郭彬彬，郭 滿(mǎn)，劉 明，張 浩

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院研究生處，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.南陽(yáng)市中心醫(yī)院乳腺外科，河南 南陽(yáng) 473000；3.南陽(yáng)市中心醫(yī)院疼痛科，河南 南陽(yáng) 473000）

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）約占所有乳腺癌的15.0%～20.0%［1］，其發(fā)病年齡較非三陰性乳腺癌（non-triple-negative breast cancer，N-TNBC患者）更趨年輕化［2］，且侵襲性更強(qiáng)，易發(fā)生肝、腦轉(zhuǎn)移。TNBC患者由于缺乏雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）及人表皮生長(zhǎng)因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）的表達(dá)，因此內(nèi)分泌治療以及抗HER-2靶向治療對(duì)其無(wú)效，化學(xué)治療是唯一推薦的改善疾病結(jié)局的治療方法，但易出現(xiàn)耐藥［3］。已發(fā)生轉(zhuǎn)移的TNBC患者的中位生存期僅為1 a，遠(yuǎn)低于N-TNBC患者［4］。扭曲蛋白（Twist）是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過(guò)程的重要驅(qū)動(dòng)因子［5］，波形蛋白（vimentin）是EMT進(jìn)程中的標(biāo)志性分子。EMT過(guò)程中上皮細(xì)胞間黏附性減弱、失去極性，基底膜降解，細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)，細(xì)胞骨架、形態(tài)及運(yùn)動(dòng)能力發(fā)生改變，使腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲能力增高。血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）通過(guò)腫瘤細(xì)胞自身變形和細(xì)胞外基質(zhì)重塑構(gòu)成血管樣結(jié)構(gòu)，覆蓋VM通道的腫瘤細(xì)胞表達(dá)一些內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物［6］，提示VM過(guò)程類(lèi)似于EMT，涉及從上皮特征到內(nèi)皮表型的轉(zhuǎn)變。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)Twist、vimentin、VM在TNBC組織中的表達(dá)，并結(jié)合臨床病理特征及三者之間的相關(guān)性，初步探討TNBC中EMT與VM的關(guān)系，為尋找TNBC的治療新靶點(diǎn)及預(yù)后預(yù)測(cè)因子提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2013年1月至2015年12月南陽(yáng)市中心醫(yī)院收治的TNBC患者為研究對(duì)象（觀察組）。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理活檢確診為T(mén)NBC；（2）既往未接受過(guò)手術(shù)治療、放射治療及化學(xué)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）雙側(cè)乳腺癌；（2）合并其他臟器功能障礙；（3）合并炎性乳腺癌或其他部位惡性腫瘤。本研究共納入120例TNBC女性患者，年齡28～76（51.86±9.07）歲，＞45歲87例，≤45歲33例；腫瘤直徑T分期：T0～T1期49例，T2期68例，T3期3例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移72例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期共96例，Ⅲ期24例。另選擇同期因乳腺良性疾病行手術(shù)治療的30例患者為對(duì)照組，患者均為女性，其中乳腺纖維腺瘤19例，乳腺增生癥11例；年齡30～67（46.37±10.14）歲。2組受試者年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)南陽(yáng)市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并取得患者知情同意。

1.2 主要試劑與儀器兔抗人Twist多克隆抗體及抗體稀釋液、過(guò)碘酸-希夫（periodic acid-Schiff stain，PAS）染色液試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，兔抗人vimentin單克隆抗體購(gòu)自鄭州賽諾特生物技術(shù)有限公司；2235型石蠟切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)徠卡公司，光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)TNBC組織及乳腺良性病變組織中Twist、vimentin表達(dá)取手術(shù)切除的觀察患者癌組織和對(duì)照組患者良性病變組織，用體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，3μm連續(xù)切片，將切片置入60℃恒溫箱中烘烤2 h，然后二甲苯浸泡15 min，更換二甲苯后再浸泡15 min，遞減梯度乙醇脫去二甲苯并水化（無(wú)水乙醇、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、體積分?jǐn)?shù)75%乙醇、三蒸水），枸櫞酸鈉緩沖液（pH＝6.0）高壓抗壓修復(fù)，滴加體積分?jǐn)?shù)3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育20 min；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗，滴加一抗，置于濕盒中室溫孵育2 h，PBS沖洗，室溫下滴加二抗，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蒸餾水沖洗，蘇木精復(fù)染，蒸餾水沖洗返藍(lán)，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡觀察著色情況。以PBS代替一抗做陰性對(duì)照。兔抗人vimentin多克隆抗體采用即用型工作液，兔抗人Twist多克隆抗體采用濃縮型抗體1∶500倍稀釋。

1.4 CD31及PAS雙重染色法檢測(cè)TNBC組織及乳腺良性病變組織中VM表達(dá)取手術(shù)切除癌組織和乳腺良性病變組織，用體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，3μm連續(xù)切片，將切片置入60℃恒溫箱中烘烤2 h，然后置于二甲苯中浸泡15 min，更換二甲苯后再浸泡15 min，遞減梯度乙醇脫去二甲苯并水化（無(wú)水乙醇、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、體積分?jǐn)?shù)75%乙醇、三蒸水），枸櫞酸鈉緩沖液（pH＝6.0）高壓抗壓修復(fù)；滴加體積分?jǐn)?shù)3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育20 min，PBS沖洗，滴加一抗（鼠抗人CD31單克隆抗體），置于濕盒中室溫孵育2 h，PBS沖洗，室溫下滴加二抗，DAB顯色，待血管內(nèi)皮細(xì)胞著色后，終止染色，將切片置于過(guò)碘酸溶液中反應(yīng)10 min，蒸餾水沖洗，置于希夫液中，避光反應(yīng)15 min；蒸餾水沖洗，蘇木精復(fù)染，蒸餾水沖洗返藍(lán)，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡觀察有無(wú)VM。

1.5 結(jié)果判讀Twist以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，vimentin以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。按半定量積分法判斷Twist、vimentin表達(dá)情況，根據(jù)染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞所占比例計(jì)分：無(wú)著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞所占比例＜15%為0分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例15%～25%為1分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例26%～50%為2分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例51%～75%為3分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例＞75%為4分。將著色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分相加，總分＜4分為陰性表達(dá)，≥4分為陽(yáng)性表達(dá)。VM以切片染色中出現(xiàn)櫻桃紅色管道，內(nèi)壁無(wú)血管內(nèi)皮細(xì)胞襯附，管道中有紅細(xì)胞為陽(yáng)性表達(dá)，否則為陰性表達(dá)。所有切片均由2位病理科醫(yī)師獨(dú)立判讀，若結(jié)果存在差異則請(qǐng)第3位病理科診斷醫(yī)師進(jìn)行復(fù)核。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher′s精確概率法檢驗(yàn)；等級(jí)資料比較采用秩和檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析；采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Twist、vimentin、VM在TNBC組織和乳腺良性病變組織中的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖1。Twist、vimentin、VM在TNBC組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別為60.8%、25.0%、28.3%，在乳腺良性病變組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為分別13.3%、6.7%、0.0%（未檢測(cè)到表達(dá)）；Twist、vimentin、VM在TNBC組織中陽(yáng)性表達(dá)率均高于乳腺良性病變組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝21.675、4.807、10.991，P＜0.05）。

圖1 TNBC及乳腺良性病變組織中Twist、vimentin、VM的表達(dá)Fig.1 Expression of Twist，vimentin and VM in TNBC tissues and lesion tissues of breast benign disease

2.2 Twist、Vimentin、VM與TNBC患者臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性結(jié)果見(jiàn)表1。TNBC組織中Twist的表達(dá)與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)（P＜0.05），與患者的年齡、腫瘤直徑、是否絕經(jīng)無(wú)關(guān)（P＞0.05）；vimentin、VM的表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)（P＜0.05），與患者的年齡、是否絕經(jīng)無(wú)關(guān)（P＞0.05）。

表1 Twist、vimentin、VM的表達(dá)與TNBC患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between the expressions of Twist，vimentin，VM and the clinicopathological characteristics of TNBC patients

2.3 TNBC中Twist、vimentin、VM表達(dá)的相關(guān)性TNBC患者癌組織中VM的表達(dá)與Twist、vimentin呈正相關(guān)（r＝0.277、0.363，P＜0.05），Twist的表達(dá)與vimentin呈正相關(guān)（r＝0.384，P＜0.05）。

2.4 Twist、vimentin、VM表達(dá)與患者預(yù)后關(guān)系結(jié)果見(jiàn)圖2、3、4、5。120例TNBC患者隨訪9～83個(gè)月，平均隨訪55個(gè)月，生存率為70.8%（85／120）。Twist、vimentin、VM陽(yáng)性表達(dá)患者的生存時(shí)間均顯著短于陰性表達(dá)患者（χ2＝9.490、22.940、10.820，P＜0.05）。Twist、vimentin、VM均呈陽(yáng)性表達(dá)患者的生存率僅為29.4%（5／17），三者不全呈陽(yáng)性表達(dá)患者的生存率為77.7%（80／108）；Twist、vimentin、VM三者均呈陽(yáng)性表達(dá)患者的生存率顯著低于三者不全呈陽(yáng)性表達(dá)患者（χ2＝44.620，P＜0.05）。

圖2 TNBC組織中Twist陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)患者的生存時(shí)間Fig.2 Survival time of patients with Twist positive expression and Twist negative expression in TNBC tissues

圖3 TNBC組織中vimentin陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)患者的生存時(shí)間Fig.3 Survival time of patients with vimentin positive expression and viment in negative expression in TNBC tissues

圖4 TNBC組織中VM陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)患者的生存時(shí)間Fig.4 Survival time of patients with VM positive expression and VM negative expression in TNBC tissues

圖5 TNBC組織中Twist、vimentin、VM表達(dá)均陽(yáng)性患者和非均陽(yáng)性表達(dá)患者的生存時(shí)間Fig.5 Survival time of patients with Twist，vimentin，VM positive expression and non-full positive expression in TNBC tissues

3 討論

TNBC是一種異質(zhì)性腫瘤，其對(duì)化學(xué)治療有較高的反應(yīng)性，但TNBC患者整體生存及預(yù)后較差。血管生成被認(rèn)為是影響乳腺癌患者生存的不良預(yù)后因素，但針對(duì)血管生成過(guò)程中關(guān)鍵激酶的抗血管生成療法未能明顯改善患者的復(fù)發(fā)及預(yù)后。VM現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)解釋了傳統(tǒng)抗血管療法失敗的原因，使人們認(rèn)識(shí)到腫瘤存在另一種不依賴(lài)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的血液供應(yīng)模式［7-8］。有研究發(fā)現(xiàn)，相較于ER、PR、HER-2表達(dá)陽(yáng)性的乳腺癌，VM現(xiàn)象在TNBC中更為常見(jiàn)［9］，或與其易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及耐藥不良生物學(xué)行為相關(guān)。Twist是誘導(dǎo)EMT的主要調(diào)控因子之一，對(duì)EMT過(guò)程的維持具有重要意義［10］。EMT被認(rèn)為是癌癥進(jìn)展的核心組成部分［11］，在此過(guò)程中，上皮細(xì)胞的黏附力降低，而作為間質(zhì)標(biāo)志物的vimentin被上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞遷移或轉(zhuǎn)移至不同的器官［12］。LIANG等［13］研究發(fā)現(xiàn)，敲除MDA-MB-231細(xì)胞中的ZEB1因子后，vimentin表達(dá)下調(diào)，EMT被逆轉(zhuǎn)，VM被抑制。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Twist、vimentin在TNBC組織中的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期顯著相關(guān)。且Twist與vimentin的表達(dá)存在正相關(guān)性，推測(cè)在TNBC發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，腫瘤局部微環(huán)境發(fā)生改變，進(jìn)而激活Twist的表達(dá)，使vimentin上調(diào)［3］，誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。WAY等［14］研究發(fā)現(xiàn)，利用大黃素直接抑制頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中Twist的表達(dá)，可引起vimentin mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)，與本研究結(jié)果相一致。在本研究中，VM在TNBC組織中的高表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)，且與Twist、vimentin表達(dá)呈正相關(guān)，這些結(jié)果說(shuō)明Twist可促進(jìn)間質(zhì)標(biāo)志物vimentin的表達(dá)，誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，使腫瘤細(xì)胞之間的黏附性下降，加速TNBC細(xì)胞的變形，從而促進(jìn)VM的形成，以獲得所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣供應(yīng)，加快TNBC的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及耐藥，與TNBC惡性程度相關(guān)。TAO等［15］在對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA TP73-AS1可以使Twist過(guò)表達(dá)，從而參與EMT，刺激VM的形成，該研究從細(xì)胞層面印證了本研究的結(jié)果。

本研究經(jīng)平均55個(gè)月的隨訪發(fā)現(xiàn)，Twist、vimentin、VM陽(yáng)性表達(dá)患者的生存期顯著短于陰性表達(dá)患者，尤其是三者表達(dá)均為陽(yáng)性的TNBC患者生存率僅為29.4%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于TNBC總體生存率70.8%。因此，Twist、vimentin、VM的表達(dá)與TNBC的易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及耐藥等不良生物學(xué)行為相關(guān)，提示TNBC患者不良預(yù)后。

綜上所述，Twist、vimentin和VM在TNBC組織中的表達(dá)高于乳腺良性病變組織，且三者表達(dá)呈顯著正相關(guān)性，推測(cè)Twist可能通過(guò)調(diào)控vimentin的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)EMT，促進(jìn)TNBC中VM現(xiàn)象的出現(xiàn)，從而介導(dǎo)TNBC細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥等病理現(xiàn)象的發(fā)生。另外，Twist、vimentin、VM表達(dá)陽(yáng)性患者的生存時(shí)間顯著短于表達(dá)陰性患者，提示檢測(cè)Twist、vimentin、VM的表達(dá)對(duì)評(píng)估TNBC患者的預(yù)后可能具有指導(dǎo)意義?？傊?，本研究為T(mén)NBC潛在治療靶點(diǎn)及預(yù)后預(yù)測(cè)分子的研究提供了線索和基礎(chǔ)，但涉及的相關(guān)通路及分子機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究來(lái)證實(shí)。