王艷妮，馬紅燕，王文山

(延安大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院；陜西省反應(yīng)工程重點實驗室，陜西 延安 716000)

柳氮磺吡啶(Sulfa sala zine，SSZ)是一種合成類藥物，主要用于潰腸性結(jié)腸炎、各種類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療，但是過量使用會出現(xiàn)頭痛、厭食、惡心、嘔吐等不良反應(yīng)[1]。因此，分析測定生物樣品中尿液和血液中SSZ的含量對人體的耐受量、吸收量、毒性和代謝具有很重要的醫(yī)學(xué)意義。目前關(guān)于SSZ含量的測定有高效液相色譜法(HPLC)[2，3]，毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用法(CE-MS)[4]，免疫吸附法[5]，電化學(xué)法[6，7]等，但以上方法都涉及復(fù)雜的樣品處理和儀器使用。熒光法也有報道，張犁黎等[8]以硫代乙酰胺(TAA)和CdSO4為原料合成CdSNPs，通過光譜研究實現(xiàn)了SSZ含量的測定，但CdSNPs的合成過程繁雜且鎘離子有毒不易操作。因此，建立一種快速、簡單、易操作的SSZ測定方法很重要。

碳量子點(CDs)作為納米材料家族的新成員，因具有穩(wěn)定的光學(xué)特性、獨(dú)特的熒光性、優(yōu)良的生物相容性以及細(xì)胞低毒性而被廣泛地應(yīng)用。隨著科研工作者的不斷努力，CDs的合成方法越來越多樣化，主要有水熱法，電化學(xué)法，微波法，激光消融法等，合成材料的選取也越來越趨于廉價和生態(tài)友好化。氮原子與碳原子大小相當(dāng)，使得氮原子成為CDs合成中最理想的摻雜元素，并且氮原子外層含有5個價電子和孤對電子，可提供多余的n電子，這使得CDs的應(yīng)用范圍更加廣泛[9]。本研究則采用微波法以TEA為碳源和氮源成功合成了水溶性碳量子點NCDs，并基于SSZ對NCDs有明顯的熒光猝滅作用，建立了定量測定SSZ的新方法，并探究了猝滅機(jī)理。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

FLSP920瞬態(tài)穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀(英國愛丁堡)；8453紫外-可見分光光度計(美國安捷倫)；F-4500熒光分光光度計(日本日立)；MM823LA6-NS微波爐。

SSZ標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0×10-3mol/L)：準(zhǔn)確稱取柳氮磺吡啶標(biāo)準(zhǔn)品0.0398 g，用0.2 mol/L的NaOH(1.0 mL)溶解后稀釋、定容至100 mL；B-R緩沖溶液(在100 mL濃度0.04 mol/L的混酸中(H3PO4-HAc-H3BO3)加入0.2 mol/L的NaOH溶液45 mL，pH=6.37)；三乙醇胺；所用試劑均為分析純，配置好后于冰箱4 ℃保存，實驗用水為超純水。

1.2 實驗方法

NCDs的合成：以TEA為原料，采用微波加熱的方法合成了含有碳、氮元素的NCDs。具體過程：吸量管量取10.00 mL的TEA于100 mL燒杯中，調(diào)節(jié)微波爐功率為800 kW，加熱10 min后溶液變成澄清的棕色，自然冷卻后在10000 rpm轉(zhuǎn)速下離心10 min，再用0.22 μm的微孔濾膜過濾除去大顆粒雜質(zhì)，最后用超純水稀釋50倍后作為工作液，備用。

SSZ的測定：25 ℃下，于5支25 mL比色管中分別加入1.50 mL的NCDs和1.00 mL的B-R緩沖液，一份做試劑空白，其余比色管加入不同濃度梯度的SSZ溶液，每次增加濃度為2 μmol/L。充分搖勻后，室溫下靜置20 min進(jìn)行測定。采用1 cm石英比色皿，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均為5.0 nm，以338 nm為最佳激發(fā)波長，掃描350～600 nm范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜圖。以SSZ的濃度為0作為參照組，熒光值記為F0，計算ΔF。

2 結(jié)果與討論

2.1 NCDs的表征

2.1.1 NCDs的熒光特征和壽命測定

碳量子點的發(fā)射峰位置和熒光強(qiáng)度會隨著激發(fā)波長的變化而變化，因此本實驗探究了不同激發(fā)波長對NCDs熒光強(qiáng)度的影響。從圖1得知該量子點也有明顯的激發(fā)依賴性，當(dāng)激發(fā)波長由300 nm逐漸增加到370 nm時，發(fā)射波長從363 nm紅移至410 nm，熒光強(qiáng)度也由強(qiáng)到弱發(fā)生了變化，可能是NCDs的粒徑大小和表面官能團(tuán)的不同引起的[10]。實驗最終選擇338 nm為最佳激發(fā)波長。

圖1 不同激發(fā)波長下NCDs的熒光光譜

利用FLSP920瞬態(tài)穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀測定了NCDs的熒光衰減曲線，通過Origin8擬合作圖(見圖2)，計算得NCDs的熒光壽命為6.13 ns，χ2=1.060，說明實驗數(shù)據(jù)可靠。

圖2 NCDs的熒光衰減曲線

2.1.2 NCDs的穩(wěn)定性和酸度影響

該方法合成的NCDs原液熒光強(qiáng)度較低，稀釋50倍后熒光信號值達(dá)到最大。20 d后NCDs的熒光信號逐漸減弱，可能因為NCDs表面的官能團(tuán)(-COOH或-OH)隨著時間的延長發(fā)生脫落，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。但最大發(fā)射峰位置沒有移動，說明量子點未發(fā)生團(tuán)聚，尺寸沒有太大改變。

當(dāng)溶液酸度由4.35上升至7.00時，NCDs的熒光信號值逐漸增強(qiáng)，當(dāng)溶液堿性繼續(xù)增強(qiáng)時，熒光信號值又緩慢降低?？赡苁侨跛嵝詶l件下NCDs表面的羧基以-COO-和-COOH形式存在，形成氫鍵后更有利于羧基修飾在碳量子點表面，彌補(bǔ)了碳量子點表面的非輻射中心，因此在弱酸性條件下NCDs的熒光強(qiáng)度會最強(qiáng)[11]。

2.2 SSZ的測定

2.2.1 熒光光譜圖

固定激發(fā)、發(fā)射波長分別為338 nm和410 nm，在室溫下掃描體系的熒光光譜圖如圖3所示。由圖可知，SSZ的加入使得NCDs最強(qiáng)熒光峰發(fā)生明顯的降低，且NCDs的熒光強(qiáng)度隨著SSZ濃度的增加而下降，說明SSZ和NCDs發(fā)生了結(jié)合反應(yīng)從而誘導(dǎo)其熒光猝滅。實驗發(fā)現(xiàn)SSZ在一定濃度范圍內(nèi)與體系的ΔF值呈良好的線性關(guān)系，因此可用于SSZ含量的測定。

圖3 隨SSZ濃度增加NCDs熒光猝滅圖(1-6：cssz=0，2，4，6，8，10 μmol/L)

2.2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化

該方法合成的碳量子點原溶液熒光強(qiáng)度較低，稀釋50倍后強(qiáng)度達(dá)到最大，以此作為工作液。實驗研究了不同用量NCDs對體系熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果表明：當(dāng)NCDs用量由0.5 mL增加至2.5 mL時(梯度為0.5 mL)體系的猝滅值也相應(yīng)增大，但是相對熒光強(qiáng)度變化不明顯，綜合考慮，本實驗選擇加入NCDs溶液1.50 mL。同時考察了酸堿度對體系的影響，結(jié)果表明在6.37的B-R緩沖液中SSZ-NCDs體系的猝滅程度最大，且最佳用量為1.00 mL。

2.2.3 共存物質(zhì)干擾

以相對誤差不高于±5%為限，研究了實驗過程和實際樣品中可能存在物質(zhì)的干擾情況。當(dāng)SSZ濃度為8 μmol/L時，1000倍的Mg2+、Na+、D-果糖、乳糖、淀粉、葡萄糖，250倍的SO42+、Al3+、Cl-，100倍的Cu2+、Mn2+和10倍的Fe3+不產(chǎn)生干擾。

2.2.4 檢出限、線性范圍和樣品測定

在優(yōu)化的條件下，SSZ溶液濃度在0.4～10 μmol/L范圍內(nèi)，濃度與熒光強(qiáng)度線性回歸方程為ΔF=31.1c(μmol/L)+4.54，R2為0.9942。對濃度為8 μmol/L的SSZ溶液平行測定5次，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.25%。根據(jù)IUPAC規(guī)定，以3S0/S計算，方法檢出限(S/N=3)為0.11 μmol/L。實驗抽取兩個廠家的柳氮磺吡啶片劑進(jìn)行測定，回收率為97.5%～103.1%。

2.3 機(jī)理討論

2.3.1 紫外可見吸收光譜

熒光猝滅類型一般分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，動態(tài)猝滅是熒光分子在激發(fā)態(tài)與猝滅劑發(fā)生相互作用，靜態(tài)猝滅則是熒光分子在基態(tài)與猝滅劑反應(yīng)生成新的配合物，由此熒光試劑的吸收光譜發(fā)生改變。選定NCDs和SSZ溶液的濃度，以B-R作參比，分別掃描NCDs，SSZ，NCDs+SSZ在200～600 nm范圍內(nèi)的吸收圖譜(見圖4)。單一NCDs在278 nm處有明顯吸收，SSZ加入后NCDs的吸光度略微增加，但吸收峰的位置沒有變化，則說明SSZ的加入對NCDs的結(jié)構(gòu)沒有產(chǎn)生影響，因此判斷為動態(tài)猝滅過程。

圖4 紫外吸收光譜圖

2.3.2 溫度的影響

根據(jù)斯特恩-沃爾默方程[12]：F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q]，固定NCDs的濃度掃描熒光光譜，得出不同SSZ濃度下的相對猝滅曲線。293 K下，方程為y=4.95×104x+0.9690，r=0.9993；310 K下，方程為y=5.15×104x+0.9650，r=0.9973。根據(jù)方程判斷出猝滅常數(shù)KSV隨著溫度的升高逐漸增大，說明二者反應(yīng)形成了復(fù)合物且猝滅方式為動態(tài)猝滅。

以lg[(F0-F)/F]對lg[Q]作圖，擬合出不同SSZ濃度下的雙對數(shù)曲線。293K下，方程為y=1.15x+5.45，r=0.9984；310 K下，方程為y=1.32x+6.30，r=0.9948?？梢钥闯鯯SZ和NCDs的結(jié)合位點數(shù)分別為1.15和1.32，總體接近于1，表明SSZ和NCDs只有一個結(jié)合位點。通過計算得出KA分別為3.16×105L/mol和2.00×106L/mol，KA隨著溫度的升高逐漸增大，說明二者的結(jié)合力不斷增強(qiáng)，進(jìn)一步揭示該猝滅過程為動態(tài)猝滅。

依據(jù)范特霍夫方程計算出的熱力學(xué)參數(shù)如表1所示，ΔH>0，ΔS>0，表明SSZ和NCDs通過疏水作用力結(jié)合，可能原因是SSZ表面的-OH和NCDs表面的-COOH發(fā)生脫水而產(chǎn)生的疏水作用力；ΔH>0，ΔG<0說明該反應(yīng)放熱、自發(fā)正向進(jìn)行。

表1 NCDs-SSZ的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)，結(jié)合位點數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)

3 結(jié)論

以乳化劑TEA為碳源，微波法一步合成了強(qiáng)熒光性質(zhì)的NCDs，并對其光譜性質(zhì)進(jìn)行了研究。實驗發(fā)現(xiàn)在pH=6.37的B-R緩沖溶液中，SSZ對NCDs的熒光強(qiáng)度有明顯的猝滅作用，據(jù)此提出了定量測定SSZ的熒光新方法，該方法快速、易操作。猝滅機(jī)理的研究表明SSZ和NCDs之間為動態(tài)猝滅過程，反應(yīng)通過疏水作用力相結(jié)合且自發(fā)進(jìn)行。該碳點的合成為SSZ的定量測定提供了新思路，并拓展了量子點在藥物分析方面的應(yīng)用范圍。