曹煥澤，胡亦然，任玲，蔡平平

1.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250000；2.山東第一醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院，山東 濟南 250000

妊娠期高血壓（hypertensive disorders of pregnancy，HDP）是以高血壓、蛋白尿為主要臨床表現(xiàn)的妊娠期特發(fā)疾病，嚴重者伴發(fā)多臟器損傷，甚至導致死亡［1］。HDP是導致孕產(chǎn)婦和新生兒死亡的主要原因之一，死亡率占全球孕婦總死亡率的14%，與正常孕產(chǎn)婦相比，妊娠期高血壓患者心、腦血管等遠期并發(fā)癥發(fā)生率有所增加［2-3］。近年來常在基礎(chǔ)治療的基礎(chǔ)上聯(lián)合中藥注射液治療妊娠期高血壓的臨床對照研究，選用的中藥注射液以丹參制劑——丹參注射液與復方丹參注射液最為常見，并且有較好的治療效果。丹參，是婦科常用藥之一，有“女科要藥”之稱，其最早記載見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，早在北宋時期已有丹參用于“妊娠中風”的記載。藥理研究表明，丹參具有抗腫瘤、保護血管內(nèi)皮、抗炎、抗氧化、抗抑郁、改善糖代謝等作用［4-5］。但是丹參活性成分多，作用靶點繁雜，其在妊娠期高血壓治療中的機制仍待進一步明確。

本文從網(wǎng)絡(luò)藥理學為角度，探討丹參治療妊娠期高血壓的有效成分以潛在作用靶點，并探索其可能的作用機制，為臨床用藥提供參考。

1 資料與方法

1.1 丹參主要活性成分及潛在作用靶點篩選基于中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP），以“丹參”（danshen）為關(guān)鍵詞，生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18作為篩選條件檢索，獲得丹參主要活性成分及作用靶點。

1.2 妊娠期高血壓的相關(guān)靶基因檢索應(yīng)用Genecards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）以“hypertensive disorders of pregnancy”為關(guān)鍵詞檢索，獲取HDP的所有相關(guān)基因，保留Score≥10的結(jié)果。同時在OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org/）中，以“hypertensive disorders of pregnancy”為關(guān)鍵詞檢索，獲取相關(guān)基因。將兩數(shù)據(jù)庫中獲得的基因進行合并、去重以及規(guī)范基因名稱等處理。

1.3 構(gòu)建“疾病-藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖將丹參主要活性成分的靶基因與妊娠期高血壓相關(guān)靶基因進行映射，利用韋恩圖（Venn）將兩者取交集，得到丹參-妊娠期高血壓的藥物-疾病交集基因。將交集基因及丹參主要活性成分定義為網(wǎng)絡(luò)圖的節(jié)點，藥物、疾病、藥物——疾病交集靶點基因以及藥物活性成分間相互作用關(guān)系定義為網(wǎng)絡(luò)圖的連接，運用Cytoscape軟件，構(gòu)建丹參治療HDP的“疾病-藥物-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 藥物-疾病靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建將藥物-疾病交集靶點基因，作為“Ptotein Name”輸入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），物種設(shè)定為“Homo sapiens”，結(jié)合分數(shù)設(shè)定為＞0.4，忽略孤立節(jié)點，構(gòu)建丹參-妊娠期高血壓的靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

1.5 GO生物過程及KEGG信號通路分析采用Uniprot數(shù)據(jù)庫，將藥物-疾病交集基因名稱轉(zhuǎn)化Uniprot ID。運用Bioconductor數(shù)據(jù)工具平臺（http：//www.bioconductor.org/）與Rx64（3.6.3）軟件，分析靶點的GO富集和KEGG信號通路，并將所得結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 丹參主要活性成分與相關(guān)分子靶基因通過TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索“丹參”，檢索到202種化合物。以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為條件進行篩選，得到丹參主要活性成分65種，對應(yīng)靶基因108個。

2.2 妊娠期高血壓相關(guān)基因以“hypertensive disorders of pregnancy”為關(guān)鍵詞進行檢索，于Genecards數(shù)據(jù)庫獲取HDP相關(guān)基因4706種，設(shè)定相關(guān)度≥10%為篩選條件，二次篩選后收集到基因1 573個；于OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索到HDP相關(guān)基因735個。將兩數(shù)據(jù)庫獲得的相關(guān)基因匯總、刪除重復基因，共1 945個HPD相關(guān)基因，作為疾病靶基因。

2.3 “疾病-藥物-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)將丹參對應(yīng)的108個靶點基因與1945個疾病靶基因進行映射，通過Venn圖分析得到丹參-HDP相交靶基因共73個。將節(jié)點及節(jié)點間相互作用的數(shù)據(jù)導入到Cytoscape軟件，得到丹參治療HDP的“疾病-藥物-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1，其中靶點基因中PTGS2、SCN5A、ADRB2、OPRM1、ADRA1A、ACHE度值較高，丹參活性成分中度值較高的為luteolin、tanshinone iia、4-methylenemiltirone、salviolone、dihydrotanshinlactone。

圖1 “疾病-藥物-活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 藥物-疾病靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）將73個丹參-HDP交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫進行蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，見圖2，PPI網(wǎng)絡(luò)中蛋白節(jié)點73個，764條相互作用線，平均節(jié)點度20.9，平均局部聚類系數(shù)為0.7。根據(jù)PPI中基因之間連接節(jié)點數(shù)目，統(tǒng)計出連接節(jié)點最多的30個核心靶點，見圖3。其中AKT激酶（AKT1）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）為連接節(jié)點最多的4個靶點，連接節(jié)點數(shù)目分別為43、40、39、38個。

圖2 藥物-疾病靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 藥物-疾病核心靶點

2.5 GO富集功能分析GO富集分析獲得109個生物過程，排名前10的分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC），見圖4。MF以兒茶酚胺、磷酸酶、類固醇、細胞因子受體結(jié)合及G蛋白偶聯(lián)胺受體、腎上腺素能受體、核受體、轉(zhuǎn)錄因子、類固醇激素受體活化為主；血管的大小、管徑、收縮及循環(huán)系統(tǒng)中血管的調(diào)節(jié)，對類固醇激素、抗生素、異生物質(zhì)、金屬離子的應(yīng)激反應(yīng)、肌細胞增殖、腺體發(fā)育是主要BP。CC相關(guān)度高的為細胞膜、膜質(zhì)微區(qū)、膜區(qū)域，突觸前膜、突觸后膜、突觸膜的組成部分及固有成分等。

圖4 GO富集功能分析

2.6 KEGG通路富集分析KEGG通路富集到44條相關(guān)通路，篩選出富集程度最高的20條通路，見圖5。其中信號傳導通路在相關(guān)通路中占據(jù)較大比重，涉及PI3K/AKT信號通路、HIF-1信號通路、VEGF信號通路、TNF信號通路、FOxO信號轉(zhuǎn)導通路、MAPK信號通路、JAK-STAT信號通路等。其中PI3K/AKT信號通路，見圖6，涉及CHRM2、EGFR、AKT1、VEGFA、CCND1、CDKN1A、CASP9、MAPK1、IL6、MDM2、ERBB2、IL2、IL4、INSR、MET、BCL2、MYC、ITGB3等18個相關(guān)基因，基因富集程度最高。

圖5 KEGG富集程度最高的20條通路

圖6 PI3K/AKT信號通路

3 討論

本文運用網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法對丹參治療妊娠期高血壓的相關(guān)活性成分、作用靶點以及途徑進行分析。丹參活性成分多，經(jīng)過篩選后，生物利用度與類藥性較高的丹參活性成分達65種，丹參酮、隱丹參酮、木犀草素、4-亞甲基硝胺以及二氫丹參內(nèi)酯度值較高，可能在治療妊娠期高血壓中發(fā)揮更關(guān)鍵作用。

丹參治療HDP潛在靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示，AKT激酶（AKT1）、IL-6、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）等靶點相互作用蛋白眾多，可能為關(guān)鍵靶點。AKT作為多種信號通路的中心節(jié)點，參與代謝，細胞增殖、存活、生長，血管生成的調(diào)節(jié)等過程的信號傳導［6］。VEGF具有血管擴張的作用，可誘導一氧化氮的產(chǎn)生，通過調(diào)節(jié)血管活性功能和血管生成反應(yīng)，參與胎盤發(fā)育和功能所需的新血管的形成［7］。胎盤受損的螺旋動脈重塑導致抗血管生成因子釋放，誘發(fā)母體血管內(nèi)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮功能障礙是導致妊娠期出現(xiàn)高血壓和蛋白尿［8］。IL-6可與體內(nèi)其他炎性因子相互作用，令血管收縮與血壓升高，導致子癇等一系列的臨床表現(xiàn)［9］。MAPK是絲裂原活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導通路的重要組成部分，參與內(nèi)皮細胞炎性反應(yīng)和炎性因子表達信號通路的轉(zhuǎn)導。PPI網(wǎng)絡(luò)中顯示了與血管及內(nèi)皮生成、炎癥反應(yīng)相關(guān)的一系列靶點，如表皮生長因子受體PP1、NOS2、IL10、IL4、IL2、IFNG、CD40配體等；與細胞凋亡及離子通道調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白，如Bcl-2、E3泛素蛋白連接酶等。

靶點的富集分析顯示丹參治療HDP的作用涉及多個生物過程及信號通路，如PI3K/AKT信號通路、HIF-1信號通路、VEGF信號通路、TNF信號通路、表皮生長因子受體、FOxO信號轉(zhuǎn)導通路、MAPK信號通路、JAK-STAT信號通路等。胎盤螺旋小動脈重鑄不足、胎盤持續(xù)缺氧是先兆子癇發(fā)病機制之一，低氧胎盤釋放出抗血管生成和促炎因子，引起母體血管內(nèi)皮功能障礙、高血壓和器官損傷［10］。PI3K/AKT信號通路存在廣泛，參與細胞生長、增殖及分化與遷移的調(diào)節(jié)，介導sFlt-1等血管內(nèi)皮生長因子拮抗劑蛋白的激活，調(diào)節(jié)血管生成因子的血漿水平與血管介質(zhì)，通過調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細胞的侵襲，維持胎盤功能；同時可激活下游eNOS，促進NO釋放，調(diào)控血管舒張，增加胎盤血供［11-13］。曹慧敏等［14］發(fā)現(xiàn)，丹參酮II A通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路減輕氧化應(yīng)激導致的內(nèi)皮細胞損傷。缺氧誘導因子信號通路（HIF-1信號通路）參與氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過激活下游相關(guān)靶點減輕耗氧量，并調(diào)控Bac-2以調(diào)節(jié)細胞凋亡。缺氧誘導因子（HIF-1）是HIF-1信號通路中的關(guān)鍵因子，在機體處于低氧狀態(tài)時激活HIF-1信號通路參與氧化應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)機體各組織功能，減輕耗氧量，適應(yīng)缺氧狀態(tài)［15］。HIF-1信號通路過度活化，胎盤對氧敏感性增加，滋養(yǎng)細胞的浸潤能力下降，是導致妊娠期高血壓的機制之一［16］。JAK/STAT信號通路可作用于細胞生長和分化及免疫等，與內(nèi)皮細胞功能障礙相關(guān)，抑制此通路可改善血管內(nèi)皮的分泌功能以及eNOS高表達，阻止子癇前期的重要危險因素sFlt-1的產(chǎn)生［17-18］。表皮生長因子通路（EGF信號通路）調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞的分化，其破壞可能導致發(fā)生妊娠期高血壓［19］。炎性過程與妊娠期高血壓的發(fā)病相關(guān)，患有妊娠并發(fā)癥的婦女血清中TNF-α，IL-6，IL-10等炎性因子升高［20-21］。TNF信號通路可調(diào)控IL-6與NF-κB表達，調(diào)節(jié)eNOS，控制血管炎癥，同時可調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善胎盤血管循環(huán)障礙［22-23］。FOXO是絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT（也稱為蛋白激酶B）的主要底物，PI3K/Akt途徑的激活拮抗FOXO活性，又能夠擴增信號傳導［24］。

綜上所述，本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法對丹參在治療妊娠期高血壓中潛在作用機制進行探究，認為丹參治療妊娠期高血壓的相關(guān)靶點多集中在AKAKT1、IL-6、VEGFA、MAPK1等靶點，調(diào)控PI3K/AKT信號通路、HIF-1信號通路、VEGF信號通路、TNF信號通路、表皮生長因子受體、FOxO信號轉(zhuǎn)導通路、MAPK信號通路、JAK-STAT信號通路等多條通路，影響胎盤螺旋動脈收縮、保護血管內(nèi)皮細胞、調(diào)節(jié)機體炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激。但是網(wǎng)絡(luò)藥理學僅是單純從化學成分、作用靶點、信號通路方面進行的理論篩選，后續(xù)仍需更多實驗數(shù)據(jù)進行支持以及驗證。