◎ 呂田華，李苗苗，楊英男，王 琳，劉 陽，姚冰鈺，李 黎，杜麗霞，應(yīng)小川

（1.天津天獅學(xué)院，天津 301700；2.天津市韻尼科技有限公司，天津 300000）

葡萄柚又名西柚，是一種蕓香科柑橘，屬小喬木，原產(chǎn)于美國，現(xiàn)在我國南方各省均有栽培[1]。柚皮占整個(gè)柚子的43%～48%，含有水分、維生素、礦物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)、精油和纖維素等，柚皮精油具有祛痰、止咳、去除自由基、抗菌等作用。但柚皮常作為垃圾處理，不僅浪費(fèi)而且對(duì)環(huán)境造成污染，因此，對(duì)柚皮綜合利用給社會(huì)產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益[2]。

本實(shí)驗(yàn)為了準(zhǔn)確評(píng)價(jià)葡萄柚皮精油清除DPPH自由基的能力[3]，測(cè)定葡萄柚皮精油與DPPH自由基反應(yīng)平衡時(shí)所需的時(shí)間；以IC50為評(píng)價(jià)指標(biāo)測(cè)定不同濃度下，葡萄柚皮精油對(duì)DPPH自由基清除率的影響；研究了葡萄柚皮精油對(duì)革蘭氏陽性菌枯草桿菌、革蘭氏陰性菌大腸桿菌的抑菌作用[4-6]，為葡萄柚皮精油工廠化提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

葡萄柚：市售；菌種：大腸桿菌、枯草桿菌，均由天津天獅學(xué)院生物與食品工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑及設(shè)備

DPPH（分析純）：北京路橋技術(shù)股份有限公司；BHT試劑、乙醇溶液均為分析純：國藥集團(tuán)有限公司；瓊脂粉、蛋白胨、酵母浸膏（均為生化試劑）：科泰生物制品有限公司。

XJA-110A高速粉碎機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、數(shù)顯式恒溫水浴鍋、磁力攪拌加熱電熱套、PL403電子天平、UV紫外可見分光光度計(jì)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、TD5K-Ⅲ低速離心機(jī)、SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄柚皮精油的提取

采用水蒸氣蒸餾法提取葡萄柚皮精油：將新鮮的葡萄柚皮清洗、晾干、切成4 mm×4 mm大小的塊狀，置于蒸餾燒瓶中，以料液比1∶20加入蒸餾水，100 ℃，蒸餾提取2 h，直至無油狀物質(zhì)餾出，用無水硫酸鈉吸附精油中的水分，密封，置于冰箱中備用。

1.3.2 葡萄柚皮精油提取率測(cè)定

準(zhǔn)確稱取已前處理的新鮮葡萄柚皮，按1.3.1方法提取出葡萄柚皮精油，按照公式（1）計(jì)算葡萄柚皮精油提取率：

1.3.3 葡萄柚皮精油DPPH自由基清除率的測(cè)定

（1）溶液配制。①DPPH溶液配制。精確稱取DPPH粉末，用70%乙醇完全溶解，搖勻，定容，配制成0.06 mol·L-1的DPPH溶液，得到DPPH貯備液，置于冰箱中冷藏備用。②BHT溶液。準(zhǔn)確稱量BHT粉末8 mg，用溶解，搖勻，定容，配制成質(zhì)量濃度為80 mg·L-1的BHT溶液，冷藏備用。

（2）不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除能力的影響。為測(cè)定葡萄柚皮精油對(duì)DPPH自由基隨時(shí)間的變化規(guī)律，分別選用20 μL和60 μL葡萄柚皮精進(jìn)行測(cè)試。向已知試管中分別加入20 μL和60 μL葡萄柚皮精油，DPPH溶液0.6 mL，再加70%乙醇至0.3 mL，搖勻，每隔2 min在波長515 nm下測(cè)定吸光度，記錄吸光度值；用同樣的方法，向試管中加入DPPH溶液0.6 mL，BHT溶液100 μL，蒸餾水900 μL，搖勻，每隔2min在波長515 nm下測(cè)定吸光度，記錄吸光度值。

（3）葡萄柚皮精油對(duì)DPPH自由基清除率的測(cè)定。向試管中加入0.6 mL DPPH溶液和0.3 mL葡萄柚皮精油，用0.1 mL70%乙醇，搖勻，避光反應(yīng)1 h后，在515 nm處測(cè)定A1值。以0.4 mL 70%乙醇溶液、0.6 mL 0.06 mol·L-1DPPH溶液反應(yīng)后為空白對(duì)照A0，利用公式（2）計(jì)算DPPH自由基清除率，并繪制葡萄柚皮精油、BHT與DPPH自由基清除率工作曲線，計(jì)算半數(shù)清除率IC50值。

1.3.4 葡萄柚皮精油抑菌活性研究

（1）菌懸液的制備。將大腸細(xì)菌、枯草桿菌菌種接種于瓊脂斜面后，37 ℃，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，用無菌水，挑選單個(gè)菌落進(jìn)，培養(yǎng)24 h制作菌懸液，菌液濃度約為1.5×108CFU·mL-1，冷藏保存。

（2）培養(yǎng)基的制備。①LB液體培養(yǎng)基。胰蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，氯化鈉10 g，加入定量蒸餾水，調(diào)培養(yǎng)基使培養(yǎng)基pH達(dá)到7.0，用蒸餾水定容至1 L。121 ℃滅菌20 min。②PDA培養(yǎng)基。采用文獻(xiàn)[7]的方法。

（3）葡萄柚皮精油抑菌能力的測(cè)定方法。本實(shí)驗(yàn)采用牛津杯法。移取0.1mL不同菌懸浮液，涂布于相應(yīng)的無菌平板上。將已滅菌的無菌牛津杯（直徑為8.0 mm），分別加入70%乙醇0.2 mL，向另外兩個(gè)中滴加5 μL葡萄柚皮精油，置于37 ℃、培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈直徑，每個(gè)菌種重復(fù)5次。測(cè)得抑菌圈直徑越大，表示其抑菌活性越強(qiáng)。

（4）葡萄柚柚皮精油抑菌圈直徑試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)。抑菌圈直徑＜7 mm為不敏感；抑菌圈直徑7～9 mm為低度敏感；抑菌圈直徑10～14 mm為中度敏感；抑菌圈直徑15～20 mm為高度敏感；抑菌圈直徑＞20 mm為極度敏感。

（5）測(cè)定菌株的最小抑菌濃度。本實(shí)驗(yàn)采用試管二倍稀釋法[8]在5個(gè)滅菌試管中分別加入LB培養(yǎng)液3 mL，取第1支試管加入精油原液3 mL，混勻后吸取3 mL加入第2支試管，重復(fù)操作，直至第5支試管抽取3 mL廢棄，在這5支試管加入待測(cè)菌懸液0.1 mL。另設(shè)一管為LB培養(yǎng)液對(duì)照組，一管為葡萄柚皮精油為對(duì)照組，細(xì)菌置37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，以不出現(xiàn)渾濁的最高稀釋倍數(shù)為最小抑菌濃度（MIC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率的影響

溶液吸光度隨時(shí)間變化如圖1所示。由圖1可知，BHT清除DPPH自由基速度比葡萄柚皮精油清除DPPH自由基速度較快，10 min后BHT清除DPPH自由基反應(yīng)達(dá)到平衡，為快速抗氧化劑，加入20 μL和60 μL柚皮精油清除DPPH自由基反應(yīng)隨著時(shí)間的延長反應(yīng)速度緩慢，得出葡萄柚皮精油為慢速抗氧化劑。由于BHT對(duì)DPPH自由基清除時(shí)間10 min達(dá)到平衡，而葡萄柚皮精油對(duì)DPPH自由基清除時(shí)間60 min達(dá)到平衡，為了與精油做對(duì)比性試驗(yàn)，綜合選擇60 min反應(yīng)時(shí)間為測(cè)定清除DPPH自由基的反應(yīng)時(shí)間。

圖1 溶液吸光度隨時(shí)間變化曲線圖

2.2 葡萄柚皮精油對(duì)DPPH自由基清除率的測(cè)定

葡萄柚皮精油對(duì)DPPH自由基的清除率如圖2所示。由圖2可知，隨著葡萄柚皮精油添加量的增加，DPPH自由基清除率逐漸增大，當(dāng)添加量為250 μL時(shí)，DPPH自由基清除率變化趨于平緩。由圖3可知，隨著BHT添加量的增加，DPPH自由基清除率逐漸增大，當(dāng)添加量為120 μL時(shí)，DPPH自由基清除率變化趨于平緩。

圖2 葡萄柚皮精油對(duì)DPPH自由基的清除率曲線圖

圖3 BHT溶液對(duì)DPPH自由基的清除率曲線圖

根據(jù)圖2、圖3，葡萄柚皮精油、BHT的回歸方程與半數(shù)清除率見表1。由表1可得，葡萄柚皮精油清除DPPH自由基的IC50為160.81 μL，BHT溶液清除DPPH自由基清除的IC50為88.31 μL，通過半數(shù)清除率的比較，BHT溶液的清除能力較強(qiáng)，葡萄柚皮精油也具有清除DPPH自由基的能力，但與人工合成的抗氧化劑BHT清除自由基能力上存在差距。

表1 精油、BHT回歸方程與半數(shù)清除率表

2.3 葡萄柚皮精油的抑菌性

葡萄柚皮精油對(duì)大腸桿菌與枯草桿菌的抑菌效果見圖4。葡萄柚皮精油對(duì)大腸桿菌和枯草桿菌得的抑菌圈直徑測(cè)定為（11.4±0.32）mm和（15.2±0.18）mm。在相同條件下，葡萄柚皮精油對(duì)大腸桿菌的抑菌活性比葡萄柚皮精油對(duì)枯草桿菌的抑菌活性更強(qiáng)，葡萄柚皮精油對(duì)大腸桿菌屬于中敏感度，對(duì)枯草桿菌屬于高敏感度，本結(jié)果與錢驊等人[9]的研究結(jié)論相同，實(shí)驗(yàn)表明葡萄柚皮精油對(duì)大腸桿菌和枯草桿菌均有抑制作用。

圖4 葡萄柚精油對(duì)大腸桿菌與枯草桿菌的抑菌圈圖

2.4 葡萄柚皮精油對(duì)不同菌種的最小抑菌濃度（MIC）

MIC的高低能反映出葡萄柚皮精油對(duì)不同菌種的抑菌效力，MIC越高，抑菌效果就越弱，反之，抑菌效果就越強(qiáng)，由表2可知葡萄柚皮精油對(duì)不同菌種的最小抑菌濃度，測(cè)定結(jié)果與牛津杯法結(jié)果一致。

表2 葡萄柚皮精油對(duì)不同菌種的最小抑菌濃度表

3 結(jié)論

（1）通過測(cè)定不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率的影響，試驗(yàn)得出在60 min左右葡萄柚皮精油對(duì)DPPH自由基清除反應(yīng)達(dá)平衡。

（2）以BHT為對(duì)照，得到葡萄柚皮精油具有清除DPPH自由基的能力。

（3）葡萄柚皮精油對(duì)革蘭氏陽性菌枯草桿菌、陰性菌大腸桿菌都有抑菌效果。枯草桿菌抑菌效果為高度敏感。

（4）葡萄柚皮精油對(duì)枯草桿菌的最小抑菌濃度為 7.31 mg·mL-1；大腸桿菌其次，為 10.92 mg·mL-1；測(cè)定結(jié)果與牛津杯法測(cè)定出的一致。

本實(shí)驗(yàn)通過從葡萄柚皮中提取精油，不僅可使葡萄柚原料綜合利用率提高，增加葡萄柚產(chǎn)品的附加值以及經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)還可減少對(duì)環(huán)境的污染。