陳曉亮馬世龍杜金葉殷麗麗

(1.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山西 大同 037009；2.山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；山西 大同 037009)

黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)屬唇形科多年生草本植物，在我國栽培歷史悠久，其根經(jīng)干燥后入藥，具有抗炎、降壓、解毒、利尿、安胎等功效[1]。黃芩含有黃酮類、萜類、多糖等多種活性成分[2]，其中黃酮類物質(zhì)具有抗病毒、抗菌和抗癌等功效[3-5]。目前，植物中黃酮類物質(zhì)常用水煎煮提取法[6]、乙醇提取法[7]、超聲波提取法[8]、微波提取法[9]等，在規(guī)?；a(chǎn)中主要為水煎煮提取法和乙醇提取法，然而水煎煮法存在提取率較低、雜質(zhì)多等問題[10]。因此，本研究采用正交分析對乙醇提取法的影響因素進行優(yōu)化，為工業(yè)上高效提取黃芩總黃酮的效率提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗用黃芩購于大同市中醫(yī)院中藥房，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購于上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司(產(chǎn)品批號：153-18-4)，其余試驗所用試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

用Al(NO3)3-NaNO2顯色法，以300～800nm波長掃描黃芩總黃酮提取液和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸收峰，檢測發(fā)現(xiàn)2種溶液的最大吸收值均為505nm。因此，在505nm波長下檢測不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，得標(biāo)準(zhǔn)回歸方程：

Y=10.2395X+0.0091(R2=0.9994)

1.2.2 黃芩總黃酮得率的計算

將黃芩根干燥粉碎后過60目篩，-20℃分裝儲存，備用。取1g黃芩樣品，浸入一定濃度乙醇，置于恒溫水浴中回流提取1h后，將回流液移入100mL的容量瓶中定容，利用Al(NO3)3-NaNO2顯色法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程，以505nm波長下吸光值計算總黃酮濃度，從而得到黃芩總黃酮的得率。

1.2.3 單因素實驗

按照Al(NO3)3-NaNO2顯色法檢測不同乙醇提取濃度(40%、50%、60%、70%和80%)、不同液固比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1和60∶1)及不同提取溫度(40℃、50℃、60℃、70℃和80℃)時的總黃酮得率。

1.2.4 正交法優(yōu)化提取工藝

將以上單因素各選取3個水平進行正交試驗，如表1所示。

表1 正交試驗因素水平

1.2.5 細胞增殖能力檢測

取4×104·mL-1的SMMC-7721、HT-29細胞接種于96孔板，于37℃，5%CO2過夜培養(yǎng)。用含0mg·mL-1、50mg·mL-1、100mg·mL-1、200mg·mL-1、400mg·mL-1總黃酮完全培養(yǎng)液分別培養(yǎng)24h、48h和72h后棄培養(yǎng)液，每孔加入100μL含10%MTT的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后在570nm波長處檢測吸光值(A)，計算總黃酮對細胞的抑制率。

細胞相對抑制率=(A對照-A實驗)/(A對照-A空白)×100%

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對黃芩總黃酮得率的影響

當(dāng)液固比為30∶1，提取溫度為50℃時，檢測乙醇濃度為40%、50%、60%、70%和80%時總黃酮得率。結(jié)果如圖1，當(dāng)提取劑濃度為60%時，總黃酮得率最大，此時黃芩中總黃酮得率為14.87%，與提取濃度為40%和50%時的總黃酮得率差異顯著，但與提取濃度為70%時的總黃酮得率差異不顯著，當(dāng)提取溶劑的濃度繼續(xù)增加時，總黃酮得率反而下降。

2.1.2 不同液固比對黃芩總黃酮得率的影響

當(dāng)提取溶劑乙醇濃度為60%，提取溫度為50℃，檢測不同液固比時的總黃酮得率。結(jié)果如圖2，當(dāng)液固比為20∶1時，總黃酮得率最低；當(dāng)液固比為30∶1、40∶1和50∶1時，總黃酮得率差異不顯著；液固比為50∶1時，總黃酮得率最大，為14.59%；當(dāng)液固比為60∶1時，總黃酮得率下降，但與液固比為50∶1時差異不顯著。

2.1.3 提取溫度對黃芩總黃酮得率的影響

當(dāng)乙醇濃度為60%，提取液固比例為30∶1，分析不同提取溫度(40℃、50℃、60℃、70℃和80℃)時總黃酮的得率。結(jié)果如圖3，當(dāng)溫度為60℃時，黃芩總黃酮得率最高，為13.49%，與40℃和50℃時的總黃酮得率差異顯著，但與70℃時的總黃酮得率差異不顯著，當(dāng)提取溫度繼續(xù)升高時，總黃酮得率隨之下降。

2.1.4 正交試驗

由單因素試驗結(jié)果可知乙醇濃度、液固比及提取溫度均會影響黃芩中黃酮總得率，將這3個因素各選取3個水平，其中乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、60%和70%，液固比為40∶1、50∶1和60∶1，提取溫度為50℃、60℃和70℃，按照L9(33)進行正交試驗，探究不同提取組合對黃芩中黃酮總得率的影響。

方差分析表明，所選的3個因素對總黃酮得率具有顯著影響(P<0.05)，結(jié)果見表2；極差分析顯示，極差RA>RC>RB，見表3。因此，乙醇濃度對總黃酮提取得率影響最大，液固比影響最小。各因素對黃酮總得率的平均值分析表明，乙醇濃度(A)中K2最大，液固比(B)中K1最大，提取溫度(C)中K2值最大，見表3。因此，總黃酮最佳提取條件為A2B1C2，此時黃芩中黃酮總得率為15.68%，標(biāo)準(zhǔn)差為1.09%，表明該提取條件具有較好的穩(wěn)定性，所選的參數(shù)可行。

表2 黃芩總黃酮提取工藝方差分析

表3 黃芩總黃酮提取工藝L9(33)正交試驗結(jié)果

2.1.5 黃芩總黃酮提取物抗腫瘤活性研究

MTT法檢測黃芩總黃酮對人肝癌細胞SMMC-7721、人結(jié)腸癌細胞HT-29增殖的作用，結(jié)果如圖4所示。用25μg·mL-1、50μg·mL-1、100μg·mL-1、200μg·mL-1、400μg·mL-1黃芩總黃酮處理SMMC-7721細胞24h、48h、72h，IC50分別為1024μg·mL-1、533.6μg·mL-1、287.7μg·mL-1；用25μg·mL-1、50μg·mL-1、100μg·mL-1、200μg·mL-1、400μg·mL-1黃芩總黃酮處理HT-29細胞24h、48h、72h，IC50分別為830.5μg·mL-1、372.5μg·mL-1、264.2μg·mL-1。結(jié)果表明，黃芩總黃酮對SMMC-7721細胞、HT-29細胞具有顯著抑制作用，且呈明顯的時間和劑量依賴性。

3 結(jié)論與討論

黃酮類物質(zhì)具有抗病毒、抗癌、抗氧自由基等作用，溶于有機溶劑。因此，本研究選用乙醇作為總黃酮提取劑，采用單因素試驗和正交試驗評價總黃酮得率，為工業(yè)上黃酮提取提供了參考依據(jù)。

單因素試驗結(jié)果表明，當(dāng)乙醇濃度為60%時，黃芩中總黃酮的極性與60%的乙醇的極性最相似[11]，黃酮從植物細胞中溶出率高，黃酮總得率最高，當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增加時，黃酮類物質(zhì)的溶出因溶液極性減弱而降低[12]，所以試驗中乙醇濃度為80%時，總黃酮得率降低；單因素試驗中當(dāng)液固比為50∶1時，黃酮總得率最高，液固比的增大可以增加提取溶劑和原料的接觸效果，有利于提高溶出物的擴散速度，從而可提高黃酮總得率，但當(dāng)液固比增大時，黃芩中的其它物質(zhì)與黃酮競爭溶劑而影響黃酮的提取率[13]；當(dāng)提取溫度高于60℃時，黃酮總得率降低，可能是提取溫度過高破壞了黃芩中黃酮類物質(zhì)的穩(wěn)定性，導(dǎo)致總黃酮含量降低[14]，而在提取溫度為60℃時，黃酮溶出效果最高。

正交試驗設(shè)計廣泛應(yīng)用于提取工藝的優(yōu)化[15]。本研究采用正交試驗對黃芩中總黃酮提取過程進行了優(yōu)化，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，提取溶劑與黃芩比例為40∶1，提取溫度為60℃時，總黃酮得率最高，為15.68%，該提取條件具有較好的穩(wěn)定性，且試驗所采用的3個因素中乙醇提取濃度對提取率影響最大，其次為提取溫度。

黃芩作為很多中成藥的原料藥在臨床上應(yīng)用廣泛，近年來對黃芩抗腫瘤活性的研究也日趨深入。本研究表明，黃酮提取物可抑制肝癌細胞SMMC-7721和人結(jié)腸癌細胞HT-29的增殖，但其抑制機制尚未完全明確。黃芩中總黃酮提取物成分復(fù)雜，今后應(yīng)分離總黃酮活性成分，以期更全面地評價黃芩中抑制癌細胞增殖的活性成分及作用機理，為臨床上制備新的抗腫瘤藥物提供理論支持。