCl 添加比例為0.5%，芽孢萌發(fā)率達(dá)到最大值，隨后下降。等高線圖近似呈橢圓形，說明溫度與KCl 的交互作用不是很明顯。在溫度軸向等高線分布比KCl 軸向密集，說明溫度對萌發(fā)率影響較大。

圖7 溫度與KCl 交互作用對芽孢萌發(fā)率的影響Fig.7 Effect of temperature and KCl interaction on spore germination rate

圖8 顯示：芽孢萌發(fā)率隨著水浴時間的提高和添加L-丙氨酸濃度的增加而增加，在水浴時間為25 min，添加L-丙氨酸濃度為15 mmol/L，芽孢萌發(fā)率達(dá)到最大值，隨后下降。等高線圖呈橢圓形，說明水浴時間與添加L-丙氨酸濃度的交互作用顯著。在C 軸向等高線分布比B 軸向密集，說明L-丙氨酸對萌發(fā)率影響較大。

圖8 時間與L-丙氨酸交互作用對芽孢萌發(fā)率的影響Fig.8 Effect of time interaction with L-alanine on spore germination rate

圖9 顯示：芽孢萌發(fā)率隨著水浴時間的提高和添加KCl 濃度的增加而增加，在水浴時間為25 min，添加KCl 比例為0.5%，芽孢萌發(fā)率達(dá)到最大值，隨后下降。等高線圖呈橢圓形，說明水浴時間與添加KCl 比例的交互作用非常顯著。在D 軸向等高線分布比B 軸向密集，說明添加KCl 比例對萌發(fā)率影響很大。

圖9 時間與添加KCl 比例交互作用對芽孢萌發(fā)率的影響Fig.9 Effect of time and KCl proportional interaction on spore germination rate

圖10 顯示：芽孢萌發(fā)率隨著添加L-丙氨酸濃度的增加和添加KCl 比例的增大而增加，達(dá)到最大值后隨后下降。等高線圖呈橢圓，說明L-丙氨酸和KCl 的交互作用比較顯著。D 軸方向等高線分布更加密集，說明KCl 對芽孢萌發(fā)率的影響更加顯著。

圖10 L-丙氨酸和KCl 交互作用對芽孢萌發(fā)率的影響Fig.10 Effect of L-alanine and KCl interaction on spore germination rate

2.2.5 驗證試驗 通過響應(yīng)面試驗，得到的最佳工藝參數(shù)為：水浴溫度75.52 ℃，水浴時間24.82 min，添加L-丙氨酸濃度15.44 mmol/L，添加KCl 濃度0.53%，最優(yōu)條件下芽孢萌發(fā)率為90.0615%。在驗證試驗中，選取水浴溫度為75.5 ℃，水浴時間為25.0 min，添加L-丙氨酸濃度為15.4 mmol/L，添加KCl 濃度為0.53%，用同樣的條件進行3 次重復(fù)試驗，得到的芽孢萌發(fā)率為89.91%±1.31%，與回歸方程的理論結(jié)果90.0615%相差不大，因此，得到的響應(yīng)面的結(jié)果比較好，優(yōu)化的工藝條件有效且可靠。經(jīng)過兩次100 ℃殺菌20 min 處理，肉毒梭菌殺滅率可達(dá)98%，但是并沒有使芽孢完全殺滅，可能的原因是芽孢萌發(fā)過程中存在深休眠芽孢，深休眠芽孢內(nèi)核的水分含量更低、熱抗性和熱激活溫度更高[29]。因此，需要在此試驗的基礎(chǔ)上繼續(xù)探索，采用多種萌發(fā)手段，盡可能的使芽孢同步快速全部萌發(fā)。

3 結(jié)論

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，得到影響芽孢萌發(fā)因素的最佳水平范圍，并對其進行4 因素3 水平的響應(yīng)面法試驗設(shè)計優(yōu)化肉毒梭菌芽孢萌發(fā)條件，共進行了29 組試驗。根據(jù)響應(yīng)面試驗結(jié)果，建立了一個以肉毒梭菌芽孢萌發(fā)率為目標(biāo)值，以溫度，水浴時間，L-丙氨酸濃度，KCl 添加量為因子的數(shù)學(xué)模型，方差分析表明擬合度較好。通過對回歸方程優(yōu)化計算，在最優(yōu)條件下：水浴溫度為75.5 ℃，水浴時間為25.0 min，L-丙氨酸添加濃度為15.4 mmol/L，KCl 濃度為0.53%條件下進行實驗，得到芽孢萌發(fā)率為89.91%±1.31%，與理論值90.0615%基本一致。并在此基礎(chǔ)上再進行兩次100 ℃殺菌20 min，殺滅率可達(dá)98%。該結(jié)論為食品罐頭常溫殺菌提供一定的理論依據(jù)，同時也更高效的調(diào)控罐頭中肉毒梭狀芽胞桿菌的芽孢，進而保證食品安全提供科學(xué)依據(jù)。