邵悅春，付曉婷，許加超，高 昕

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003）

海帶（Laminaria japonica），又名綸布、江白菜、昆布，是一種生長于低溫海域中的多年生大型食用藻類，隸屬褐藻門（Phaeophyta）、海帶科（Laminariaceae）海帶屬（Laminaria）[1]。在亞洲，尤其是我國、日本、韓國等國家，海帶因其豐富的營養(yǎng)及獨(dú)特的風(fēng)味成為人們喜愛的食用藻類之一[2]。除了用作食品原料外，海帶還具有較高的經(jīng)濟(jì)價值，能夠作為工業(yè)上提取褐藻膠、甘露醇、碘的原料，其中褐藻膠作為廣泛應(yīng)用的食品添加劑被加入到各種食品中[3]。同時，海帶中富含多種活性物質(zhì)如褐藻膠、褐藻糖膠、海藻多酚等，這些活性物質(zhì)使得海帶有降血脂、降血糖、抗癌和提高免疫力等功效，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有較大的潛力與價值[4]。

我國是全球海藻養(yǎng)殖及其加工利用規(guī)模最大的國家，海帶產(chǎn)量約占世界產(chǎn)量的80%，位居世界首位[5]。我國海帶產(chǎn)量雖逐年增長，但其加工程度低，主要以傳統(tǒng)的初級產(chǎn)品為主[6]。由于海帶細(xì)胞壁中存在大量如褐藻膠等的多糖，其水溶性較差，同時海帶中的呈味物質(zhì)以及功能因子被膠體緊密包裹，不易溶出和提取，因此海帶中活性成分提取在很大程度上被制約[7]?？梢?，探索海帶的深加工技術(shù)，是我國海帶產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要方向[8]。

發(fā)酵指的是在微生物的作用下，復(fù)雜的有機(jī)化合物被分解成比較簡單的物質(zhì)的一種生物氧化方式，其過程是微生物和酶所引起的一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)[9]。使用發(fā)酵方法加工食品的歷史悠久且優(yōu)點(diǎn)顯著，如發(fā)酵可產(chǎn)生醇類、氨基酸、酯類和有機(jī)酸等物質(zhì)使產(chǎn)品具有獨(dú)特的風(fēng)味及色澤。目前，大多數(shù)發(fā)酵的海洋食品是由魚和蝦等動物材料制成的，使用發(fā)酵方法加工的海藻類產(chǎn)品較少，還處于起步階段，國內(nèi)主要產(chǎn)品為海藻發(fā)酵酒、海藻發(fā)酵飲料、海藻發(fā)酵醬等[10]。

氣相色譜-離子遷移譜聯(lián)用（gas chromatographyion mobility spectroscopy，GC-IMS）是一種將氣相色譜和離子遷移譜結(jié)合的檢測技術(shù)，用于分析樣品中的揮發(fā)性化合物，首先利用氣相色譜對待測樣品進(jìn)行預(yù)分離，然后通過離子遷移譜進(jìn)行揮發(fā)性組分的分析[11]。該方法不但使得離子遷移譜的信號響應(yīng)質(zhì)量得到顯著提高，又使得氣相色譜分離后所得的化學(xué)信息更加豐富，充分發(fā)揮了兩種技術(shù)各自的優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)具有簡單、快速、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于食品風(fēng)味分析、品質(zhì)評價、環(huán)保安全等多個生命化學(xué)領(lǐng)域[12]。近年來，國內(nèi)外利用GC-IMS 進(jìn)行食品風(fēng)味的研究主要集中在植物油[13]、菌類[14]、肉制品[15]、魚類[16]等風(fēng)味豐富的物質(zhì)。目前尚未見GC-IMS 應(yīng)用于發(fā)酵海帶風(fēng)味物質(zhì)檢測的報道。

本研究以不同條件下發(fā)酵后所得6 個發(fā)酵海帶樣品及發(fā)酵前的海帶樣品為研究對象，采用GC-IMS的方式進(jìn)行揮發(fā)性風(fēng)味成分分析，探究其風(fēng)味物質(zhì)組成成分及相對含量的變化，將風(fēng)味成分所發(fā)生的變化以可視化的方式表現(xiàn)出來。通過比較不同糖鹽含量和不同菌種發(fā)酵前后海帶風(fēng)味所發(fā)生的變化，為促進(jìn)海帶的高值化利用、改善其風(fēng)味提供新方法、新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干海帶 金鵬旗艦店，原料來自榮成海域；泡菜酸菜乳酸菌發(fā)酵粉 北京川秀科技有限公司；安琪高活性干酵母粉 安琪酵母股份有限公司；綿白糖 青島華潤澤食品有限公司；食鹽 青島鹽海制鹽有限公司。

LDZM-80L 立式高壓蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；DWP-9082 電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SW-CJ-1FD 潔凈工作臺 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Flavour Spec? 風(fēng)味分析儀 德國G.A.S 公司；CTC-PAL 自動頂空進(jìn)樣器 瑞士CTC Analytics 公司；SE-54 毛細(xì)管柱（規(guī)格：15 m×0.53 mm×1.0 μm） 德國CS-Chromatographie Service 設(shè)備供應(yīng)商。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海帶的預(yù)處理 干海帶從中肋處對稱分成兩半，一半用于后續(xù)發(fā)酵處理，另一半作為未發(fā)酵的海帶對照樣品。將干海帶洗凈后于60 ℃復(fù)水2～3 h。復(fù)水后的海帶瀝水，切成約4 cm×4 cm 方片狀，置于滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min，滅菌完成后冷卻備用。

1.2.2 菌種活化

1.2.2.1 乳酸菌活化 1 g 乳酸菌菌粉（泡菜酸菜乳酸菌發(fā)酵粉，包括植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌）加入到100 mL 滅菌水中，37 ℃培養(yǎng)活化12 h。

1.2.2.2 酵母菌活化 2 g 酵母粉加入到50 mL 滅菌2%糖水中，28 ℃活化培養(yǎng)1 h。

1.2.3 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 無菌糖鹽水制備 將12 g 綿白糖與12 g 食鹽加入300 mL 超純水中，即4%糖鹽水；將18 g 綿白糖與18 g 食鹽加入300 mL 超純水中，即6%糖鹽水。將4%糖鹽水、6%糖鹽水置于滅菌鍋中，121 ℃滅菌20 min，滅菌完成后冷卻備用。

1.2.3.2 乳酸菌發(fā)酵 將200 g 滅菌后的海帶片分別與300 mL 不同濃度（4%、6%）滅菌糖鹽水在無菌操作臺中混合，按菌種使用說明中1 g 乳酸菌粉發(fā)酵1 kg 樣品的比例，每200 g 海帶樣品中加入300 mL糖鹽水及20 mL 活化后的乳酸菌液，密封后于30 ℃發(fā)酵10 d。

1.2.3.3 酵母菌發(fā)酵 將200 g 滅菌后的海帶片分別與300 mL 不同濃度（4%、6%）滅菌糖鹽水在無菌操作臺中混合，同時加入50 μL 活化后的酵母菌液，密封后于30 ℃發(fā)酵10 d。

1.2.3.4 乳酸菌與酵母菌復(fù)合發(fā)酵 將200 g 滅菌后的海帶片分別與300 mL 不同濃度（4%、6%）滅菌糖鹽水在無菌操作臺中混合，同時加入20 mL 活化后的乳酸菌液和50 μL 活化后的酵母菌液，密封后于30 ℃發(fā)酵10 d。

1.2.4 風(fēng)味分析儀測定

1.2.4.1 樣品處理 將發(fā)酵前及發(fā)酵后的海帶樣品分別取樣，將海帶片與水以1:2 的比例混合、搗碎，準(zhǔn)確稱取0.5 g 搗碎后的樣品放入20 mL 頂空進(jìn)樣瓶中，加蓋，密封，待測。

1.2.4.2 頂空自動進(jìn)樣器條件 將密封好的頂空瓶放入頂空自動進(jìn)樣器，于50 ℃孵化10 min，采用振蕩加熱方式孵化后，進(jìn)行自動進(jìn)樣測定。進(jìn)樣針吸取上層體積為500 μL 的氣體，于60 ℃條件下進(jìn)樣。

1.2.4.3 GC 條件 設(shè)置氣相色譜柱溫度為40 ℃，測定過程中的載氣為高純N2；載氣流速為海帶風(fēng)味物質(zhì)分離最適流速：初流速為2 mL/min 保持2 min，后升至10 mL/min 保持3 min，再升至15 mL/min 保持10 min，再升至50 mL/min 保持5 min，最后升至150 mL/min 保持5 min，總分析時間為25 min。

1.2.4.4 IMS 檢測條件 設(shè)置IMS 漂移管溫度為45 ℃，測定過程中的漂移氣為高純N2，漂移氣的流速保持150 mL/min 不變；漂移管內(nèi)的電離源為氘放射，即β射線，離子化模式為正離子模式。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個樣品平行測定3 次。利用GC-IMS 自帶的LAV 分析軟件對發(fā)酵海帶的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行采集、指紋圖譜的建立及PCA 分析；通過GC×IMS Library Search 定性軟件內(nèi)置的NIST 氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫和IMS 遷移時間數(shù)據(jù)庫對采集的VOCs 進(jìn)行定性分析；利用Origin 軟件對PCA 分析數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-IMS 譜圖分析

風(fēng)味分析儀生成的數(shù)據(jù)是三維譜圖，包括保留時間、遷移時間和峰強(qiáng)度，為便于觀察，取俯視圖進(jìn)行差異對比。圖1 為海帶發(fā)酵前后的GC-IMS 譜圖，橫坐標(biāo)1.0 處紅線表示反應(yīng)離子峰（reaction ion peak，RIP）。RIP 峰兩側(cè)的每一個點(diǎn)代表一種揮發(fā)性有機(jī)物，顏色越深表示該化合物的濃度越大[17]。從圖1 中可以看出，發(fā)酵后海帶中的風(fēng)味物質(zhì)明顯增多；C、D、F、G 樣品中因含有酵母菌，發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，因此GC-IMS 譜圖RIP 峰右側(cè)出現(xiàn)兩條紅線為乙醇峰，由于酵母菌發(fā)酵后的樣品中乙醇含量較高，該峰產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象。除此之外，海帶發(fā)酵前后樣品中的揮發(fā)性有機(jī)物通過GC-IMS 得到了較好的分離，且可直觀比較不同發(fā)酵條件產(chǎn)生的VOCs 間的差異。

圖1 海帶發(fā)酵前后的GC-IMS 譜圖Fig.1 GC-IMS spectrum of unfermented and fermented Laminaria japonica

為了更直觀地比較不同條件下所得海帶發(fā)酵前后所產(chǎn)生的VOCs 間的差異，對發(fā)酵前后的海帶樣品GC-IMS 譜圖中的風(fēng)味特征峰進(jìn)行選取，根據(jù)VOCs 保留時間及遷移時間對其進(jìn)行定性分析，通過軟件內(nèi)置的NIST GC 數(shù)據(jù)庫及G.A.S 的IMS 數(shù)據(jù)庫，確定了33 種VOCs，其中濃度較高的物質(zhì)會產(chǎn)生二聚體。根據(jù)VOCs 的CAS 號，可通過網(wǎng)站The Good Scents Company Information System（http://www.thegoodscentscompany.com/）確定其風(fēng)味描述，以便更好地比較不同發(fā)酵條件對海帶VOCs 所產(chǎn)生的影響。

2.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)（VOCs）分析

通過GC-IMS 自帶的LAV 軟件建立海帶發(fā)酵前后VOCs 的指紋圖譜（圖2），圖譜每一行代表一個樣品中選取的全部信號峰，每一列代表同一揮發(fā)性有機(jī)物在不同樣品中的信號強(qiáng)度，每個樣品平行測定3 次，顏色越深表示物質(zhì)含量越高[18]。從指紋圖譜中可以看出每種樣品的完整揮發(fā)性有機(jī)物信息以及樣品之間揮發(fā)性有機(jī)物的差異。

圖2 不同條件下發(fā)酵海帶的指紋圖譜Fig.2 Fingerprints of fermented Laminaria japonica under the different conditions

由圖2 可知，利用GC-IMS 在發(fā)酵海帶樣品可分離出47 個特征峰，定性后得到33 種VOCs，其中13 種VOCs 的含量較高，在分離時不但有單體的存在，還因其高含量產(chǎn)生二聚體，如表1 所示。海帶發(fā)酵前后所產(chǎn)生的VOCs 共有7 大類，其中包括10 種醛類化合物、10 種醇類化合物、6 種酮類化合物、2 種羧酸類化合物、3 種酯類化合物、1 種醚類化合物和1 種芳香族化合物。由于烷烴物質(zhì)的質(zhì)子親和力低于水，無法捕獲水合質(zhì)子的氫離子，因此GCIMS 無法檢測烷烴物質(zhì)。對比指紋圖譜中VOCs 的峰強(qiáng)度，發(fā)酵后海帶樣品中VOCs 含量相對發(fā)酵前樣品變化顯著，大部分VOCs 在發(fā)酵后含量增加，部分化合物在含有酵母菌條件下發(fā)酵后含量降低。由圖2 可知，A 區(qū)域所示為乳酸菌發(fā)酵海帶特征VOCs，而B 區(qū)域所示為酵母菌發(fā)酵海帶特征VOCs。

由圖2 結(jié)合表1 可知，3-辛酮在所有發(fā)酵前后海帶樣品中含量基本不變；乙酸乙酯、3-戊酮、2-丁酮、己醛、庚醛、戊醛、戊醇、2-甲基丙醇、2-丙醇這幾種VOCs，在只有乳酸菌發(fā)酵后含量基本不變，但在酵母菌發(fā)酵后，含量明顯降低；而辛醛、2，3-丁二醇、2-甲基-1-丁醇、正庚醇、2，3-戊二酮這幾種VOCs，在乳酸菌發(fā)酵后含量基本不變，但酵母菌發(fā)酵后含量明顯升高；乳酸菌發(fā)酵后，海帶樣品中反式-2-庚醛、正丁醇、丙酸含量均有所增加；不論是乳酸菌發(fā)酵還是酵母菌發(fā)酵，海帶樣品中苯甲醛、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、正己醇、1-辛烯-3-醇、3-戊酮、丁酸、乙二醇二甲醚含量均有所升高；而2-庚酮在只含酵母菌的發(fā)酵海帶中含量升高。

表1 發(fā)酵海帶揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的定性分析Table 1 Volatile compounds identified in fermented Laminaria japonica

續(xù)表 1

據(jù)統(tǒng)計(jì)，海帶中的醛類含量最高，由GC-IMS 譜圖也可以看出，醛類物質(zhì)的特征峰顏色較深，表明其含量較高。在發(fā)酵前后的海帶樣品中，共確定了10 種醛類物質(zhì)。發(fā)酵后，苯甲醛、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛含量均有所升高；乳酸菌發(fā)酵后，反式-2-庚醛含量升高；而酵母菌發(fā)酵后，己醛、庚醛、戊醛含量降低，辛醛含量升高。國內(nèi)外相關(guān)研究表明，己醛和丁醛是黑海褐藻和紅藻中最豐富的的醛類[22]，而三水壇紫菜中己醛含量較高，可產(chǎn)生腥味[23]；醛的鏈長主要影響氣味閾值和氣味特性，低分子量（<150 Da）的醛往往會產(chǎn)生難聞的氣味[19]，而高分子量的醛則具有甜味、水果味[24]；海藻中的短鏈醛（C6～C9）和中鏈醛（C10）是由海藻中的脂肪酸（C20）形成的，而長鏈醛（C15～C17）是由脂肪酸通過形成相應(yīng)的2-氫過氧酸進(jìn)而形成的[25]；羰基化合物和醛是造成各種氣味的原因，例如乙醛的堅(jiān)果味[26]和苯甲醛的杏仁味[27]；直鏈和支鏈醛通常提供青草和刺鼻的風(fēng)味，而不飽和醛則與蔬菜和魚腥味有關(guān)[28]。有研究表明，魚類中五種關(guān)鍵化合物，包括己醛、庚醛、壬醛、1-辛烯-3-醇和2,4-庚二烯醛具有腥味[20,,29]。本研究中，低分子量醛如己醛、庚醛和戊醛在酵母菌發(fā)酵后含量降低，可能在降低海帶的腥味、提高海帶的風(fēng)味中起主要作用。

2.3 PCA 分析

主成分分析（principal component analysis，PCA），是一種多元統(tǒng)計(jì)方法，是通過正交變換，將一組可能存在相關(guān)性的多個變量降維轉(zhuǎn)換成一組線性不相關(guān)的、少數(shù)幾項(xiàng)具有代表性的變量，轉(zhuǎn)換后的變量叫做主成分[30]。當(dāng)累計(jì)貢獻(xiàn)率超過80%時，通常認(rèn)為基本包含樣品的信息。圖3 表示對選取的GC-IMS 特征峰（峰強(qiáng)）作為其特征變量，進(jìn)行主成分分析，圖中橫坐標(biāo)軸PC1 和縱坐標(biāo)軸PC2 分別表示PCA 分析后各主成分的貢獻(xiàn)率。其中第一主成分（PC1）的貢獻(xiàn)率為66.36%，第二主成分（PC2）的貢獻(xiàn)率為20.23%，前兩個主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為86.58%，說明這兩個主成分基本可以反映出發(fā)酵海帶樣品的絕大部分特征。從圖3 可以看出，PCA 可將不同條件下發(fā)酵的海帶樣品根據(jù)其菌種不同區(qū)分開，且相互之間沒有明顯的重疊區(qū)域，說明不同發(fā)酵條件下的海帶樣品得到了很好的區(qū)分。

圖3 不同條件下發(fā)酵海帶樣品的主成分分析圖Fig.3 Principal component analysis of fermented Laminaria japonica under the different conditions

3 結(jié)論

本研究首次利用GC-IMS 聯(lián)用技術(shù)探究發(fā)酵海帶的風(fēng)味變化，無需復(fù)雜的前處理及萃取過程，充分利用了GC 高分離效率和IMS 高靈敏度的優(yōu)勢，將數(shù)據(jù)以可視化的形式呈現(xiàn)在譜圖中，更直觀地展現(xiàn)出樣品間的差異。根據(jù)GC-IMS 數(shù)據(jù)庫，對分離出的VOCs 進(jìn)行二維定性，并首次建立了發(fā)酵海帶風(fēng)味物質(zhì)的指紋圖譜與定性表格。定性結(jié)果顯示，發(fā)酵海帶樣品中共分離出33 種揮發(fā)性物質(zhì)，包括醛類、醇類、酮類、酯類、醚類和芳香族化合物，以醛類物質(zhì)為主，其中己醛、庚醛、戊醛等小分子量醛在酵母菌發(fā)酵后含量明顯降低；指紋圖譜結(jié)果表明，海帶在不同發(fā)酵條件下所產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)差異明顯，因此可根據(jù)未知樣品的特征VOCs 類型及其含量判斷發(fā)酵菌種；PCA 結(jié)果顯示，第一主成分和第二主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率可達(dá)到86%，表明選取的特征風(fēng)味峰信息關(guān)鍵有效，且不同條件的樣品可得到明顯的區(qū)分。GCIMS 分析結(jié)果表明，對比分析不同發(fā)酵條件樣品的揮發(fā)性有機(jī)物特征信息用于區(qū)分發(fā)酵菌種、識別發(fā)酵條件的方法是可行的。但由于GC-IMS 技術(shù)起步較晚，手段較新，IMS 數(shù)據(jù)庫不夠完善，部分VOCs無法進(jìn)行定性，后期可將無法定性的VOCs 用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或其他手段進(jìn)行驗(yàn)證，豐富海帶發(fā)酵領(lǐng)域的VOCs 數(shù)據(jù)庫。

本研究通過探究不同菌種發(fā)酵過程對海帶風(fēng)味的影響，表明發(fā)酵是降低海帶腥味、改善海帶食品風(fēng)味的有效加工方式，這為新型發(fā)酵海帶產(chǎn)品的開發(fā)提供了思路。后期將進(jìn)一步探索發(fā)酵機(jī)制，為發(fā)酵海帶產(chǎn)品的開發(fā)提供更多的理論依據(jù)。