殷岳杉 阮安民 劉夢玉 馬佳音 白鵬△

膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee Osteoarthritis，KOA)是臨床常見的以膝關(guān)節(jié)軟骨破壞為主要特性的退行性骨關(guān)節(jié)疾病。其病變過程累積整個(gè)膝關(guān)節(jié)，包括軟骨、軟骨下骨、滑膜及周圍韌帶等軟組織結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為全方位、多層次、不同程度的慢性炎癥[1]。然而目前其病因病機(jī)并不清楚，之前研究認(rèn)為軟骨損傷是KOA的病因也是導(dǎo)致KOA的病理結(jié)果，近些年來隨著研究的不斷深入，滑膜炎癥在KOA病變過程中的作用逐漸被認(rèn)識，而且滑膜炎癥可能作為KOA病變的使動(dòng)因素[2]。我們知道關(guān)節(jié)滑液主要由滑膜組織分泌，當(dāng)滑膜發(fā)生炎癥病變時(shí)關(guān)節(jié)滑液中透明質(zhì)酸(HA)和潤滑素等成分都會(huì)降低，這些改變會(huì)對軟骨產(chǎn)生不利影響[3]。而在KOA進(jìn)展過程中，滑膜炎癥也會(huì)導(dǎo)致大量炎性因子及金屬蛋白酶等分解酶的產(chǎn)生，進(jìn)一步促進(jìn)軟骨基質(zhì)的降解[4]。在疾病發(fā)展過程中許多OA患者關(guān)節(jié)滑膜表現(xiàn)出非感染性慢性炎癥的特征，但目前關(guān)于OA滑膜炎的原因仍存在爭議[5]。前期臨床研究結(jié)果表明電針療法對于KOA效果顯著[6]，然而其具體的作用機(jī)理有待于進(jìn)一步探討。因此本研究采用電針療法對模型兔進(jìn)行干預(yù)，并采用RT-PCR法及Western Blot法對兔滑膜樣本中TLR4/NF-κB信號通路的主要成分進(jìn)行檢測，旨在從分子生物學(xué)層面探求電針治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，明確電針治療KOA的特異性作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康6個(gè)月齡新西蘭大白兔44只，雌雄各半，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由北京金牧陽實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司提供(許可證號為SCXK(京)2015-0005)，飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物試驗(yàn)中心。所有家兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分成6組，其中空白組4只，假手術(shù)組、模型1組、模型2組、電針1組、電針2組每組8只。其中空白組雙膝取材，其余各組左側(cè)膝關(guān)節(jié)取材。在實(shí)驗(yàn)過程中，對動(dòng)物的處置經(jīng)過北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)，并嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》福利倫理執(zhí)行。

1.2 主要試劑及儀器

TRNzol總RNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司提供；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)，ROX plus，DL2000 DNA Marker，由TaKaRa公司提供；TLR4、NF-κB及MyD88，美國Abcam公司提供；二抗及NC膜(0.45 μm)，由美國Millipore公司提供。離心機(jī)，德國Eppendorf公司；分光光度計(jì)，美國Therno scientific公司；熒光定量PCR儀，美國Applied Biosystems公司；Fresco低溫冷凍離心機(jī)，美國Thermo公司；濕轉(zhuǎn)電泳槽，Cavoy公司；電泳儀，美國Bio-Rad公司。

1.3 模型制備

造模組：模型1組、模型2組、電針1組、電針2組采用改良Hulth法制備動(dòng)物左膝KOA模型[7]，術(shù)后不固定患肢，驅(qū)趕動(dòng)物縮短造模時(shí)間。其中模型1組與電針1組造模時(shí)間為2周，模型2組與電針2組造模時(shí)間為4周。術(shù)后肌注慶大霉素注射液3 d(0.125 mL/kg)，1次/d抗感染。假手術(shù)組：與造模組相同方法入路切開皮膚及關(guān)節(jié)囊進(jìn)入關(guān)節(jié)腔，生理鹽水沖洗后逐層縫合關(guān)節(jié)囊及皮膚，以排除手術(shù)因素的干擾?？瞻捉M：正常飼養(yǎng)，不作任何處理。

1.4 術(shù)后干預(yù)

1.4.1取穴 選取KOA兔膝關(guān)節(jié)周圍穴位：陽陵泉、陰陵泉、內(nèi)膝眼、犢鼻、梁丘、血海等穴參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]與《動(dòng)物針灸學(xué)》[9]，并結(jié)合動(dòng)物比較學(xué)方法，根據(jù)比較解剖取穴法并結(jié)合模擬骨度分寸取穴法，選取兔膝關(guān)節(jié)周圍上述腧穴進(jìn)行治療。

1.4.2治療 電針組：選取“內(nèi)膝眼”“犢鼻穴”“陰陵泉”“陽陵泉”“血?！奔啊傲呵稹毖ǎ煤玲樳M(jìn)行針刺，直刺約5 mm。采用英迪脈沖針灸治療儀進(jìn)行電針治療，選取兩組電針，一組“正極：梁丘，負(fù)極：血海”、另一組“正極：犢鼻穴，負(fù)極：內(nèi)膝眼”。疏密波，強(qiáng)度1～2 mA，以兔下肢微微抖動(dòng)為度，每次20 min。電針1組造模2周后給予電針干預(yù)，電針2組造模4周后給予電針干預(yù)，隔日治療1次，每周治療3次，共治療4周。

1.5 取材處理

各組在造模結(jié)束或治療結(jié)束后分批取材，3%戊巴比妥鈉水溶液麻醉后，局部常規(guī)消毒，以造模時(shí)原切口路入。切開皮膚、皮下組織，打開關(guān)節(jié)腔，分離剔取滑膜，迅速裝入相應(yīng)分組標(biāo)記的EP管內(nèi)，及時(shí)投入液氮冷凍，后保存于-80 ℃冰箱凍存待檢，用于實(shí)時(shí)PCR和Western Blot檢測。

1.6 檢測方法及指標(biāo)

1.6.1實(shí)時(shí)PCR檢測各組滑膜中TLR4、NF-κB、MyD88的mRNA表達(dá)水平 將滑膜組織勻漿后，采用Trizol總RNA提取試劑進(jìn)行樣本RNA提取，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，2 μL cDNAA為模板擴(kuò)增TLR4、NF-κB、MyD88及ACTIN，具體步驟按照說明書進(jìn)行。所用引物序列見表1.

表1 TLR4、NF-κB 及MyD88引物序列設(shè)計(jì)

1.6.2Western Blot測定滑膜中TLR4、NF-κB、MyD88的蛋白表達(dá) BCA蛋白定量后，每孔上樣30 μg，SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶室溫下封閉2 h，然后分別加入一抗在4 ℃過夜孵育，TBST洗滌5 min×4次，加入相應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，再用TBST洗滌5 min×4次，ECL發(fā)光試劑盒顯影，Bio-Rad熒光掃描儀掃描顯像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)PCR檢測

各組TLR4、NF-κB、MyD88的mRNA表達(dá)結(jié)果見表2。模型組1、2中TLR4、NF-κB及MyD88的mRNA表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；電針1組及電針2組中TLR4、NF-κB及MyD88的mRNA表達(dá)水平顯著低于與其對應(yīng)的模型1組和模型2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型2組與模型1組比較TLR4、NF-κB及MyD88的mRNA表達(dá)水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組兔關(guān)節(jié)滑膜中TLR4、NF-κB、MyD88的mRNA表達(dá)水平

2.2 Western Blot檢測

各組滑膜中TLR4、NF-κB、MyD88蛋白表達(dá)見表3。模型組1、2中TLR4、NF-κB及MyD88的蛋白表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；電針1組及電針2組中TLR4、NF-κB及MyD88的蛋白表達(dá)水平顯著低于與其對應(yīng)的模型1組和模型2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型2組與模型1組比較，TLR4、NF-κB及MyD88的蛋白表達(dá)水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組兔關(guān)節(jié)滑膜中TLR4、NF-κB、MyD88的蛋白表達(dá)水平

3 討論

3.1 滑膜炎癥在KOA病變過程中的重要作用

KOA是臨床中常見的肌肉骨骼疾病，臨床發(fā)病率較高，35%以上中年人受到其困擾，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量[10]。本病的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，因此還沒有一種方法能夠從根本上逆轉(zhuǎn)KOA的病理進(jìn)程，當(dāng)前的治療方式主要為對癥治療，并且存在一定的副作用。以往的研究結(jié)果認(rèn)為軟骨損傷是KOA發(fā)病的主要病理機(jī)制，隨著研究的逐漸深入滑膜炎癥在KOA病理和臨床中扮演的角色逐漸被認(rèn)識，現(xiàn)在已經(jīng)知道在許多KOA患者的疾病發(fā)展過程中關(guān)節(jié)滑膜表現(xiàn)出非感染性慢性炎癥的特征[11]?；ぱ装Y與疼痛和關(guān)節(jié)功能障礙程度密切相關(guān)，炎癥狀態(tài)下滑膜分泌的關(guān)節(jié)液含有大量的細(xì)胞因子和趨化因子，加速軟骨細(xì)胞損傷及細(xì)胞外基質(zhì)的分解，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)退變發(fā)生[12]。被破壞的細(xì)胞外基質(zhì)及脫落的碎片進(jìn)入關(guān)節(jié)腔，刺激滑膜導(dǎo)致炎癥進(jìn)一步擴(kuò)大化，促進(jìn)炎性介質(zhì)釋放進(jìn)入滑液，這些介質(zhì)亦可誘發(fā)滑膜血管生成、激活細(xì)胞因子和關(guān)節(jié)軟骨表面的MMPs，加重軟骨的退變，進(jìn)一步破壞關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境，從而形成惡性循環(huán)[13]。

大量研究表明無論是在OA疾病的早期或末期都伴有滑膜炎癥的存在，并且通過關(guān)節(jié)鏡、MRI和超聲檢測到的滑膜炎進(jìn)展程度可以作為評價(jià)OA病變嚴(yán)重程度的指標(biāo)[14]。這與中醫(yī)的筋骨理論相一致，滑膜屬于軟組織，屬于中醫(yī)經(jīng)筋的范疇。當(dāng)肌肉過度收縮的時(shí)候，產(chǎn)生的應(yīng)力沿經(jīng)筋進(jìn)行傳導(dǎo)，引起膝周的軟組織損傷，即“筋傷”。膝周軟組織損傷導(dǎo)致力學(xué)失衡，進(jìn)而誘發(fā)滑膜炎癥?；ぱ装Y與軟骨損傷之間形成惡性循環(huán)，這是一個(gè)由筋及骨的傳變過程，筋傷而骨損，骨損進(jìn)一步加重筋傷。因此在臨床治療上抑制滑膜炎癥反應(yīng)對于治療KOA具有重要意義。

3.2 TLRs/NF-κB信號通路介導(dǎo)的滑膜炎癥反應(yīng)是促進(jìn)KOA滑膜炎的關(guān)鍵環(huán)節(jié)

TLRs是固有免疫系統(tǒng)中一類重要的模式識別受體(PRRs)，廣泛參與病原相關(guān)分子模式(PAMPs)或內(nèi)源性危險(xiǎn)信號相關(guān)分子模式(DAMPs)的感知，誘導(dǎo)多種促炎性因子合成和釋放，引發(fā)或加重炎癥[15]。DAMPs包括分布于KOA滑液中的小分子量透明質(zhì)酸、纖維連接蛋白、細(xì)胞粘合素C、高遷移率族蛋白B1(S100 proteins，HMGB-1)等內(nèi)源性物質(zhì)，這些內(nèi)源性物質(zhì)來源于無菌性組織損傷或細(xì)胞應(yīng)激導(dǎo)致降解的細(xì)胞外基質(zhì)[16-18]。激活的TLRs/NF-κB信號通路最終通過活化轉(zhuǎn)錄因子AP-1，進(jìn)而啟動(dòng)IL-1β等一系列促炎性因子基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[19]。釋放至胞外的IL-lβ通過與IL-1受體結(jié)合激活I(lǐng)L-1信號通路和TLRs /NF-κB信號通路，募集炎性細(xì)胞、刺激滑膜細(xì)胞增殖、促進(jìn)滑膜血管生成，釋放更多的炎性因子及蛋白酶進(jìn)入關(guān)節(jié)，發(fā)生炎癥級聯(lián)放大效應(yīng)[20]，使KOA炎癥反應(yīng)持續(xù)，進(jìn)一步加重KOA病變進(jìn)程。因此，KOA滑膜固有免疫應(yīng)答通過DAMPs/TLRs/NF-κB信號通路激活KOA滑膜炎癥反應(yīng)，是KOA可能的發(fā)病機(jī)制。

3.3 電針治療KOA的作用機(jī)制

臨床研究證實(shí)電針能夠通過緩解疼痛、改善關(guān)節(jié)功能、增強(qiáng)肌力從而達(dá)到治療KOA的目的[6]。然而電針治療KOA的具體作用機(jī)制有待研究，劉苗苗等[21]發(fā)現(xiàn)電針能夠通過降低KOA大鼠滑膜組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)的高表達(dá)，達(dá)到緩解疼痛、消腫的目的。王道海等[22]發(fā)現(xiàn)電針能夠通過上調(diào)堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)的表達(dá)促使KOA大鼠關(guān)節(jié)損傷軟骨的修復(fù)。本研究從滑膜炎癥角度出發(fā)，探討電針對于TLRs/NF-κB信號通路介導(dǎo)的滑膜炎癥的干預(yù)作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TLR4、NF-κB及MyD88三種指標(biāo)在實(shí)驗(yàn)過程中變化趨勢基本一致，在兩模型組中mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組，說明TLR4、NF-κB及MyD88的mRNA及蛋白的表達(dá)在滑膜炎癥中呈現(xiàn)特異性增加的趨勢；在電針1組與電針2組中mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著高于模型1組和模型2組，說明電針治療可以抑制TLR4、NF-κB及MyD88的mRNA及蛋白的表達(dá)；模型2組與模型1組比較TLR4、NF-κB及MyD88的mRNA及蛋白表達(dá)水平升高，說明隨著造模時(shí)間的延長，TLR4、NF-κB及MyD88的mRNA及蛋白表達(dá)水平呈上調(diào)的趨勢；而電針1組與電針2組的表達(dá)趨勢未出現(xiàn)明顯差異，說明電針對KOA不同時(shí)期模型的TLR4、NF-κB及MyD88的mRNA及蛋白表達(dá)均具有調(diào)控作用。

綜上所述，電針可以通過調(diào)控TLRs /NF-κB信號通路介導(dǎo)的滑膜炎癥反應(yīng)達(dá)到治療KOA的目的。