丁 燕，Roland HARRISON，王超萍，陳迎春，韓曉梅，吳新穎,*

（1.山東省葡萄研究院，山東濟南 250100；2.山東省葡萄栽培與精深加工工程技術(shù)研究中心，山東濟南 250100；3.新西蘭林肯大學(xué)葡萄酒食品及分子生物學(xué)系，新西蘭坎特伯雷 7647）

縮合單寧（Condensed tannins）又稱原花色素（Proanthocyanidins，PAs），主要是以黃烷-3-醇為基本單元，通過C4-C8或C4-C6共價鍵連接而成的多聚體，其中根據(jù)黃烷-3-醇單元B 環(huán)羥基數(shù)目的不同和C 環(huán)3-羥基結(jié)構(gòu)的不同，主要可分為兒茶素（CAT）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）和表兒茶素沒食子酸酯（ECG）等，其酚羥基基團(tuán)能與蛋白質(zhì)、金屬離子、花色苷、多糖等結(jié)合[1-3]。作為葡萄與葡萄酒中一類重要的多酚物質(zhì)，其含量、結(jié)構(gòu)、聚合度、沒食子?；鹊葘ζ咸丫聘泄偬匦裕缟珴?、澄清度、酒體、苦澀味等以及穩(wěn)定性、陳釀潛力等都具有直接或間接的影響[4-5]。

葡萄酒中的縮合單寧主要來源于葡萄皮和種子，發(fā)酵過程中通過皮渣浸漬作用等進(jìn)入葡萄酒中。葡萄原料中的縮合單寧的含量、聚合度、結(jié)構(gòu)等會因葡萄品種、不同組織部位、葡萄成熟度等而有差異，如葡萄皮縮合單寧中含有原花青靛（Prodelphinidins，PDs），而種子中則沒有；葡萄皮縮合單寧的平均聚合度（mDP）一般為20，而種子中的平均聚合度一般為5～8；葡萄皮中縮合單寧構(gòu)成單元主要由CAT、EC、ECG、EGC 等組成，而葡萄種子中則主要由CAT、EC、ECG 等組成[6-7]。研究人員曾利用不同的分析方法對不同品種葡萄果實中的縮合單寧進(jìn)行過測定，研究結(jié)果表明，葡萄收獲時果實中的縮合單寧含量并不能代表最終能浸提到葡萄酒中的縮合單寧水平[8-9]，因為除了葡萄原料之外，釀造過程中發(fā)酵溫度、皮渣浸漬時間、低溫預(yù)發(fā)酵工藝、皮汁比調(diào)整、浸漬酶添加等不同的釀酒工藝，都會影響成品葡萄酒中酚類物質(zhì)的含量以及組成[10-11]，研究釀造工藝對最終葡萄酒產(chǎn)品中縮合單寧的組成和含量具有重要的意義。基于此，本文主要通過探究葡萄皮渣浸漬時間對葡萄酒中縮合單寧的組成以及感官品質(zhì)的影響，以期對葡萄酒釀造工藝的改進(jìn)有所助益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒葡萄赤霞珠、西拉 于2017 年4 月采自新西蘭林肯大學(xué)葡萄種質(zhì)資源圃，每個品種選取20 株葡萄，每株葡萄隨機選擇葡萄穗，在葡萄穗的不同部位摘取5～10 粒葡萄，共摘取大約600 g 葡萄粒，分成3 份保存；酵母Lalvin D254 法國拉曼公司；亞硫酸 帝伯仕公司；丙酮、甲醇、乙腈、甲酸、乙酸HPLC 色譜級，美國Fisher 公司；（+）-兒茶素、（-）-表兒茶素、（-）-表棓兒茶素、（-）-表棓兒茶素沒食子酸酯、三氟乙酸、抗壞血酸、醋酸鈉 美國Sigma-Aldrich 公司；Toyopearl HW-50（F）日本Tosoh 公司；實驗用水 超純水（電導(dǎo)度18 M）。

Waters 2695 高效液相色譜儀、Waters 2996 光電二極管陣列檢測器（PDA）美國Waters 公司；Multifuge X1R 臺式高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher 公司；Eyela N 1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本Eyela 公司；Labconco Centrivap 真空離心濃縮儀美國Labconco 公司；Christ Alpha 1-4 LSC plus 冷凍干燥機 德國Christ 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同皮渣浸漬發(fā)酵工藝 參考李華等[12]的工藝流程。釀酒葡萄→除梗破碎→葡萄漿→添加亞硫酸（60 mg/L）→添加酵母（200 mg/L）→ 25 ℃浸漬發(fā)酵（皮渣浸漬7、14、21 d，期間每天壓帽2～3 次）→皮渣分離（1.5 bar 壓榨）→自流汁與壓榨汁混合進(jìn)入后酵（25±1 ℃）→待還原糖降至2 g/L 時發(fā)酵結(jié)束→倒罐→下膠澄清（皂土，添加量通過試驗確定，參考用量0.3～0.6 g/L）→紙板過濾→充氮氣低溫儲存（12～15 ℃）。

1.2.2 葡萄皮和籽中縮合單寧的分離 參考Kennedy等[13]的方法，并稍作修改。取10 粒葡萄，稱重，手動分離葡萄皮和種子，用雙蒸水沖洗。分別放入具塞離心管中，加入1 mL/g 粒重的丙酮:水（3:2，v/v）提取液，室溫避光振蕩提取24 h。提取液低溫離心15 min（8000 r/min，4 ℃），上清液進(jìn)行真空旋蒸，凍干成粉。用1 mL 甲醇重溶，置于2 mL 棕色樣品瓶中，-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩Ｋ腥雍头治鼍? 次重復(fù)。間苯三酚酸催化降解反應(yīng)：取100 μL 甲醇重溶液，加入100 μL 間苯三酚反應(yīng)試劑，50 ℃水浴反應(yīng)20 min 后，加入400 μL 0.2 mol/L 醋酸鈉溶液，終止反應(yīng)。間苯三酚反應(yīng)試劑的配制：0.2 mol/L 鹽酸甲醇溶液，含100 g/L 間苯三酚和20 g/L 抗壞血酸。

1.2.3 葡萄酒中縮合單寧的分離 參考Pastor 等[14]的方法，并進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化。取5 mL 葡萄酒樣品，真空濃縮儀濃縮，用3 mL 水:乙酸（98:2，v/v）重溶，上Waters C18固相萃取小柱。樣品完全吸附后，用20 mL水:乙酸（98:2，v/v）洗柱，再用10 mL 甲醇洗脫，得到的甲醇洗脫液進(jìn)行真空旋蒸，凍干成粉。用1 mL甲醇重溶，置于2 mL 棕色樣品瓶中，-20 ℃避光保存?zhèn)溆谩ｉg苯三酚酸催化降解反應(yīng)同1.2.2。

1.2.4 縮合單寧的HPLC 分析條件 HPLC 分析方法參考Ducasse 等[15]的方法，并稍作修改。Waters Atlantis dC18（250 mm×4.6 mm,5 μm）色譜柱，Waters 保護(hù)柱（20 mm×4.6 mm，5 μm），紫外檢測波長為280 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，流速為0.8 mL/min。梯度洗脫：流動相A：水：甲酸（98:2，v/v），流動相B：乙腈：流動相A（80:20，v/v）。洗脫程序：0～5 min，0 B；5～35 min，0～10% B；35～70 min，10%～20%B；70～75 min，20%～100% B；75～80 min，100%～0 B?？s合單寧構(gòu)成單元根據(jù)保留時間以及參考已報道的資料文獻(xiàn)進(jìn)行定性[13]，并以（+）-兒茶素（CAT）為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行外標(biāo)法定量，相關(guān)計算參考文獻(xiàn)[7,13]的方法。

1.2.5 感官分析 由10 名品酒員組成品評小組，在正式感官評定前，先用酒石酸、硫酸奎寧、硫酸鋁等配制不同濃度的模擬酒液，分別進(jìn)行酸味、苦味、澀味的品評訓(xùn)練。然后再對不同浸漬時間處理的葡萄酒樣品進(jìn)行感官品評分析，主要對酒樣的酸度、澀度以及苦味進(jìn)行評價和描述，采取8 分制，8 分表示強度最高。根據(jù)定量描述分析結(jié)果繪制蛛網(wǎng)圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件分析。通過鄧肯檢驗和ANOVA 方差分析法進(jìn)行變量間差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種葡萄原料中縮合單寧組成及含量

葡萄原料中的縮合單寧含量會直接影響葡萄酒中的濃度。從表1 可以看出，赤霞珠葡萄皮中縮合單寧含量大約為9.42 mg/g 皮，顯著（P＜0.05）高于西拉葡萄皮中的含量（5.32 mg/g 皮）；百克鮮重含量大約為80.92 mg/100 g，也明顯高于西拉葡萄的44.36 mg/100 g。赤霞珠葡萄皮縮合單寧的聚合度mDP約為23.50，明顯高于西拉葡萄皮的14.61，這與文獻(xiàn)[16]的研究結(jié)果基本一致。此外，西拉葡萄皮中縮合單寧沒食子?；龋?.22%）要顯著（P＜0.05）大于赤霞珠葡萄皮（2.41%）。

表1 赤霞珠和西拉葡萄皮中縮合單寧的含量及組成Table 1 Contents and composition of condensed tannins in CS and Syrah skin

從表2 可以看出，赤霞珠葡萄籽中縮合單寧含量約為24.56 mg/g 籽，略高于西拉葡萄籽中的含量20.89 mg/g 籽；2 個品種葡萄籽縮合單寧平均聚合度mDP 沒有明顯差異。此外，西拉葡萄種子中縮合單寧的沒食子?；龋?0.65%）顯著（P＜0.05）高于赤霞珠葡萄種子（15.82%）。

表2 赤霞珠和西拉葡萄籽中縮合單寧的含量及組成Table 2 Content and composition of condensed tannins in CS and Syrah seed

從表1 和表2 還可以看出，2 個品種葡萄皮縮合單寧末端單元主要是由（+）-兒茶素（CAT）組成，其次是（-）-表兒茶素（EC）；而延伸單元則主要是由（-）-表棓兒茶素（EGC）組成和（-）-表兒茶素（EC）主導(dǎo)組成，這與文獻(xiàn)[8]研究結(jié)果一致。2 個品種葡萄籽縮合單寧末端單元均主要由（+）-兒茶素（CAT）、（-）-表兒茶素（EC）組成，其次是（-）-表兒茶素沒食子酸酯（ECG），而延伸單元則主要由（-）-表兒茶素（EC）組成，其次是（-）-表兒茶素沒食子酸酯（ECG），不含有（-）-表棓兒茶素（EGC）延伸單元，這與文獻(xiàn)[13]研究結(jié)果一致。從表1 與表2 中還可以看出，葡萄籽縮合單寧含量顯著（P＜0.05）高于葡萄皮中的含量；葡萄皮縮合單寧的平均聚合度mDP 顯著（P＜0.05）高于葡萄籽，而其沒食子?；葎t顯著（P＜0.05）低于葡萄籽縮合單寧。

2.2 皮渣浸漬時間對縮合單寧的影響

從表3 中可以看出，皮渣浸漬時間對不同品種葡萄酒中縮合單寧的組成及含量都有明顯影響，隨著浸漬時間的延長，縮合單寧的總含量呈上升趨勢。

表3 不同浸漬時間處理赤霞珠和西拉葡萄酒中縮合單寧組成及含量Table 3 Content and composition of condensed tannins in CS and Syrah wines produced with different maceration times

由表1～表3 可得，西拉葡萄原料中的葡萄皮縮合單寧含量（443.6 mg/kg 葡萄）顯著（P＜0.05）低于赤霞珠葡萄皮縮合單寧含量（809.2 mg/kg 葡萄）（表1），而西拉葡萄籽縮合單寧含量（877.8 mg/kg 葡萄）也略低于赤霞珠葡萄籽縮合單寧含量（998.1 mg/kg 葡萄）（表2），但是對葡萄酒的檢測結(jié)果卻顯示，3 個處理的西拉葡萄酒中的縮合單寧含量都比相應(yīng)處理的赤霞珠葡萄酒中的含量高，這可能與不同葡萄品種的葡萄皮細(xì)胞壁的成分和組成有關(guān)系，不同品種葡萄皮細(xì)胞壁中成分的組成和含量不同會影響酚類物質(zhì)的浸提率[17-19]，因此原料中酚類物質(zhì)含量高的葡萄品種，其酒中的多酚含量不一定高，這可能是葡萄酒中縮合單寧含量與葡萄原料中的縮合單寧含量不同的原因。

從表3 中還可以看出，隨著浸漬時間的延長，2 個品種葡萄酒中縮合單寧平均聚合度mDP 均呈明顯下降趨勢，這可能是由于浸漬初期縮合單寧主要是來自于葡萄皮，而隨著浸漬時間的延長，葡萄籽縮合單寧的浸提量開始增加，從而使得平均聚合度mDP相應(yīng)出現(xiàn)下降[6-8]，這一趨勢與葡萄酒中葡萄皮和葡萄籽縮合單寧的含量變化趨勢相符合。從表3 中看出，葡萄酒中葡萄皮縮合單寧的含量隨著初期浸漬時間的延長有所上升，但到后期浸漬14 和21 d 的含量則變化不再顯著，而酒中葡萄籽縮合單寧的含量則隨著浸漬時間的延長而呈顯著（P＜0.05）上升趨勢。

如表1 和表2 所示，葡萄原料中葡萄皮縮合單寧含量顯著（P＜0.05）低于葡萄籽縮合單寧含量，但從表3 來看，葡萄酒中葡萄皮縮合單寧的占比卻一直顯著（P＜0.05）高于種子縮合單寧的占比，而且赤霞珠和西拉葡萄中葡萄皮縮合單寧的浸提率分別為10.19%～22.78%、41.60%～63.19%，而葡萄籽縮合單寧的浸提率則分別為3.90%～9.58%、3.19%～8.32%，這可能是由于葡萄皮中縮合單寧比葡萄籽縮合單寧更容易浸提到葡萄酒中，而且品種對浸提率，尤其是葡萄皮縮合單寧的浸提率有更為顯著的影響，這一結(jié)果與文獻(xiàn)[20-22]研究結(jié)果一致。此外，葡萄原料中縮合單寧的浸提率較低，尤其是葡萄籽縮合單寧浸提率更低，除了受品種[9]及果皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)[17]的影響之外，還可能是由于葡萄破碎后葡萄皮及葡萄籽中浸出的縮合單寧會與果皮和果肉細(xì)胞壁多糖或者酵母細(xì)胞釋放的甘露蛋白、多糖等發(fā)生結(jié)合，從而降低了其在葡萄酒中的定量[22-23]。

2.3 皮渣發(fā)酵浸漬時間對葡萄酒中縮合單寧相關(guān)味覺指標(biāo)的影響

葡萄原料中酚類物質(zhì)的含量及其在酒中與其他物質(zhì)的互作反應(yīng)與紅葡萄酒的感官特性密切相關(guān)。從圖1 和圖2 中可以看出，浸漬21 d 處理的葡萄酒澀味得分較高，這可能與其中縮合單寧的濃度較高有關(guān)[24-27]。不同浸漬發(fā)酵時間處理之間酸味無顯著差異；浸漬21 d 的赤霞珠葡萄酒的苦味與其他兩個處理有顯著（P＜0.05）差異，西拉葡萄酒3 個處理間的苦味無顯著差異。由此可見，相對于苦味和酸味，浸漬時間處理對葡萄酒的澀味影響更為明顯。

圖1 不同浸漬發(fā)酵時間赤霞珠葡萄酒縮合單寧相關(guān)味覺指標(biāo)分析Fig.1 Mouth-feel attributes related with condensed tannins in CS wines produced with different maceration times

圖2 不同浸漬發(fā)酵時間西拉葡萄酒縮合單寧相關(guān)味覺指標(biāo)分析Fig.2 Mouth-feel attributes related with condensed tannins in Syrah wines produced with different maceration times

3 結(jié)論

不同葡萄品種中縮合單寧的含量、組成、聚合度及沒食子?；识加酗@著差異（P＜0.05）。釀酒葡萄果皮中縮合單寧的平均聚合度mDP 顯著高于葡萄籽（P＜0.05），而葡萄皮縮合單寧的沒食子酰化率則顯著低于葡萄籽縮合單寧（P＜0.05）。葡萄皮和葡萄籽縮合單寧的組成也有所不同，其中葡萄皮縮合單寧末端單元主要是由（+）-兒茶素（CAT）組成，其次是（-）-表兒茶素（EC）；而延伸單元則主要是由（-）-表棓兒茶素（EGC）組成和（-）-表兒茶素（EC）主導(dǎo)組成；而葡萄籽縮合單寧末端單元均主要由（+）-兒茶素（CAT）、（-）-表兒茶素（EC）組成，其次是（-）-表兒茶素沒食子酸酯（ECG），而延伸單元則主要由（-）-表兒茶素（EC）組成，其次是（-）-表兒茶素沒食子酸酯（ECG），不含有（-）-表棓兒茶素（EGC）延伸單元。