季海蕊,張 鑫,姜 靜,趙 丹,2,*

(1.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物省高校重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150080; 2.黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中,黑龍江哈爾濱 150500)

β-甘露聚糖酶(β-1,4-mannan mannaohydrolase,EC.3.2.1.78,以下簡稱甘露聚糖酶)屬于半纖維素水解酶,能夠隨機(jī)切割β-1,4-D-甘露糖苷鍵,水解產(chǎn)物為甘露低聚糖(mannan-oligosaccharides,MOS)[1-2]。甘露聚糖酶普遍存在于動、植物及微生物中。微生物甘露聚糖酶種類最為豐富,具有活性高、成本低、提取方便等優(yōu)點,在食品、飼料、洗滌劑和紡織等[3-6]工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用廣闊。如細(xì)菌中的芽孢桿菌(Bacillussp.)[7-8]、假單胞菌(Pseudomonassp.)、弧菌(Vibriosp.)[9];真菌中的曲霉菌(Aspergillussp.)[10]、青霉菌(Penicilliumsp.)[11]和放線菌中的鏈霉菌(Streptomycetesp.)[12]等菌屬的研究較多。然而常用產(chǎn)酶菌株生物安全性無法滿足食品領(lǐng)域?qū)Ω甙踩悦溉找嬖鲩L的需求。

表1 LAB來源甘露聚糖酶及分子量Table 1 Mannanase from lactic acid bacteria and its molecular weight

乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)作為公認(rèn)的安全菌株(generally recognized as safe,GRAS),為甘露聚糖酶在保健品和食品等領(lǐng)域中的直接應(yīng)用提供了安全性保障[13]。近年來,關(guān)于LAB甘露聚糖酶的相關(guān)研究在不斷探索中,包括產(chǎn)酶條件、酶學(xué)性質(zhì)、分離純化、產(chǎn)酶菌種的篩選、純化以及利用基因工程技術(shù)對甘露聚糖酶的異源表達(dá)等。本文就目前已報道的LAB作為直接產(chǎn)酶菌株及甘露聚糖酶異源表達(dá)菌株的研究進(jìn)行綜述。

1 天然LAB甘露聚糖酶的生產(chǎn)

1.1 產(chǎn)酶菌種及產(chǎn)酶條件

目前已報道的直接產(chǎn)LAB甘露聚糖酶菌株共五株,如表1所示。優(yōu)化培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件,是提高產(chǎn)酶水平的有效途徑,常見的方法有單因素、正交試驗和響應(yīng)面法(response surface methodology,RSM)等[14-16]。單因素不涉及因素之間的交互作用,正交試驗具有一定的限制性,無法獲得全面可靠的因素和水平組合。RSM是利用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系,可顯著提高甘露聚糖酶的產(chǎn)量,也是節(jié)省成本的重要方法。趙丹等[17]采用RSM對干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)HDS-01產(chǎn)甘露聚糖酶的培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,在葡萄糖12.65 g/L、初始pH5.18的條件下發(fā)酵18.23 h,酶活力可達(dá)81.40 U/mL,較優(yōu)化前提高1.33倍。路氏腸桿菌(Enterobacterludwigii)MY271[18]的產(chǎn)酶條件經(jīng)RSM優(yōu)化后,該菌株在魔芋粉14 g/L、Na2HPO40.5 g/L和MgSO40.01 g/L的條件下發(fā)酵培養(yǎng),酶活力可達(dá)到62.76 U/mL,是初始酶活力的2.09倍。多數(shù)細(xì)菌和真菌一般以魔芋粉、瓜爾膠、槐豆膠等多聚糖類作為單一碳源,但L.caseiHDS-01是在混合碳源條件下,優(yōu)先利用葡萄糖進(jìn)行細(xì)胞生長,初始葡萄糖耗盡后,魔芋粉繼而取代并誘導(dǎo)甘露聚糖酶的產(chǎn)生。適宜濃度的葡萄糖既能保證L.caseiHDS-01積累足夠的生物量,又不產(chǎn)生葡萄糖抑制效應(yīng),而干擾魔芋粉的誘導(dǎo)。細(xì)菌產(chǎn)甘露聚糖酶的初始pH通常為中性或堿性(7.0～9.5),而LAB產(chǎn)甘露聚糖酶的初始pH在5.0左右,原因在于LAB為嗜酸性的單細(xì)胞生物。此外,較真菌而言LAB具有生長速度快,產(chǎn)酶周期短等優(yōu)點。因此對LAB甘露聚糖酶的研究不僅給工業(yè)生產(chǎn)甘露聚糖帶來便利,同時也拓展了人們對LAB糖類代謝能力的認(rèn)識,也為工業(yè)化生產(chǎn)高生物安全性的酶提供了菌種來源。

1.2 乳酸菌甘露聚糖酶的結(jié)構(gòu)特征

1.2.1 分離純化及分子量 LAB甘露聚糖酶多為胞外誘導(dǎo)酶,液體發(fā)酵液可通過離心或過濾除去菌體獲得粗酶液。甘露聚糖酶分離純化通常采用硫酸銨分級沉淀法、透析、超濾、離子交換及凝膠過濾[24-26]等方法。張鑫等[27]使用飽和度65%的硫酸銨沉淀L.caseiHDS-01甘露聚糖酶蛋白,以CH3COO-為DEAE-Sepharose Fast Flow凝膠柱洗脫陰離子,結(jié)果表明對甘露聚糖酶蛋白的洗脫效果最好,純化后甘露聚糖酶蛋白含量為4.93 mg/mL,純化倍數(shù)提高了11.4倍。Nadaroglu等[20-21]和Adiguzel等[22]分別利用硫酸銨沉淀植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)ATCC? 14917TM、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)M17、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)M24和綠色魏斯氏菌(Weissellaviridescens)LB37的甘露聚糖酶蛋白時,飽和度為60%～80%,洗脫陰離子為Cl-,純化效率依次為74.5%、38.2%、75.6%和49.6%。結(jié)果表明,同種不同株來源的甘露聚糖酶在溶解度及陰離子相互吸附的能力上存在較大差別。

不同來源的甘露聚糖酶分子量也不盡相同,細(xì)菌來源的分子量通常在37～55 kDa。環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)NT 6.7[28]和尼爾森桿菌(Bacillusnealsonii)[26]甘露聚糖酶的分子量分別為40和50 kDa。真菌甘露聚糖酶的分子量一般較高,Chauhan等[26]報道的綠木霉菌(Trichodermavirens)甘露聚糖酶分子量達(dá)到77 kDa。LAB甘露聚糖酶的分子量通常為35～55 kDa(表1)。L.plantarumM24[21]有兩種甘露聚糖酶組分,分別為36.4和55.3 kDa。因此,LAB甘露聚糖酶的分子量與細(xì)菌的甘露聚糖酶較為相近,普遍小于真菌的甘露聚糖酶。

1.2.2 酶學(xué)特性

1.2.2.1 最適反應(yīng)pH 細(xì)菌甘露聚糖酶的最適反應(yīng)pH通常在略酸性到中性范圍(5.5～7.0)。真菌甘露聚糖酶作用范圍一般偏酸,最適反應(yīng)pH為4.0～5.5,如里氏木霉(Trichodermareesei)[29]甘露聚糖酶的最適pH為5.5。LAB中,P.acidilacticiM17[20]和W.viridescensLB37[22]的甘露聚糖酶最適pH均為6.0,而L.plantarumM24[21]和L.plantarumATCC? 14917TM[23]甘露聚糖酶的最適pH分別為8.0和10.0。由此可以看出,LAB甘露聚糖酶的最適反應(yīng)pH可以由弱酸性到堿性,與真菌來源的甘露聚糖酶相比,其作用pH范圍更為寬泛。

1.2.2.2 最適反應(yīng)溫度 微生物甘露聚糖酶的最適作用溫度為40～65 ℃[30]。W.viridescensLB37[22]甘露聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為40 ℃,且該酶在30～70 ℃時仍保持50%以上的活性。Nadaroglu等[20-21]測定P.acidilacticiM17甘露聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃,L.plantarumM24甘露聚糖酶的最適作用溫度和穩(wěn)定溫度范圍分別為50 ℃和30～70 ℃。L.caseiHDS-01[19]甘露聚糖酶酶活最適反應(yīng)溫度為40 ℃,然而當(dāng)溫度升至70 ℃時,相對酶活下降至30%以下,這是由于高溫環(huán)境破壞了α-螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵,導(dǎo)致α-螺旋結(jié)構(gòu)解旋的結(jié)果。LAB甘露聚糖酶較為寬泛的作用溫度區(qū)間,提升了LAB甘露聚糖酶在工業(yè)應(yīng)用中的潛力。

1.2.2.3 反應(yīng)熱動力學(xué) 微生物甘露聚糖酶以槐豆膠為底物時,Km值通常為0.5～7.8 mg/mL,如密褐褶菌(Gloeophyllumtrabeum)CBS900.73[31](Km3.7 mg·mL-1,Vmax2525 μmol·mL-1·min-1)和芽孢桿菌(Bacillussp.)HJ14[32](7.8 mg·mL-1,Vmax270 μmol·mL-1·min-1)。LAB甘露聚糖酶以槐豆膠為底物時,Km值通常為0.01～0.59 mg/mL,如P.acidilacticiM17[20](Km0.592 mmol/L,Vmax78.74 mmol·min-1·mg-1)、W.viridescensLB37[22](Km0.0178 mmol/L,Vmax82.5 mg mannan mL-1)和L.caseiHDS-01[19](Km2.68 mg·mL-1,Vmax400.03 μmol·mL-1·min-1)。此外,L.caseiHDS-01甘露聚糖酶以瓜爾膠為底物的相對活性比對槐豆膠、果膠和魔芋粉的相對活性高出1～2倍,并且發(fā)現(xiàn)瓜爾膠的高親和力和催化效率與其甘露糖和半乳糖較高比例(4∶1)的組成是分不開的[19]。

1.2.2.4 激活劑與抑制劑 金屬離子如Fe3+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+或Co2+等,對甘露聚糖酶有激活或抑制作用,同種金屬離子對不同來源的甘露聚糖酶產(chǎn)生的影響不同。Ca2+能夠抑制W.viridescensLB37與L.caseiHDS-01甘露聚糖酶的活性[22],卻能夠促進(jìn)枯草芽孢桿菌亞種(Bacillussubtilissubsp.inaquosorum)CSB31[33]嗜堿性甘露聚糖酶的活性。Zn2+能夠與P.acidilacticiM17[20]和L.plantarumM24[21]甘露聚糖酶的Zn2+結(jié)合位點結(jié)合,使酶活分別提高4%和286.3%。EDTA是一種金屬螯合劑,可以通過去除金屬離子以使酶失活。EDTA對L.caseiHDS-01[19]甘露聚糖的酶活力有極強的抑制作用,經(jīng)EDTA作用后剩余酶活僅在15%左右。不同來源的甘露聚糖酶性質(zhì)存在顯著差異,因此通過改變酶學(xué)性質(zhì),使甘露聚糖酶達(dá)到最佳狀態(tài),進(jìn)而擴(kuò)充LAB甘露聚糖酶的應(yīng)用范疇。

2 LAB表達(dá)重組甘露聚糖酶

目前,天然LAB甘露聚糖酶的生產(chǎn)方面存在酶產(chǎn)量、酶活及自身穩(wěn)定性較差等問題,難以滿足工業(yè)化應(yīng)用需求。為了克服這一系列問題,從而更好的將LAB甘露聚糖酶應(yīng)用于生產(chǎn)實踐,異源表達(dá)成為了一種普遍的分子生物學(xué)技術(shù),以提高酶產(chǎn)量,降低生產(chǎn)成本,從而獲得安全性高的甘露聚糖酶。異源表達(dá)常用的重組表達(dá)系統(tǒng)是大腸桿菌(Escherichiacoli)[25,32,34-35]和畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)系統(tǒng)[36-38],但P.pastoris表達(dá)系統(tǒng)尚未批準(zhǔn)用于食品級蛋白表達(dá)[39]。E.coli含有內(nèi)毒素,可能在分泌重組蛋白時釋放,引起人畜的不良反應(yīng),導(dǎo)致機(jī)體損傷。相比之下,選擇LAB作為異源表達(dá)宿主更為安全可靠。

2.1 LAB表達(dá)系統(tǒng)

重組蛋白的過量積累可能產(chǎn)生毒素,造成細(xì)胞損傷,影響宿主菌的正常生長。此時利用相應(yīng)的信號肽序列,及時將異源蛋白轉(zhuǎn)移至胞外,可有效減低這種損傷。鄒業(yè)霞等[39]利用乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)分泌蛋白的信號肽(SPUSP45)構(gòu)建表達(dá)載體,成功實現(xiàn)將短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)甘露聚糖酶基因(manB)在L.casei中的分泌表達(dá),重組酶活可達(dá)8.8 U/mL,顯示出益生菌和益生元協(xié)同調(diào)節(jié)腸道菌群的潛在能力。Lin等[40]將B.pumilus甘露聚糖酶基因manB克隆到表達(dá)載體pELX1上,在L.casei中成功表達(dá)。manB基因用于測試L.casei分泌表達(dá)時,甘露聚糖酶的穩(wěn)定性較β-葡萄糖苷酸酶更強,因此manB是比β-葡萄糖苷酸酶基因(gusA)更好的報告基因,開拓了manB基因新的用途。

近年來,L.plantarum也被用作甘露聚糖酶基因的異源表達(dá)宿主。在L.plantarumWCFS1中,利用pSIP403載體分泌表達(dá)B.circulansNT 6.7的manB基因,重組酶的最適作用pH和溫度分別為6.0和50 ℃,重組酶的活力達(dá)27 U/mL,是原始酶活力的3.29倍,對半乳甘露聚糖具有較高的底物特異性[41]。Sak-Ubol等[42]利用相同體系表達(dá)地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)DSM13的甘露聚糖酶基因。為避免抗生素標(biāo)記的使用,將pSIP403表達(dá)質(zhì)粒上的紅霉素抗性基因(eryR)用丙氨酸消旋酶基因(alr)取代,滿足了食品級表達(dá)載體選用食品級篩選標(biāo)記的條件[43-44]。LAB作為食品級宿主生產(chǎn)重組甘露聚糖酶,在食品、MOS制備及果汁產(chǎn)業(yè)等領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用潛力。

2.2 LAB表面展示系統(tǒng)

常規(guī)游離甘露聚糖酶的制備過程復(fù)雜、穩(wěn)定性及重復(fù)利用率低,這些因素限制了甘露聚糖酶應(yīng)用的進(jìn)一步發(fā)展。近年來,LAB表面展示技術(shù)的迅速發(fā)展為甘露聚糖酶的制備提供了新的視角。LAB表面展示可將甘露聚糖酶和LAB的細(xì)胞表面蛋白融合表達(dá),使重組甘露聚糖酶固定在LAB細(xì)胞表面。在工業(yè)生產(chǎn)過程中,LAB表面展示無需復(fù)雜的分離純化和固定化等步驟,具有成本低、穩(wěn)定性高、可重復(fù)使用等優(yōu)點,可用于開發(fā)全細(xì)胞生物催化劑和生物傳感器等[45-46]。B.licheniformisDSM13的甘露聚糖酶基因manB與B.subtilisATCC 23857的殼聚糖酶基因(csnA),分別通過N端脂蛋白錨定和C端細(xì)胞壁錨定與L.plantarum的不同錨定位點融合,在L.plantarumWCFS1中成功表達(dá)。L.plantarumWCFS1細(xì)胞表面展示的甘露聚糖酶活性可達(dá)890 U/g,經(jīng)4次循環(huán)使用后,重組甘露聚糖酶酶活雖有下降,但仍保持在80%左右,有良好的可重復(fù)利用性[47]。Nguyen等[48]將B.licheniformisDSM13的manB基因與L.plantarum的N末端脂蛋白錨定序列融合,將重組甘露聚糖酶展示在L.plantarumWCFS1的細(xì)胞表面,細(xì)胞表面酶活性達(dá)到3500 U/g,通過4次循環(huán)使用,重組酶酶活仍保持初始酶活的50%左右。采用LAB表面展示甘露聚糖酶,降低發(fā)酵生產(chǎn)成本的同時,避免了繁瑣的酶純化步驟,提高了酶的重復(fù)利用率,從而拓寬了甘露聚糖酶的應(yīng)用前景。

3 LAB甘露聚糖酶的應(yīng)用

現(xiàn)階段,甘露聚糖酶在飼料、洗滌劑、紡織、造紙及石油鉆探等行業(yè)有重要作用。在飼料工業(yè),甘露聚糖酶具有消除抗?fàn)I養(yǎng)因子β-D-甘露聚糖的作用,促進(jìn)畜禽生長,提高飼料利用率[4]。在紡織行業(yè),甘露聚糖酶可使苧麻脫膠徹底,減少纖維素?fù)p壞,提升紡織品質(zhì)[6]。盡管甘露聚糖酶的應(yīng)用廣泛,但隨著人們對食品級安全問題的日益重視,LAB作為直接產(chǎn)酶來源備受關(guān)注,LAB無毒副作用為LAB甘露聚糖酶直接應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品及果汁飲料等行業(yè)提供安全性保障,從而使LAB甘露聚糖酶的地位及熱度也逐年上升。現(xiàn)已報道LAB甘露聚糖酶主要應(yīng)用在果汁澄清和制備益生元MOS兩個方面。

3.1 在果汁澄清中的應(yīng)用

大部分果汁原料中含有甘露聚糖,導(dǎo)致提取物粘稠度高,增加了果汁加工難度。甘露聚糖酶制劑已廣泛應(yīng)用于果汁生產(chǎn),降解甘露聚糖,降低粘稠度,提高出汁率和澄清效果,改善果汁品質(zhì)和外觀。Nadaroglu等[20-21]報道了P.acidilacticiM17和L.plantarumM24甘露聚糖酶用于橙汁、杏汁、葡萄汁、蘋果汁和桃汁的澄清作用。Adiguzel等[22]利用甘露聚糖酶澄清獼猴桃汁效果最佳,澄清率為117.21%。Zhao等[17,19]發(fā)現(xiàn)L.caseiHDS-01甘露聚糖酶用于橙汁的澄清效果較好,澄清率提高到156%。與純酶制劑相比,產(chǎn)甘露聚糖酶的LAB菌株可直接用于果汁加工,既能夠保證食用安全性,還能降低生產(chǎn)成本。

3.2 制備益生元MOS

人體及家畜無法直接消化吸收MOS,但MOS在腸道內(nèi)被雙歧桿菌(Bifidobacterium)、乳酸桿菌(Lactobacillus)等所利用,促進(jìn)有益菌的生長,調(diào)節(jié)腸道的微生態(tài)平衡[49-50]。LAB來源的甘露聚糖酶亦具有制備MOS的能力。B.licheniformisDSM13的manB在異源表達(dá)宿主L.plantarum中表達(dá),通過表面展示固定化甘露聚糖酶能夠產(chǎn)生安全、穩(wěn)定的食品級生物催化劑,將半乳甘露聚糖分解成益生元MOS[47]。Nguyen等[48]成功在L.plantarumWCFS1細(xì)胞表面展示重組甘露聚糖酶,將該細(xì)菌用作全細(xì)胞生物催化劑,以生產(chǎn)益生元MOS。

4 結(jié)語

隨著對半纖維素資源的開發(fā)和功能性低聚糖MOS益生作用的研究,甘露聚糖酶的研究已取得較大程度的進(jìn)展,在保健品、飼料等行業(yè)廣泛應(yīng)用。LAB作為甘露聚糖酶的直接產(chǎn)酶菌株提供了諸多便利,具有食品安全級的保障和益生作用,符合綠色、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的可持續(xù)發(fā)展理念。為使LAB來源的甘露聚糖酶能夠更廣泛的應(yīng)用于工業(yè)化量產(chǎn),需提高LAB甘露聚糖酶的環(huán)境適應(yīng)性、酶活力及產(chǎn)酶水平等。LAB甘露聚糖酶的研究將集中在以下幾個方面:第一,挖掘直接產(chǎn)甘露聚糖酶的LAB菌株資源,為酶的食品級應(yīng)用提供生成菌種;第二,優(yōu)化產(chǎn)酶條件,為工業(yè)化生產(chǎn)提供工藝參數(shù);第三,利用分子生物學(xué)手段構(gòu)建食品級表達(dá)系統(tǒng),提高甘露聚糖酶的安全性及產(chǎn)量。