宋 琦,李 艷,徐志鵬,杜召輝,姜 海,邱兆磊,王振杰*

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診外科,蚌埠 233000;2蚌埠市第三人民醫(yī)院五官科;*通訊作者,E-mail:ahbyfywzj@163.com)

創(chuàng)傷失血性休克(traumatic hemorrhagic shock,THS)是急診外科常見的急危重癥,也是導(dǎo)致相關(guān)病人死亡的重要原因。研究發(fā)現(xiàn),早期未控制失血而繼發(fā)的一系列失控性炎癥級聯(lián)反應(yīng)是引起其高死亡率的主要原因之一[1,2]。創(chuàng)傷失血性休克導(dǎo)致大量的炎性因子釋放諸如IL-1、IL-6、TNF-α等,如何早期控制失血、改善微循環(huán)、抑制炎癥過度釋放,阻斷SIRS和MODS的發(fā)生是創(chuàng)傷失血性休克研究的熱點[3,4]。肝臟是人體對THS協(xié)調(diào)反應(yīng)的重要器官之一,肝衰竭是MODS的一個重要組成部分[5]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的激活是THS過程中介導(dǎo)MODS的重要一步。c-Jun N末端蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)屬于MAPK家族,是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,JNK信號通路在肝損傷中起著重要調(diào)節(jié)作用[6]。醋酸鈉林格液被稱為液體復(fù)蘇“第一線”晶體液[7],使用醋酸鈉林格液行限制性液體復(fù)蘇時能夠明顯抑制肝肺組織炎癥因子的釋放[8],但其減輕肝損傷的具體作用機制尚未見相關(guān)文獻報道。醋酸鈉林格液復(fù)蘇是否通過抑制JNK信號通路的激活來減輕創(chuàng)傷失血性休克時肝組織的損傷,國內(nèi)外相關(guān)文獻未見報道。因此,本實驗旨在通過觀察醋酸鈉林格液對創(chuàng)傷失血性休克大鼠肝炎性因子及JNK信號通路的影響,探討其可能機制,為臨床THS患者早期液體復(fù)蘇治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取SPF級SD大鼠(上海杰思捷實驗動物有限公司提供)共32只,雌雄不拘,體質(zhì)量(285±25)g,年齡8-10周。在室溫、濕度及光照均受控的標準環(huán)境中飼養(yǎng)7 d,然后進行實驗。所有實驗操作均按照“醫(yī)學(xué)實驗動物護理和使用指南”進行,并經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院實驗動物管理及倫理委員會批準。

1.2 主要實驗設(shè)備及試劑

Medlab-u/2cs型生物信號采集處理系統(tǒng)(南京美易科技有限公司);臺式高速冷凍離心機、核酸濃度測定儀、qPCR儀(美國Thermo Fisher);SDS-PAGE電泳系統(tǒng)(美國BIO-Rad);0.9%氯化鈉注射液、乳酸鈉林格氏液(安徽環(huán)球藥業(yè)股份有限公司),醋酸鈉林格液(湖南康源制藥有限公司);SuperScript Ⅲ RT反轉(zhuǎn)錄kit(美國ABI-invitrogen);一抗稀釋液、二抗稀釋液、JNK antibody以及MKP-1 antibody均購于北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司。

1.3 動物分組

選取SD大鼠進行實驗,使用隨機數(shù)字表法分組:休克未復(fù)蘇組(n=8)、生理鹽水組(n=8)、乳酸鈉林格液組(n=8)和醋酸鈉林格液組(n=8)。四組大鼠均制備成休克模型,生理鹽水組、乳酸鈉林格液組及醋酸鈉林格液組于休克后60 min應(yīng)用不同液體進行30 min液體復(fù)蘇,復(fù)蘇后觀察4 h,休克未復(fù)蘇組不予復(fù)蘇。生理鹽水組、乳酸鈉林格液組、醋酸鈉林格液組復(fù)蘇后4 h取大鼠肝組織進行后續(xù)實驗;休克未復(fù)蘇組休克觀察4 h取大鼠肝組織,進行后續(xù)實驗。

1.4 休克復(fù)蘇模型的建立

1.4.1 休克模型建立前準備 ①麻醉：稱重后，通過大鼠腹腔按照1 ml ∶100 g比例，注射質(zhì)量分數(shù)4%的水合氯醛，并聯(lián)合異氟醚吸入麻醉大鼠。②消毒、鋪巾：麻醉成功后仰臥位固定于恒溫手術(shù)臺上，雙側(cè)腹股溝區(qū)備皮，并用絡(luò)合碘溶液消毒2-3遍后鋪無菌治療巾。③置管：使用無菌手術(shù)器械解剖游離出雙側(cè)股動脈及股靜脈，分別置管、固定，使用2.5%的枸櫞酸鈉葡萄糖進行封管。右側(cè)股動脈置管連接Medlab-u/2cs生物信號采集系統(tǒng)，持續(xù)監(jiān)測平均動脈血壓(mean arterial pressure，MAP)，通過左側(cè)股動脈放血誘導(dǎo)休克，右側(cè)股靜脈進行休克后的液體復(fù)蘇，將微量泵連接至左側(cè)股靜脈。

1.4.2 建立休克復(fù)蘇模型 使用2 ml注射器(已提前以1 ∶10比例預(yù)充2.5%的枸櫞酸鈉葡萄糖0.2 ml),以2 ml/3 min速度由左側(cè)股動脈放血,MAP維持在(35±5)mmHg之間,整個過程持續(xù)20 min。維持MAP在(35±5)mmHg之間60 min,期間可緩慢放血或回輸自體血。分別應(yīng)用對應(yīng)的復(fù)蘇液體對生理鹽水組、乳酸鈉林格液組與醋酸鈉林格液組大鼠在30 min內(nèi)完成限制性液體復(fù)蘇。液體輸注量以復(fù)蘇液體量和失血量比例為3 ∶1進行,復(fù)蘇后觀察4 h取大鼠肝組織。休克未復(fù)蘇組不予液體復(fù)蘇,觀察4 h取大鼠肝組織(標本凍存于-80℃冰箱中)。為彌補手術(shù)區(qū)域及呼吸道液體的丟失,在整個休克及復(fù)蘇過程中,通過左側(cè)股靜脈輸注生理鹽水5 ml/(kg·h)。

1.5 實驗觀察指標

1.5.1 肝組織中TNF-α mRNA、IL-4 mRNA、IL-6 mRNA、IL-10 mRNA的表達 用Trizol法提取肝組織標本總RNA,將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,建立擴增體系(20 μl),擴增引物見表1。擴增:按照95 ℃ 2 min預(yù)變性,循環(huán)1次;94 ℃ 20 s變性,60 ℃ 20 s延伸,循環(huán)40次;繪制曲線:72 ℃ 30 s繪制溶解曲線。結(jié)束后讀取Ct值并計算mRNA的表達,采用2-ΔΔCt法計算表達量。

表1 目的基因引物序列

1.5.2 采用Western blot法檢測JNK磷酸化和MKP-1乙?；牡鞍自诟谓M織中表達 取約100 mg的凍存肝組織,使用PBS洗滌2次后,于勻漿管壺腹部剪碎,加入RIPA裂解液1 ml,然后放置在冰上進行研磨。抽提肝組織蛋白,在4 ℃冷凍離心機中離心10 min(12 000 r/min),取上清液,對蛋白質(zhì)進行定量分析和濃度測定(參照BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒的方法)。將樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳,后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。5%脫脂奶粉于搖床上封閉1 h,加入對應(yīng)的兔抗大鼠多克隆抗體(1 ∶1 000)一抗,4 ℃孵育過夜后,加入與HRP偶聯(lián)的山羊抗兔Ig G(1 ∶5 000)二抗室溫下孵育1 h,用TBST洗滌10 min,共3次,最后放置暗室曝光及顯影定影(采用ECL法),FluorChem灰度分析軟件進行分析。目的蛋白相對表達=(目的蛋白灰度/β-actin灰度)×100%。

1.5.3 肝組織病理學(xué)檢查 肝組織用4%多聚甲醛溶液進行固定、石蠟包埋、切片、HE染色,在光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較結(jié)果

休克未復(fù)蘇組、生理鹽水組、乳酸鈉林格液組和醋酸鈉林格液組大鼠體質(zhì)量、基礎(chǔ)平均動脈壓經(jīng)單因素方差分析,組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見表2)。

表2 四組大鼠體質(zhì)量和基礎(chǔ)平均動脈壓比較

2.2 肝組織病理學(xué)改變

在光鏡下觀察:休克未復(fù)蘇組肝細胞混濁腫脹明顯、胞質(zhì)淡染,可見大量炎性細胞浸潤,肝竇及肝細胞間質(zhì)淤血明顯;生理鹽水組和乳酸鈉林格液組較休克未復(fù)蘇組組肝細胞腫脹減輕,可見較多炎性細胞浸潤;醋酸鈉林格液組肝細胞混濁腫脹不明顯,少量炎性細胞浸潤,肝竇及肝細胞間質(zhì)無明顯淤血,與生理鹽水組和乳酸鈉林格液組相比,肝損傷及炎性浸潤減輕(見圖1)。

2.3 肝組織TNF-α mRNA、IL-4 mRNA、IL-6 mRNA、IL-10 mRNA的表達

與休克未復(fù)蘇組、生理鹽水組和乳酸鈉林格液組相比,醋酸鈉林格液組TNF-α mRNA、IL-6 mRNA表達明顯減少(P<0.01),IL-4 mRNA和IL-10 mRNA表達明顯增加(P<0.01,見表3)。

表3 四組大鼠TNF-α mRNA、IL-4 mRNA、IL-6 mRNA、IL-10 mRNA的表達

2.4 JNK磷酸化、MKP-1乙?；牡鞍自诟谓M織中的表達

與休克未復(fù)蘇組、生理鹽水組和乳酸鈉林格液組相比,醋酸鈉林格液組JNK磷酸化的蛋白相對表達量減少(P<0.01);MKP-1乙酰化的表達增加(P<0.01,見圖2)。

與休克未復(fù)蘇組比較,*P<0.05,**P<0.01;與生理鹽水組和乳酸鈉林格液組比較,#P<0.05,##P<0.01圖2 JNK磷酸化、MKP-1乙?；牡鞍自诟谓M織中的表達水平Figure 2 Relative expression of JNK phosphorylation protein and MKP-1 acetylation protein in liver tissue of rats in four groups

3 討論

全球每年死于失血性休克的患者約190萬,其中接近80%死于創(chuàng)傷[2]。創(chuàng)傷失血性休克(THS)往往會引起機體的有效循環(huán)血量不足、組織灌注減少,進而激活體內(nèi)諸如中性粒細胞、單核/巨噬細胞等釋放出大量以白細胞介素和腫瘤壞死因子(TNF-α)為主的炎癥介質(zhì),導(dǎo)致炎癥微環(huán)境失調(diào),引起全身炎癥反應(yīng)(SIRS),如不及時干預(yù),最終可能進一步發(fā)展為全身多器官功能障礙(MODS),甚至死亡[9]。THS救治理念在于有效改善組織低灌注的同時能夠減輕機體炎癥反應(yīng),抑制炎癥的進一步發(fā)展,減輕組織臟器的損傷,降低病死率[10]。

肝臟是THS時最先受累的重要器官之一,約20%的THS患者表現(xiàn)出一定程度的肝功能障礙[11]。肝損傷是SIRS進展加快并導(dǎo)致MODS的一個重要部分,考慮到肝臟在代謝、排泄和體內(nèi)平衡機制中的作用,肝損傷是直接與機體損傷加重相關(guān)的臟器,肝細胞是可再生細胞,當肝臟在嚴重破壞后,仍有足夠的修復(fù)彈性,因此針對性的治療可能有效提高休克復(fù)蘇的成功率[5]。相關(guān)的實驗研究認為,醋酸鈉林格液是失血性休克液體復(fù)蘇的“第一線”晶體液[7],能夠減輕組織損傷,提高失血性休克大鼠存活率,改善凝血功能[12],并且醋酸鈉的代謝很少依賴于肝臟,不會引肝臟中醋酸的蓄積。本實驗中結(jié)果表明,通過三種液體限制性液體復(fù)蘇創(chuàng)傷失血性休克大鼠模型,醋酸鈉林格液能夠抑制肝臟組織促炎因子TNF-α、IL-6的產(chǎn)生,提高抑炎因子IL-4、IL-10的生成,肝組織病理結(jié)果也顯示了休克未復(fù)蘇組的肝組織損傷明顯,醋酸鈉林格液組相對于乳酸鈉林格液組及生理鹽水組肝組織炎性浸潤最輕,這與先前的研究結(jié)果一致。但醋酸鈉林格液進行液體復(fù)蘇,減輕肝損傷的具體作用機制尚未見相關(guān)文獻報道。

THS后引起全身性炎癥反應(yīng)的最早的信號傳導(dǎo)途徑目前仍知之甚少。JNK信號通路是MAPK家族一條相對重要的信號通路,可被創(chuàng)傷、休克等應(yīng)激反應(yīng)和TNF-α激活[13]。磷酸化的C-Jun N末端激酶(p-JNK)是一種中央代謝調(diào)節(jié)劑,TNF-α可通過JNK的活化來發(fā)揮其功能,TNF-α誘導(dǎo)的細胞死亡是JNK依賴性的[14]。有研究指出,在出血發(fā)生后不久,促分裂原活化蛋白(MAP)激酶中的JNK即在肝臟中活化,參與肝組織缺氧的早期反應(yīng)過程。小鼠出血至25 mmHg 30 min會導(dǎo)致肝臟內(nèi)JNK磷酸化顯著增加(2.1倍),組織缺氧是激活出血后肝臟早期信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵因素[15]。在藥物導(dǎo)致的肝損傷的研究中,JNK在對乙酰氨基酚(APAP)誘發(fā)的肝損傷中起著核心作用,抑制JNK激活來部分緩解乙酰氨基酚APAP誘導(dǎo)的肝損傷[16,17]。絲裂原激活的蛋白激酶磷酸酶1(MKP-1),是JNK的關(guān)鍵負調(diào)節(jié)劑。MKP-1具有抗凋亡和抗炎特性,可通過抑制JNK信號途徑細胞凋亡和炎癥[18]。Wancket等[19]報道指出,MKP-1能夠通過抑制JNK活性保護小鼠免受APAP誘導(dǎo)的肝損傷。MKP-1表達水平的升高與p38和JNK活性的降低在時間上呈相關(guān)性,組織細胞中MKP-1表達的適度增加能夠縮短p38和JNK活化的時間,并在一定程度上抑制了TNF-α和IL-6的產(chǎn)生[20]。本實驗結(jié)果也證明了這一點,生理鹽水組、乳酸鈉林格液組、醋酸鈉林格液組大鼠肝組織JNK磷酸化水平相對于休克未復(fù)蘇組明顯降低,而肝組織中MKP-1乙?；礁哂谛菘宋磸?fù)蘇組,并且醋酸鈉林格液組中表達水平最高,表明在創(chuàng)傷失血性休克發(fā)生時,JNK會在肝臟中活化,通過液體復(fù)蘇能夠增加肝組織MKP-1乙酰化水平,從而抑制JNK磷酸化,減少促炎因子IL-6、IL-10的釋放,減輕肝組織損傷及炎癥反應(yīng)。相關(guān)的研究指出:醋酸鹽可以減弱JNK磷酸化的能力,通過減少細胞中促炎因子的釋放,并提高抗炎因子的轉(zhuǎn)錄水平來調(diào)節(jié)細胞因子的平衡,從而減輕細胞的炎癥反應(yīng)[21]。因此我們推測,醋酸鈉林格液相對于生理鹽水和乳酸鈉林格液,可能是通過醋酸鹽的補充,提高大鼠肝組織中MKP-1乙酰化水平,從而抑制JNK信號通路的活化,調(diào)節(jié)炎性因子的釋放,進而減輕了肝組織損傷及炎癥反應(yīng)。