紀(jì)旭陽， 張 楊， 梁福鑫

（1. 航天特種材料及工藝技術(shù)研究所，北京 100074；2. 清華大學(xué)化學(xué)工程系，高分子研究所，北京 100084）

Janus材料的不對稱結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成使其呈現(xiàn)出獨特性能[1-5]。具有中心對稱結(jié)構(gòu)的Janus籠，其內(nèi)外表面化學(xué)組分有著嚴(yán)格的分區(qū)，因此可以利用表面浸潤性差異對目標(biāo)物質(zhì)進行選擇性富集[6]。Chen等[7]將具有溫度響應(yīng)性的聚合物接枝于Janus籠內(nèi)部，通過調(diào)節(jié)環(huán)境溫度，實現(xiàn)了對油溶性物質(zhì)的富集以及可控釋放。Zhao等[8]以pH響應(yīng)性聚合物Janus籠作為藥物載體，在不同的pH條件下，實現(xiàn)了油溶性藥物阿霉素（DOX）的可控裝載及釋放。

相較于有機聚合物，無機物殼層的Janus籠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及生物惰性更好。本文對磁性顆粒內(nèi)外表面進行了改性，分別將具有良好靶向性的葉酸基團[9,10]和具有pH響應(yīng)性的聚合物[11,12]接枝于介孔殼層的內(nèi)外表面，通過調(diào)節(jié)環(huán)境的pH實現(xiàn)對油溶性物質(zhì)的選擇性富集和釋放。根據(jù)前期工作[13]，我們制備了磁性介孔二氧化硅（Fe3O4@mSiO2）顆粒，進一步通過溶膠-凝膠反應(yīng)在表面接枝羧基基團，再通過羧基與氨基的縮合反應(yīng)將具有良好靶向性的葉酸（FA）修飾的聚乙二醇（PEG-FA）接枝于Fe3O4@mSiO2外側(cè)，得到了Fe3O4@mSiO2@PEGFA顆粒。抽提除去制孔模板十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）后，利用稀鹽酸對Fe3O4內(nèi)核進行部分刻蝕，得到Y(jié)olk-Shell結(jié)構(gòu)的磁性Janus籠。通過帶雙鍵的硅烷偶聯(lián)劑對介孔二氧化硅殼層內(nèi)側(cè)進行改性后，利用自由基聚合在二氧化硅殼層內(nèi)側(cè)接枝聚甲基丙烯酸二乙氨基酯（PDEAEMA），得到外側(cè)是PEG-FA修飾、內(nèi)側(cè)是PDEAEMA修飾的pH-磁雙響應(yīng)Janus籠。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

三氯化鐵（FeCl3·6H2O）、乙二醇、正硅酸乙酯（TEOS）、聚乙二醇（PEG）、乙酸鈉（CH3COONa）、CTAB、鹽酸阿霉素（DOX·HCl）：分析純，國藥試劑公司；甲基丙烯酸二乙氨基酯（DEAEMA）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）：化學(xué)純，TCI公司；偶氮二異丁腈（AIBN）：化學(xué)純，百靈威公司；氨基聚乙二醇葉酸（NH2-PEG-FA）：分析純，Mn, PEG=5.0×103，西安凱新生物科技有限公司；三乙氧基硅基丙基馬來酸：w=95%，Sigma-Aldrich公司；3-（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（MPS）：w=95%，Alfa Aesar試劑公司。

1.2 測試與表征

掃描電鏡（SEM）：樣品經(jīng)冷凍干燥后真空鍍鉑，通過Hitachi S-4800型場發(fā)射掃描電鏡觀察微觀形貌，加速電壓15 kV；透射電鏡（TEM）：樣品經(jīng)乙醇分散后滴于超薄碳膜，干燥后通過JEOL-JEM-100 CX 型透射電鏡對其結(jié)構(gòu)進行觀察，加速電壓100 kV；傅里葉紅外光譜（FT-IR）：Bruker Equinox 55 FT-IR型紅外光譜儀；熱失重分析（TGA）：PerkinElmer Pyris 1型TGA儀，空氣氣氛，升溫速率為10 ℃/min；激光共聚焦顯微鏡（CLSM）：激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS-sp 2）；紫外-可見光譜（UV-Vis）：普析通用TU 1901型。

1.3 實驗步驟

1.3.1 Fe3O4@mSiO2顆粒的制備將2.36 g FeCl3·6H2O，1.75 g PEG（Mw=2.0 × 104），3.14 g CH3COONa加入到70 mL乙二醇中，在水熱釜中200 ℃下反應(yīng)8 h后洗滌3次，得到黑色Fe3O4納米顆粒（Fe3O4NPs）。取0.3 g Fe3O4NPs，0.45 g CTAB加入到525 mL去離子水中并使其完全分散。隨后依次加入25 mL乙酸乙酯和15 mL氨水（w=30%），超聲2 h后加入0.525 g TEOS，室溫下反應(yīng)8 h后，在磁場下將產(chǎn)物分離，洗滌3次后真空干燥，得到黑色Fe3O4@mSiO2顆粒。

1.3.2 PEG-FA修飾的磁性介孔二氧化硅（Fe3O4@mSiO2@PEG-FA）顆粒的制備取100 mg Fe3O4@mSiO2顆粒分散于50 mL乙醇中，隨后向其中加入50 mg三乙氧基硅基丙基馬來酸，70 ℃下反應(yīng)12 h后，磁場下使產(chǎn)物分離，用乙醇洗3次后真空干燥，得到羧基修飾的磁性介孔二氧化硅（Fe3O4@mSiO2@-COOH）顆粒。取100 mg Fe3O4@mSiO2@-COOH顆粒分散于50 mL DMSO中，加入20 mg EDC和20 mg NHS，室溫攪拌24 h。隨后加入20 mg NH2-PEG-FA，室溫攪拌24 h，得到Fe3O4@mSiO2@PEG-FA顆粒。

1.3.3 pH-磁雙響應(yīng)Janus籠的制備取100 mg Fe3O4@mSiO2@PEG-FA顆粒分散于20 mL無水乙醇中，加入1 mL 2 mol/L鹽酸后在70 ℃下反應(yīng)2 h，對Fe3O4內(nèi)核進行部分刻蝕，得到蛋黃-蛋殼結(jié)構(gòu)Janus籠。隨后將Janus籠分散于乙醇中，向其中加入一定量的MPS，70 ℃下反應(yīng)12 h后在磁場下使產(chǎn)物分離，洗滌3次后真空干燥，得到外側(cè)是PEG-FA修飾，內(nèi)側(cè)是雙鍵修飾的Janus籠。取上述Janus籠20 mg分散于10 mL甲苯中，再加入5 mg AIBN和20 mg DEAEMA，氮氣氣氛70 ℃下反應(yīng)8 h，得到外側(cè)是PEG-FA，內(nèi)側(cè)是PDEAEMA修飾的pH-磁雙響應(yīng)Janus籠（圖（1））。

圖1 pH-磁雙響應(yīng)Janus籠的合成：（a）外側(cè)修飾羧基的Fe3O4@mSiO2顆粒；（b）外側(cè)由PEG-FA基團修飾的“蛋黃-蛋殼”結(jié)構(gòu)磁性Janus籠；（c）pH-磁雙響應(yīng)Janus籠Fig. 1 Preparation of pH and magnetic responsive Janus cages: （a）Fe3O4@mSiO2 particles with carboxyl modified on external surface;（b）Magnetic “yolk-shell” Janus cages with PEG-FA groups modified on external surface; （c）pH and magnetic responsive Janus cages

1.3.4 pH-磁雙響應(yīng)Janus籠的載藥實驗在20 mL一定濃度DOX·HCl的DMF溶液中加入0.05 g三乙胺，室溫下攪拌12 h。將20 mg pH-磁響應(yīng)Janus籠加入到20 mL DMF中，分散后在前述DOX溶液中攪拌12 h。分離后加入pH為7.4的PBS緩沖溶液重新分散。測定其在480 nm處的熒光強度，進一步利用DOX的釋放標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到DOX的濃度，載藥率（E）公式為：

其中：mDrug為DOX的裝載質(zhì)量；mCages為Janus籠的質(zhì)量。

1.3.5 DOX的體外釋放將裝載了DOX的Janus籠分別分散于pH為7.4和6.5 的PBS，以及pH為5.5的醋酸緩沖溶液中。Janus籠的質(zhì)量濃度為1 mg/mL，放入15 mL PBS或醋酸緩沖溶液中，37 ℃下勻速攪拌。每隔一段時間，取樣5 mL進行熒光強度檢測，同時補充5 mL相應(yīng)溶液，以保持液體總量不變。釋放量（Er）公式為：

其中：mDOX為Janus籠中DOX的質(zhì)量；cn為第n個樣品的DOX濃度；樣品溶液的原始體積V0為20 mL；Ve為每次取樣溶液的體積，Ve=5 mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe3O4@mSiO2顆粒的表征

圖2為Fe3O4納米顆粒的SEM及TEM照片。結(jié)果顯示：所制備顆粒尺寸較為均一，約為200 nm（圖2（a, b））。以CTAB為制孔模板，在Fe3O4納米顆粒表面覆蓋一層介孔二氧化硅，得到的Fe3O4@mSiO2顆粒介孔層厚度約為20 nm（圖2（c, d））。Fe3O4納米顆粒以及Fe3O4@mSiO2顆粒的XRD表征結(jié)果見圖3，兩種樣品顆粒晶型均與PDF-2標(biāo)準(zhǔn)卡片89-0691一致。

2.2 Fe3O4@mSiO2@PEG-FA顆粒的表征

由圖4中改性前的Fe3O4@mSiO2顆粒，與改性后的Fe3O4@mSiO2@-COOH顆粒的FT-IR譜圖可見，改性后，1700 cm?1處出現(xiàn)了―COOH的紅外特征峰。Fe3O4@mSiO2@PEG-FA的FT-IR圖中，1700 cm?1處的羧基特征峰顯著增強。同時，UV-Vis光譜對FA的接枝表征結(jié)果顯示（圖5），F(xiàn)e3O4@mSiO2@PEG-FA顆粒在277 nm處出現(xiàn)了FA的紫外特征吸收峰。TGA的結(jié)果顯示（圖6），PEG-FA的接枝量為2.5%。

圖2 Fe3O4納米顆粒的（a）SEM和（b）TEM照片；Fe3O4@mSiO2顆粒的（c）SEM和（d）TEM照片F(xiàn)ig. 2 （a）SEM and （b） TEM images of Fe3O4 NPs; （c）SEM and （d）TEM images of Fe3O4@mSiO2 particles

圖3 樣品的XRD光譜Fig. 3 XRD patterns of samples

圖4 樣品的FT-IR譜圖Fig. 4 FT-IR spectra of samples

圖5 樣品的UV-Vis曲線Fig. 5 UV-Vis curves of samples

圖6 樣品的TGA曲線Fig. 6 TGA curves of samples

2.3 Janus籠的表征

圖7為Janus籠的SEM和TEM照片。鹽酸乙醇溶液刻蝕之后，磁性介孔二氧化硅顆粒的外部形貌（圖7（a））得以保持，而內(nèi)部（圖7（b, c））因部分Fe3O4內(nèi)核被刻蝕出現(xiàn)空腔，且保持了原有的磁性。

圖7 Janus籠的 （a）SEM和 （b, c）TEM照片F(xiàn)ig. 7 （a） SEM and （b, c）TEM images of the Janus cages

FT-IR數(shù)據(jù)證明Janus籠在1550 cm?1處出現(xiàn)了PDEADMA的特征峰（圖4）。圖6中的TGA結(jié)果顯示，PDEADMA的接枝量為39.2%。利用PMMA對Janus籠進行包埋，在室溫下對樣品進行超薄切片，其切片樣品的TEM表征結(jié)果見圖8。結(jié)果顯示，PDEAEMA完全接枝于Janus籠內(nèi)側(cè)。

圖8 接枝PDEAEMA（a）前、（b）后的Janus 籠的TEM照片F(xiàn)ig. 8 TEM images of Janus cages （a）before and （b） after grafting the PDEAEMA

2.4 Janus籠的pH響應(yīng)性

Janus籠具有pH響應(yīng)性。在水中加入一定量的正己烷，其中加入少量油溶性染料Dil-C18，以便區(qū)分油水兩相（圖9（a1））。然后，向該兩相體系中加入一定量Janus籠，通過加入少量的NaOH溶液調(diào)節(jié)體系pH至8（圖9（a2））。在此條件下，Janus籠內(nèi)側(cè)的PDEAEMA由于去質(zhì)子化而表現(xiàn)疏水狀態(tài)，從而可實現(xiàn)Janus籠對正己烷的選擇性富集（圖9（a3））。通過加入少量的鹽酸，調(diào)節(jié)體系的pH至5，由于Janus籠內(nèi)側(cè)的PDEAEMA在該條件下表現(xiàn)出親水性，被富集裝載在空腔內(nèi)的正己烷則被釋放（圖9（a4））。

Janus籠在pH=8時從水中選擇性富集正己烷，在激光共聚焦顯微鏡下，裝載了正己烷的Janus籠呈綠色（圖9（b）），而當(dāng)pH=5時，Janus籠的熒光消失（圖9（c）），說明正己烷被釋放出Janus籠。

2.5 Janus 籠的載藥實驗

不同DOX濃度下Janus 籠的載藥率見表1。在一定范圍內(nèi)，Janus 籠中空球載藥率隨著DOX含量的增加而升高，而當(dāng)DOX含量增加到一定程度后，載藥率趨于穩(wěn)定。

Janus籠分別在pH=5.5，6.5，7.4的環(huán)境下對DOX的釋放曲線見圖10。當(dāng)pH=5.5時，DOX釋放量可占到載藥量的75%；當(dāng)pH=6.5時，DOX釋放量下降，約為58%；而當(dāng)pH=7.4時，DOX釋放量最少，約為35%。相較于正常生理體系的中性環(huán)境，處于癌癥病變的生理體系呈弱酸性，由此證明，所制備pH-磁響應(yīng)性Janus籠在正常生理環(huán)境下藥物釋放較少，而在癌癥病變的弱酸性環(huán)境下，可實現(xiàn)響應(yīng)性藥物釋放。

圖9 Janus籠的pH響應(yīng)性：（a1）正己烷（上層）-水（下層）兩相體系，正己烷中加入顯色劑dil-C18；（a2）在pH=8條件下加入20 mg Janus籠；（a3）正己烷因被Janus籠富集而從水相中分離；（a4）在pH=5條件下，Janus籠將正己烷釋放；（b）在pH=8條件下，裝載了正己烷的Janus籠和（c）在pH=5條件下，Janus籠將正己烷釋放后的激光共聚焦顯微鏡照片F(xiàn)ig. 9 pH responsive of the Janus cage:（a1）Immiscible mixture of hexane （top） and water（bottom）, dil-C18 was added in hexane as the chromogenic agent；（a2）after adding the Janus cage in the mixture under stirring at pH 8; （a3）magnetic collection of the Janus cage at pH 8; （a4）triggered release of hexane from the Janus cage at pH 5; fluorescence microscopy images of （b） the Janus cage filled with hexane at pH 8 and （c） after release of oil at pH 5

表1 不同DOX含量下Janus籠的載藥率Table 1 Drug loading capacity of Janus cages at different content of DOX

圖10 裝載DOX的Janus籠的藥物釋放曲線Fig. 10 Drug release profiles of DOX-loaded Janus cages

3 結(jié) 論

（1）親水基團PEG-FA和響應(yīng)性的聚合物PDEAEMA分別修飾于Fe3O4@mSiO2顆粒介孔內(nèi)外表面，得到了Janus籠。

（2）Janus籠可實現(xiàn)對油溶性物質(zhì)的選擇性富集及可控釋放。

（3）在弱堿性條件下實現(xiàn)了Janus籠對油溶性藥物DOX的裝載。

（4）初步驗證了Janus籠在靶向藥物輸送及腫瘤區(qū)域可控釋藥領(lǐng)域應(yīng)用的可行性。