高 萌，辛菲菲，王瑞雪，趙燕磊，張懷淵，張 瑤

山東理工大學(xué) 農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院 (淄博 255000)

卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)，接合菌綱毛霉科毛霉屬，通過孢子和接合子進(jìn)行繁殖[1]，因其具有高產(chǎn)油能力而被關(guān)注，特別是其油脂中含有的γ-亞麻酸(GLA)使其具有重要的經(jīng)濟(jì)價值[2]，卷枝毛霉已經(jīng)被作為研究絲狀真菌脂質(zhì)積累機(jī)制的模式生物。本實(shí)驗(yàn)室篩選到一株野生型高產(chǎn)油卷枝毛霉菌株WJ11，其油脂產(chǎn)量能夠達(dá)到細(xì)胞干重的36%，卷枝毛霉基因組學(xué)、蛋白組學(xué)和酶學(xué)已經(jīng)被深入研究以探索脂質(zhì)積累機(jī)制[3]。

酯酰基硫酯酶(thioesterase,TE)起到終止脂肪酸鏈繼續(xù)延長的作用，水解脂?；?S-?；d體蛋白(acyl-ACP)的硫酯鍵，釋放游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)[4]。各種各樣的硫酯酶使多種底物中硫酯鍵的裂解而發(fā)揮各種重要的生物功能[5]，因此產(chǎn)油微生物中的硫酯酶基因常被遺傳改造以提高脂肪酸產(chǎn)量[6]。?；鞍琢蝓ッ?Acyl-protein thioesterase,APT)就是另一類硫酯酶，也稱溶血磷脂酶和羧酸酯酶，在硫酯酶家族中被稱作TE21硫酯酶，水解蛋白質(zhì)上的半胱氨酸(Cys)殘基和?；溨g的硫酯鍵，它們存在著一個經(jīng)典的α/β水解酶結(jié)構(gòu)域[7]。人類APT1和APT2為最典型的TE21硫酯酶，與棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶共同作用，調(diào)節(jié)棕櫚酰化蛋白的細(xì)胞表面表達(dá)、生長相關(guān)蛋白和受鈣離子激活的鉀離子通道，通常定位在高爾基體[8]。

卷枝毛霉WJ11的基因組中有一個APT硫酯酶(evm.model.scaffold00021.24，TE21)基因，本實(shí)驗(yàn)旨在通過基因操作過表達(dá)卷枝毛霉WJ11的te21基因，重組菌種經(jīng)發(fā)酵罐培養(yǎng)后測定脂質(zhì)組成和總脂肪酸含量，來探究TE21在卷枝毛霉WJ11脂肪酸合成與代謝中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種

菌種為卷枝毛霉M65，是野生型卷枝毛霉WJ11的尿嘧啶缺陷型；構(gòu)建表達(dá)載體所用大腸桿菌DH5α和質(zhì)粒pMAT2075均保藏于本實(shí)驗(yàn)室[9]。

1.1.2試劑

Trizol試劑，購自生工生物工程(上海)有限公司；Plasmid Mini Kit I試劑盒，購自美國Omega 生物科技公司；qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒，購自上海翊圣生物科技有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基

大腸桿菌培養(yǎng)基采用LB培養(yǎng)基[3]，抗生素為氨芐青霉素(Ampicillin,Amp)；轉(zhuǎn)化所用的培養(yǎng)基YPG、MMCS、YPGS等參照趙利娜等[3]方法配制；實(shí)驗(yàn)所用的種子培養(yǎng)基為K&R培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基為改良的K&R培養(yǎng)基[10]。

1.2 方法

1.2.1pMAT2075-te21表達(dá)載體的構(gòu)建

用Trizol提取卷枝毛霉WJ11的基因組總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，利用te21的引物(上游引物F1：ATGTCTCTTACTTCTGTTGTAG，下游引物R1：TTAGATGGAAGGGATTGTCT)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物凝膠電泳后膠回收，將基因片段和空質(zhì)粒pMAT2075用XhoI和NheI酶切，用T4連接酶于16 ℃過夜連接后，熱擊轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選獲得大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，測序驗(yàn)證，得到pMAT2075-te21，于-80 ℃甘油管中保菌。

1.2.2卷枝毛霉WJ11的轉(zhuǎn)化

用Plasmid Mini Kit I提取pMAT2075-te21質(zhì)粒，加入SmaⅠ及AatⅡ酶切過夜，凝膠電泳驗(yàn)證后純化得到目的基因的片段。轉(zhuǎn)化所用的菌種為卷枝毛霉M65，方法參照趙利娜等[3]。

1.2.3卷枝毛霉轉(zhuǎn)化子的篩選

過表達(dá)通過同源重組的方式導(dǎo)入卷枝毛霉基因組中，經(jīng)過多代篩選直到在篩選培養(yǎng)基與全營養(yǎng)培養(yǎng)基上長出相同數(shù)量的單菌落，提取轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，PCR驗(yàn)證，引物為F2:GATAAGCATAAACCAGATCTGC R2:GTATCTGACATAGTCGAGCTTC。

1.2.4重組菌種發(fā)酵培養(yǎng)

搖瓶培養(yǎng)方法與條件參考趙利娜[3]等，在發(fā)酵的48 h和96 h取樣。1.5 L發(fā)酵罐裝液量為1 L，接種量為10%，轉(zhuǎn)速為700 r/min，pH為6.0(2 mol/L NaOH調(diào)節(jié))，溫度為28 ℃，通氣量為2 L/(L·min)，發(fā)酵時間為96 h，在發(fā)酵的12 h、24 h、36 h、48 h、72 h、96 h取樣。取樣量為20 mL，用于轉(zhuǎn)錄分析，生物量和油脂分析。濾液用于測定培養(yǎng)基中殘余的葡萄糖和NH4+。葡萄糖濃度采用還原糖生物傳感分析儀(SBA-40E，濟(jì)南柏盛)測定，NH4+采用靛酚藍(lán)比色法[11]。

1.2.5熒光定量PCR測定TE21的mRNA表達(dá)水平

熒光定量PCR的反轉(zhuǎn)錄方法同1.2.1，然后用qPCR SYBR Green Master Mix進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，熒光PCR儀型號為LightCycler 96(Roche)，PCR反應(yīng)程序參照說明。mRNA的相對表達(dá)量使用2-ΔΔCt法分析。

1.2.6薄層層析色譜(TLC)測定脂質(zhì)組成

脂質(zhì)組成測定采用TLC方法參照鮑方宇[12]等。采用灰度掃描計(jì)算各組分比例。用刀片刮下顯色后的條帶，經(jīng)10%鹽酸甲醇甲酯化后用氣相色譜(GC,Agilent 7890B)測定其脂肪酸組成，程序參考Khan等[10]。

1.2.7脂肪酸的提取及測定

油脂提取采用氯仿-甲醇方法，參考唐鑫[11]等的實(shí)驗(yàn)方法。脂肪酸組成的測定方法同1.2.6。

2 結(jié)果與討論

2.1 過表達(dá)TE21卷枝毛霉菌株的構(gòu)建

卷枝毛霉轉(zhuǎn)化時以片段化的空載體作為陰性對照，得到對照菌株Mc-2075和陽性轉(zhuǎn)化子Mc-TE21。提取轉(zhuǎn)化子基因組為模板，對照組Mc-2075經(jīng)PCR擴(kuò)增后為約5 361 bp，而陽性轉(zhuǎn)化子Mc-TE21為6 051 bp的條帶，經(jīng)電泳后可以看出Mc-2075的條帶在6 000 bp以下，Mc-TE21在6 000 bp上方(圖1)，證實(shí)TE21基因已經(jīng)整合在卷枝毛霉基因組上。

注：M(Marker)為核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為Mc-2075；2和3為Mc-TE21轉(zhuǎn)化子。圖1 轉(zhuǎn)化子PCR凝膠電泳圖

2.2 搖瓶中TE21過表達(dá)對卷枝毛霉脂肪酸含量的影響

挑選出3個卷枝毛霉轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵時長為96 h，3個轉(zhuǎn)化子的生長狀況與對照組Mc-2075并無差異(圖2)，這意味著過表達(dá)TE21基因?qū)碇γ共⑽磽p傷，測定96 h時脂肪酸含量，結(jié)果顯示3個轉(zhuǎn)化子的總脂肪酸含量均高于對照組(圖3)，脂肪酸含量最高的是Mc-TE21-3，達(dá)到細(xì)胞干重的27.1%，選取Mc-TE21-3進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)以準(zhǔn)確測定其對卷枝毛霉脂質(zhì)積累的影響。此結(jié)果說明TE21同酯?；蝓ッ敢粯右材艽龠M(jìn)對產(chǎn)油生物的脂質(zhì)積累[13]。

圖2 轉(zhuǎn)化子在搖瓶中發(fā)酵的生物量

圖3 轉(zhuǎn)化子在搖瓶中發(fā)酵的脂肪酸含量

2.3 發(fā)酵罐中TE21過表達(dá)對卷枝毛霉脂質(zhì)的影響

2.3.1TE21過表達(dá)對mRNA表達(dá)水平的影響

TE21基因是卷枝毛霉WJ11的內(nèi)源基因，熒光定量PCR用于檢測TE21過表達(dá)對其轉(zhuǎn)錄水平的影響。重組菌種Mc-TE21-3和對照菌種在經(jīng)過發(fā)酵罐培養(yǎng)后，6 h、24 h、72 h、96 h取樣測定TE21的mRNA的表達(dá)量。與Mc-2075相比，Mc-TE21-3中TE21 mRNA的表達(dá)水平顯著提高，特別是在24 h和72 h時，TE21的mRNA表達(dá)水平分別提高26.7倍和24.3倍(圖4)，說明TE21基因經(jīng)過遺傳改造后其轉(zhuǎn)錄水平明顯增強(qiáng)。

圖4 對照組Mc-2075與Mc-TE21-3中TE21相對表達(dá)量

2.3.2發(fā)酵罐中生物量、殘余葡萄糖和NH4+濃度的變化

轉(zhuǎn)化子在發(fā)酵罐中培養(yǎng)時，葡萄糖和NH4+均被快速消耗，在12 h NH4+時被耗盡，此時卷枝毛霉開始將培養(yǎng)基中的葡萄糖轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)儲存于細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)脂肪酸含量逐漸增加。與Mc-2075相比，Mc-TE21-3的葡萄糖消耗速率稍微降低(圖5a)，而對NH4+的消耗速率幾乎沒有差別(圖5b)。卷枝毛霉菌種生物量隨著發(fā)酵時間的逐漸增加，而TE21過表達(dá)導(dǎo)致生物量稍有下降，在96 h時，Mc-2075的生物量為18.4 g/L，而Mc-TE21-3的生物量為15.8 g/L，生物量降低了14.13%。

圖5 Mc-2075和Mc-TE21-3在1.5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵時指標(biāo)的變化

2.3.3過表達(dá)TE21對卷枝毛霉脂質(zhì)的影響

12 h時氮源耗盡后細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)開始快速積累[3]，12～48 h之間細(xì)胞生長和脂肪酸合成的快速時期(圖5c)，48 h后總脂肪酸積累速度逐漸放緩并趨于穩(wěn)定，與對照菌種相比，過表達(dá)TE21使得脂肪酸含量顯著提高，在96 h時Mc-2075的脂肪酸含量為(25.9±1.4)%，Mc-TE21-3脂肪酸總量達(dá)到(30.0±1.4)%，整體高于Mc-2075(圖5d)。TE21過表達(dá)對卷枝毛霉脂肪酸組成并沒有影響(表1)。

表1 發(fā)酵罐中卷枝毛霉重組菌種的脂肪酸組成 %

TLC中各種物質(zhì)在薄層硅膠板上移動的距離隨在展開劑中的遷移率(Rf)的不同而變化，甘油三酯(TAG)、FFA、1，3-甘油二酯(1,3-DAG)、1，2-甘油二酯(1,2-DAG)及甘油單酯(MAG)的極性依次增大，而離開原點(diǎn)的距離依次減少[13](圖6)。在TLC硅膠板顯色處理后發(fā)現(xiàn)，卷枝毛霉的脂質(zhì)產(chǎn)物中TAG所占總脂質(zhì)含量的比例最多，在Mc-2075和Mc-TE21-3中的比例分別為67.8%和62.2%。而Mc-TE21-3的FFA、1,3-DAG和1,2-DAG均有不同程度的提高，尤其是FFA，達(dá)到脂質(zhì)組成的18.1%，與Mc-2075中FFA相比，提高了29.1%(圖7)。

圖6 Mc-2075與Mc-TE-3的脂質(zhì)在薄層層析硅膠板顯色

圖7 Mc-2075與Mc-TE-3的脂質(zhì)組成比例

在卷枝毛霉脂質(zhì)組分的脂肪酸組成中，Mc-TE21-3與Mc-2075的TAG和MAG的脂肪酸組成沒有明顯差異，而過表達(dá)TE21對FFA、1,3-DAG和1,2-DAG的脂肪酸組成有較大的影響。在FFA脂肪酸組成中，過表達(dá)TE21顯著提高了C16∶1的比例，而降低了C18∶1和C18∶2的比例，說明TE21對C16∶1有一定的偏好性，而不親和C18∶1和C18∶2(表2)。對1,3-DAG和1,2-DAG脂肪酸組成的影響與FFA的結(jié)果類似。

表2 Mc-2075和Mc-TE21-3脂質(zhì)中各組分脂肪酸組成 %

3 結(jié)論

APT屬于硫酯酶家族中的硫酯酶TE21，其生理功能是水解脂?；?S-酰基載體蛋白的硫酯鍵，釋放FFA，起到催化脂肪酸鏈的終止作用。本研究通過過表達(dá)卷枝毛霉的TE21，使實(shí)驗(yàn)菌株Mc-TE21-3的脂肪酸含量達(dá)到細(xì)胞干重的30.0%，相比于Mc-2075的脂肪酸含量提高了15.9%，TE21過表達(dá)還導(dǎo)致了卷枝毛霉脂質(zhì)的組成，顯著提高了FFA的比例，且對FFA和DAG的脂肪酸組成有較大的影響。本研究證實(shí)TE21在卷枝毛霉中的生理功能，顯著提高了脂肪酸含量，豐富產(chǎn)油微生物脂肪酸合成路徑中關(guān)鍵酶的研究。