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新舊兩版指南對浸潤性乳腺癌HER-2基因擴增的判讀影響

2021-06-17 12:20楊向紅
臨床與實驗病理學雜志 2021年5期
關鍵詞:拷貝數(shù)舊版檢出率

張 瑩,王 哲,楊向紅

乳腺癌是全球女性常見的惡性腫瘤之一,近年乳腺癌的發(fā)病率逐年升高,并呈年輕化趨勢[1]。有研究發(fā)現(xiàn),曲妥珠單抗對浸潤性乳腺癌組織中HER-2基因擴增患者的分子靶向治療取得較好療效,因此明確HER-2基因狀態(tài)對乳腺癌患者治療尤為重要[2]。目前HER-2檢測方法有免疫組化(immunohistochemistry, IHC)、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)、顯色原位雜交(chromogenic in situ hybridization, CISH)、雙色銀染原位雜交(dual-color in situ hybridization, DISH)等。本文采用IHC和FISH兩種方法進行HER-2蛋白表達和基因擴增檢測,分析其一致性;應用《乳腺癌HER-2檢測指南(2014版)》[3](簡稱舊版指南)和《乳腺癌HER-2檢測指南(2019版)》[4](簡稱新版指南)進行判讀,探討新舊兩版指南對判讀結果的影響,旨在為臨床靶向用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019年1月~2020年10月中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院存檔的乳腺浸潤性導管癌組織石蠟標本698例,其中手術切除標本575例,粗針穿刺標本123例。所有患者均為女性,年齡23~84歲,中位年齡53歲,術前均未接受新輔助治療。采用IHC和FISH法進行HER-2蛋白表達和基因擴增檢測,根據(jù)新舊兩版指南判讀標準,由兩位病理醫(yī)師閱片判讀。

1.2 方法

1.2.1IHC 標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定,石蠟包埋,連續(xù)3 μm厚切片3張,分別進行HE、IHC、FISH染色。IHC使用HER-2/neu兔單克隆抗體(4B5,羅氏診斷公司),Ventana BenchMark XT 全自動免疫組化儀檢測,每例標本均設有陰、陽性對照。

1.2.2FISH 使用HER-2基因擴增檢測試劑盒(北京金菩嘉公司)。(1)石蠟切片65 ℃烤片2 h,常規(guī)脫蠟。(2)預處理:100%乙醇脫二甲苯5 min,去離子水3 min,水煮20 min。(3)酶消化:37 ℃預熱的胃蛋白酶工作液中消化10 min。(4)梯度乙醇脫水。(5)變性及雜交:滴加探針混合液,蓋玻片,封片膠封固,85 ℃ 5 min,42 ℃孵育16~18 h。(6)雜交后處理:46 ℃ 2×SSC洗滌5 min,46 ℃ 0.1%NP-40洗滌2 min,70%乙醇3 min,暗處自然干燥。(7)DAPI(4′6-二脒基-2-苯基吲哚)復染、封片。(8)熒光顯微鏡下判讀。

1.3 結果判讀IHC結果判讀:根據(jù)舊版指南無染色或≤10%的浸潤癌細胞呈不完整的、微弱的細胞膜染色為0;>10%的浸潤癌細胞呈不完整的、微弱的細胞膜染色為1+;>10%的浸潤癌細胞呈弱~中等強度的完整細胞膜染色,或≤10%浸潤癌細胞呈強而完整的細胞膜染色為2+;>10%的浸潤癌細胞呈強而完整且均勻的細胞膜染色為3+。新版指南與舊版指南判讀結果基本相同。

FISH結果判讀:在低倍鏡下觀察整張FISH切片,判斷檢測質量以及是否存在HER-2基因擴增的異質性。找到至少2個浸潤癌區(qū)域,隨機計數(shù)30個浸潤癌細胞中的雙色信號(要求細胞核大小一致、核邊界完整、DAPI染色均一、細胞核無重疊、信號清晰)。雙探針FISH判讀標準詳見圖1、2。

圖1 舊版指南HER-2雙探針FISH檢測判讀標準:a表示均質、連續(xù)的浸潤細胞,且占浸潤癌的10%以上

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析,對IHC與FISH法檢測的HER-2蛋白表達與基因擴增結果進行Kappa一致性分析及Spearman等級相關分析,本實驗以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 舊版指南判讀在698例乳腺浸潤性導管癌患者中,IHC法進行HER-2蛋白檢測,合計檢測HER-2(0)、HER-2(1+)患者116例,檢出率為16.6%(116/698);HER-2(2+)患者402例,檢出率為57.6%(402/698);HER-2(3+)患者180例,檢出率25.8%(180/698)(圖3)。

圖3 HER-2蛋白表達,Ventana Ultraview DAB 法:A.HER-2(0);B.HER-2(1+);C.HER-2(2+);D.HER-2(3+)

FISH法進行HER-2基因擴增檢測,HER-2基因擴增陽性284例,檢出率為40.7%(284/698);HER-2基因擴增陰性364例,檢出率為52.1%(364/698);HER-2基因擴增結果不確定50例,檢出率為7.2%(50/698)。

圖2 新版指南HER-2雙探針FISH檢測判讀標準:a表示IHC檢測HER-2(3+)呈陽性;HER-2(0)、HER-2(1+)、HER-2(2+)均呈陰性

2.2 新版指南判讀在698例乳腺浸潤性導管癌中,F(xiàn)ISH法檢出HER-2基因擴增陽性279例,檢出率為40.0%(279/698);FISH法檢測HER-2基因擴增陰性419例,檢出率為60.0%(419/698)。IHC法檢測HER-2蛋白表達結果與舊版指南判讀結果一致。

2.3 新版與舊版指南判讀分析與舊版指南判讀結果相比,新版FISH法檢測HER-2基因擴增陽性由40.7%降至40.0%,F(xiàn)ISH法檢測HER-2基因擴增結果不確定由7.2%降至0,F(xiàn)ISH法檢測HER-2基因擴增陰性由52.1%升至60.0%。在698例FISH法檢測HER-2基因擴增結果中,642例新舊兩版判讀結果相同,一致率為92.0%(642/698),56例兩版判讀結果不同(8.0%,56/698)。56例中舊版指南FISH法檢測HER-2基因擴增陽性而新版指南為陰性的6例,舊版指南FISH法檢測HER-2基因擴增結果不確定而新版指南為陽性1例,舊版指南FISH法檢測HER-2基因擴增不確定而新版指南陰性49例(圖4)。

圖4 FISH法檢測HER-2基因擴增結果(HER-2呈紅色,CEP17呈綠色):A.HER-2信號連接成簇;B.HER-2/CEP17比值≥2.0,平均HER-2拷貝數(shù)≥4.0信號/細胞;C.HER-2/CEP17比值≥2.0,平均HER-2拷貝數(shù)<4.0信號/細胞;D.HER-2/CEP17比值<2.0,平均HER-2拷貝數(shù)≥6.0信號/細胞;E.HER-2/CEP17比值<2.0,平均HER-2拷貝數(shù)≥4.0且<6.0信號/細胞;F.HER-2/CEP17比值<2.0,平均HER-2拷貝數(shù)<4.0信號/細胞

2.4 IHC與FISH法檢測HER-2蛋白表達與基因擴增的一致性分析根據(jù)舊版指南判讀,IHC法檢測HER-2蛋白表達0、1+與FISH法檢測HER-2基因擴增陰性符合率為88.8%(103/116),IHC法檢測HER-2蛋白表達2+與FISH法檢測HER-2基因擴增陽性符合率為27.9%(112/402),IHC法檢測HER-2蛋白表達3+與FISH法檢測HER-2基因擴增陽性符合率為92.8%(167/180)。IHC與FISH法檢測HER-2蛋白表達與基因擴增的總一致率為54.7%(382/698),結果存在一致性(Kappa=0.277,P<0.001),且呈正相關(r=0.608,P<0.001,表1)。

表1 舊版指南IHC與FISH法檢測HER-2蛋白表達與基因擴增的一致性分析

根據(jù)新版指南判讀,IHC法檢測HER-2蛋白表達0、1+與FISH法檢測HER-2基因擴增陰性符合率為97.4%(113/116),IHC法檢測HER-2蛋白表達2+與FISH法檢測HER-2基因擴增陽性符合率為26.9%(108/402),IHC法檢測HER-2蛋白表達3+與FISH法檢測HER-2基因擴增陽性符合率為93.3%(168/180)。IHC與FISH法檢測HER-2蛋白表達與基因擴增的總一致率為55.7%(389/698),結果存在一致性(Kappa=0.251,P<0.001),且呈正相關(r=0.641,P<0.001,表2)。

表2 新版指南IHC與FISH法檢測HER-2蛋白表達與基因擴增的一致性分析

3 討論

HER-2基因屬于EGFR家族成員之一,主要通過與家族其他成員形成異二聚體與配體結合,激活下游信號傳導途徑,從而促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[5-7]。研究發(fā)現(xiàn),在乳腺癌、胃癌、肺癌、結直腸癌中均檢測出HER-2基因擴增或HER-2蛋白的過表達,13%~20%的乳腺癌患者HER-2檢測陽性,并有部分患者從分子靶向治療中獲益[8-10]。因此,明確HER-2基因狀態(tài)對乳腺癌患者的個體化治療尤為重要。

根據(jù)新版指南判讀,本組FISH法檢測HER-2基因擴增陽性檢出率為40.0%,IHC法檢測HER-2蛋白表達3+檢出率為25.8%,IHC法檢出率與文獻報道基本一致[11-12]。由于FISH法檢測參照的判讀標準不同,導致文獻報道的FISH法檢測HER-2基因擴增陽性檢出率不一[11-13]。本組通過對698例浸潤性乳腺癌患者的IHC和FISH結果以舊版指南再判讀發(fā)現(xiàn),新版指南結合了HER-2/CEP17比值、平均HER-2拷貝數(shù)和IHC結果綜合評估,取消了FISH法檢測HER-2基因擴增的不確定結果,使不確定結果由7.2%降至0。FISH法檢測HER-2基因擴增陽性由40.7%降至40.0%,F(xiàn)ISH法檢測HER-2基因擴增陰性由52.1%升至60.0%,為臨床提供了更明確的HER-2基因狀態(tài)。此外在698例中,有56例新舊兩版指南判讀結果不同,其中6例為HER-2/CEP17比值≥2,平均HER-2拷貝數(shù)<4.0信號/細胞,在新版指南中FISH結果為陰性,現(xiàn)有的臨床試驗數(shù)據(jù)中,缺乏充分依據(jù)顯示此部分患者能從靶向治療中獲益[14-15],新版指南判讀結果與臨床試驗數(shù)據(jù)相符。另有50例為HER-2/CEP17比值<2,平均HER-2拷貝數(shù)≥4.0且<6.0信號/細胞,根據(jù)新版指南判讀,1例結合IHC 3+結果,F(xiàn)ISH結果為陽性,49例結合IHC 0、1+、2+結果,F(xiàn)ISH結果為陰性。此部分患者能否從靶向治療中獲益目前尚不確定,需要更充分的循證醫(yī)學依據(jù)[16-17]。

本組結果顯示,根據(jù)新舊兩版指南判讀,IHC與FISH法檢測HER-2蛋白表達與基因擴增結果均存在一致性(Kappa=0.277,P<0.001;Kappa=0.251,P<0.001),且均呈正相關(r=0.608,P<0.001;r=0.641,P<0.001),與文獻報道一致[18-19]。經(jīng)對比分析發(fā)現(xiàn),根據(jù)新版指南判讀,IHC法檢測HER-2 (0、1+)、(3+)與FISH法檢測HER-2基因擴增結果的符合率明顯增加(97.4%,93.3%),IHC法檢測HER-2 (2+)與FISH法檢測結果符合率降低(26.9%),IHC與FISH法檢測的總一致率略有提高(55.7%)。新版指南中部分結果結合IHC綜合判讀,提高了IHC與FISH法檢測結果的一致性。同時本組結果也進一步驗證了指南中提出的,IHC法檢測HER-2(0)、(1+)判為陰性,HER-2(3+)判為陽性,HER-2 (2+)一致率較低,需應用FISH法進行HER-2基因擴增狀態(tài)檢測,為臨床提供多角度更精準的靶向治療依據(jù)。此外,指南中還提出所有乳腺原發(fā)性浸潤性癌均應進行HER-2檢測,只要能獲取腫瘤組織,對復發(fā)灶、轉移灶也應進行HER-2檢測。本組698例均為原發(fā)性浸潤性乳腺癌,對復發(fā)灶、轉移灶HER-2檢測結果需跟蹤患者后續(xù)治療以進一步分析。

此外,在595例計數(shù)17號染色體著絲粒CEP17信號中發(fā)現(xiàn)平均CEP17拷貝數(shù)≥3信號/細胞者有128例(21.5%,28/595)。近年有研究顯示整條17號染色體的多體罕見,CEP17的增加并不能代表整條17號染色體多體,部分乳腺癌中存在HER-2基因與著絲粒的共擴增[20]。17號染色體的異常與乳腺癌的預后或靶向治療是否相關,尚未有明確報道,有待于進一步分析。

綜上所述,新舊兩版指南IHC與FISH法檢測HER-2蛋白表達與基因擴增結果均存在一致性,且兩者均呈正相關。新版指南結合HER-2/CEP17比值、平均HER-2拷貝數(shù)和IHC結果綜合評估,取消了FISH法檢測HER-2基因擴增的不確定結果,使其陰性率有所增加,為臨床提供了更完善的靶向治療依據(jù)。

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