劉 輝，楊菁茹，李元朋，蔡鳳梅，任雨潔，侯夢晨，夏益敏，王卉芳

三陰型乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)是指雌激素受體(estrogen receptor, ER)、孕激素受體(progesterone receptor, PR)及人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2, HER-2)均陰性的乳腺癌，由于其對內(nèi)分泌治療及靶向治療均不敏感，患者臨床治療預(yù)后差，迫切需要尋求新的有效治療措施。近年隨著黑色素瘤優(yōu)先表達(dá)抗原(preferentially expressed antigen of melanoma, PRAME)及程序性死亡配體-1(programmed death ligand-1, PD-L1)[1-5]等免疫治療不斷發(fā)展，免疫檢查點(diǎn)抑制劑相關(guān)藥物已獲批用于黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和腎細(xì)胞癌等實(shí)體性腫瘤的治療，也為TNBC患者的治療帶來希望。本文著重探討PRAME和PD-L1在TNBC中的表達(dá)，為TNBC患者的免疫治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2005年5月～2020年5月陜西省西安市第四醫(yī)院外科手術(shù)切除的乳腺癌標(biāo)本260例，所有病例均未行放、化療或其他針對腫瘤的治療，其中TNBC 46例，非TNBC 214例；另收集50例正常乳腺組織作為對照。

1.2 免疫組化每例選取2個(gè)具有代表性的區(qū)域制作組織芯片，每個(gè)微孔直徑均為2 mm。

免疫組化染色采用EnVision法，一抗PRAME(兔單克隆抗體，克隆號EPR20330，稀釋比1 ∶1 000)和PD-L1(兔多克隆抗體，克隆號28-8，稀釋比1 ∶100)購自美國Abcam公司。ER、PR、HER-2和Ki-67等，均購自福州邁新公司。具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。標(biāo)本均由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師重新閱片，并依據(jù)WHO(2014)乳腺腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類分級。

1.3 結(jié)果判斷PRAME以細(xì)胞核著色為陽性；PD-L1以腫瘤部分或全部細(xì)胞膜著色，陽性細(xì)胞數(shù)≥ 1%判定為陽性，不計(jì)免疫細(xì)胞數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用[n(%)]表示；組間總體分布趨勢比較，采用χ2檢驗(yàn)及Fisher精確概率法；兩兩比較采用Bonferrion矯正法；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特點(diǎn)46例TNBC患者年齡36～78歲，平均49歲，腫瘤最大徑0.6～4.8 cm，平均2.6 cm，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者37例；214例非TNBC患者年齡為28～75歲，平均41歲，腫瘤最大徑0.8～5.8 cm，平均3.2 cm，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者32例。

2.2 不同乳腺組織中PRAME的表達(dá)TNBC細(xì)胞多呈巢狀排列(圖1)，PRAME在TNBC組織中呈彌漫陽性(圖2)；非TNBC細(xì)胞呈巢狀或條索狀排列，間質(zhì)中可見淋巴細(xì)胞浸潤(圖3)，PRAME在非TNBC組織中呈彌漫陽性(圖4)。PRAME在TNBC組和非TNBC組中的陽性率分別為38.8%和41.3%，差異無顯著性(P>0.05)。PRAME在乳腺癌組和非乳腺癌組中的陽性率分別為39.2%和0，差異有顯著性(P<0.01)。PRAME在TNBC組和非TNBC組中的陽性率與非乳腺癌組相比，差異均有顯著性(P<0.01)。PRAME在乳腺癌中的表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性，TNBC組及非TNBC組中PRAME的表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性。

圖1 TNBC細(xì)胞呈巢狀排列伴壞死 圖2 TNBC中PRAME呈胞核彌漫陽性，EnVision法 圖3 非TNBC細(xì)胞呈巢狀及條索狀排列，間質(zhì)中見淋巴細(xì)胞浸潤 圖4 非TNBC中PRAME呈胞核陽性，EnVision法 圖5 TNBC細(xì)胞呈小巢狀排列 圖6 TNBC細(xì)胞中PD-L1呈陽性，EnVision法

2.3 不同乳腺組織中PD-L1的表達(dá)TNBC細(xì)胞呈小巢狀排列(圖5)， PD-L1在TNBC的腫瘤細(xì)胞中呈陽性(圖6)，PD-L1在TNBC和非TNBC組中的陽性率分別為37.0%和25.0%，差異有顯著性(P<0.05)。PD-L1在乳腺癌組及非乳腺癌組中的陽性率分別為27.3%和0，差異有顯著性(P<0.01)。PD-L1在TNBC組和非TNBC組中的陽性率與非乳腺癌組相比，差異均有顯著性(P<0.01)。PD-L1在乳腺癌中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與腫瘤大小無相關(guān)性，其中TNBC組和非TNBC組中PD-L1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)，與腫瘤大小均無相關(guān)性。

3 討論

TNBC患者復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率高，對內(nèi)分泌及靶向治療均不敏感，患者預(yù)后差，急需尋求新的有效治療方案。隨著免疫治療相關(guān)靶點(diǎn)如PRAME和PD-L1等臨床研究的開展，相關(guān)藥物相繼用于黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和腎細(xì)胞癌等實(shí)體性腫瘤的治療，并取得較為滿意的療效，也為TNBC患者的治療帶來希望。目前，PRAME和PD-L1在TNBC中的研究尚存在爭議，特別是不同克隆號的PD-L1試劑盒存在實(shí)驗(yàn)平臺及判讀標(biāo)準(zhǔn)的不一致，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異性。本實(shí)驗(yàn)分析PRAME及PD-L1在TNBC中的表達(dá)，為TNBC患者的免疫治療提供參考。

PRAME是腫瘤-睪丸抗原(cancer testis antigen, CTA)家族成員之一，最早由Ikeda從黑色素瘤細(xì)胞中分離而出，能夠被HLA-A24分子遞呈給細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes, CTL)。PRAME在正常組織中的表達(dá)僅限于睪丸、卵巢和腎上腺等，其是具有免疫原性的腫瘤相關(guān)抗原，在大多數(shù)血液系統(tǒng)惡性腫瘤及實(shí)體瘤中異常高表達(dá)[6-11]，在正常組織中表達(dá)的局限性及在腫瘤組織中的高表達(dá)，被認(rèn)為是腫瘤免疫治療理想的靶標(biāo)。目前，PRAME在TNBC中的表達(dá)報(bào)道較少，具體機(jī)制尚不清楚。Al-Khadairi 等[12]研究結(jié)果顯示，PRAME可以上調(diào)TNBC細(xì)胞中SNAI1/TCF4/TWIST1、FOXC2、IL1RN、MMP2、SOX10、WNT11、MMP3、PDGFRB和JAG1等基因及E-cadherin、N-cadherin、vimentin和ZEB1蛋白表達(dá)升高，從而促進(jìn)TNBC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移； Epping等[13]觀察295例乳腺癌中PRAME的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其與乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)，可作為乳腺癌不良預(yù)后的指標(biāo)。Doolan等[14]報(bào)道結(jié)果亦顯示在103例乳腺癌患者中，PRAME的表達(dá)與患者無瘤生存期低及不良預(yù)后呈正相關(guān)。Sun等[15]報(bào)道PRAME可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，下調(diào)PRAME的表達(dá)可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖并抑制其凋亡；即使在不同分型乳腺癌組織中PRAME的表達(dá)差異性也存在爭議，Curigliano等[16]報(bào)道PRAME和NY-ESO-1的CTA家族在不同分子分型的乳腺癌的增殖中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NY-ESO-1在TNBC中高表達(dá)，而PRAME在HER-2陽性的乳腺癌中陽性率為16%，在TNBC中呈陰性。Tessari 等[17]報(bào)道CTA家族中PRAME、MAGE-A3和NY-ESO-1在不同分子分型乳腺癌組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NY-ESO-1在TNBC組及非TNBC組間表達(dá)差異有顯著性，而PRAME和MAGE-A3在各組乳腺癌中表達(dá)差異無顯著性；PRAME在各組乳腺癌中的陽性率達(dá)85.7%～96.6%，在TNBC中的陽性率為85.7%，但未與正常乳腺組織進(jìn)行對比分析。本實(shí)驗(yàn)不僅分析了乳腺癌與正常乳腺組織中PRAME的表達(dá)差異，同時(shí)也分析了TNBC組與非TNBC組間PRAME表達(dá)的差異。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PRAME在TNBC組和非TNBC組中的陽性率分別為38.8%和41.3%，均高于正常乳腺組織，可作為乳腺癌免疫治療的靶點(diǎn)，但兩組之間差異無顯著性，TNBC及非TNBC組中PRAME的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性。

PD-L1是B7家族的跨膜蛋白，廣泛表達(dá)于免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞。PD-L1與PD-1結(jié)合后，下調(diào)淋巴細(xì)胞增殖及相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生，誘導(dǎo)免疫耐受，腫瘤細(xì)胞高表達(dá)PD-L1后利用該機(jī)制從而逃避免疫監(jiān)視，利用抗PD-1/PD-L1抗體阻斷PD-1/PD-L1途徑可以達(dá)到抗腫瘤效果。隨著以PD-1/PD-L1為靶點(diǎn)的免疫治療在非小細(xì)胞肺癌及惡性黑色素瘤等腫瘤治療中的應(yīng)用，其在乳腺癌特別是TNBC治療的研究廣泛開展。國外報(bào)道多集中于PD-L1在TNBC中的表達(dá)及其與預(yù)后的相關(guān)性，但由于檢測平臺、所用抗體及評判閾值的差異性，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致。Dill等[18]檢測245例原發(fā)性乳腺癌(其中32%為TNBC)及40例轉(zhuǎn)移性乳腺癌中PD-L1(克隆號SP142)的表達(dá)，結(jié)果顯示PD-L1在高級別乳腺癌及TNBC中陽性率更高；Rugo等[19]應(yīng)用SP142、22C3和SP263三個(gè)不同克隆號的PD-L1抗體對614例TNBC進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示陽性率分別為46%、81%和75%；黃述斌等[20]報(bào)道PD-L1(克隆號SP142)在乳腺癌組織中的陽性率為35.3%，在TNBC中的陽性率為61.9%，明顯高于非TNBC組。目前，PD-L1表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性研究存在爭議。Muenst 等[21]發(fā)現(xiàn)乳腺癌中PD-L1的表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、分期分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。Monneur等[22]也認(rèn)為PD-L1表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)，特別是在TNBC及基底細(xì)胞亞型中陽性率更高。文獻(xiàn)報(bào)道[23-24]PD-L1表達(dá)是乳腺癌患者預(yù)后的積極因素。現(xiàn)階段PD-L1不同克隆號采用的不同檢測平臺及評判標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致結(jié)論可能存在差異。本實(shí)驗(yàn)采用PD-L1(克隆號28-8)抗體，結(jié)果顯示其在TNBC及非TNBC中的陽性率分別為37%和25%，在乳腺癌及正常乳腺組織中的陽性率分別為27.3%和0，在乳腺癌中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分級呈正相關(guān)。盡管PD-L1的表達(dá)尚存爭議，但并不影響抗PD-L1藥物在乳腺癌特別是TNBC治療中的臨床研究?？筆D-L1藥物臨床研究集中在Atezolizumab、Avelumab和Durvalumab，研究顯示雖然抗PD-1/ PD-L1藥物對TNBC具有一定緩解作用，但其作用并不理想，應(yīng)進(jìn)行免疫治療聯(lián)合放、化療等治療方案，以期獲得更好的療效。文獻(xiàn)報(bào)道[25-29]顯示，聯(lián)合免疫治療、放化療比單獨(dú)應(yīng)用免疫治療能夠獲得更高的腫瘤緩解率，死亡風(fēng)險(xiǎn)明顯降低。

綜上所述，以PRAME和PD-L1等靶點(diǎn)的免疫治療為TNBC的治療帶來新希望。目前，其作用機(jī)制尚不清楚。不同克隆號PD-L1采用的檢測平臺及結(jié)果評判標(biāo)準(zhǔn)存在差異，導(dǎo)致分析結(jié)果有差異，免疫治療聯(lián)合放療或化療能夠顯著提高患者的腫瘤緩解率。另外，還需積累更多病例進(jìn)一步分析其最佳的聯(lián)合治療方案及降低患者不良反應(yīng)。