李朝陽,竇中友,顧新禹,陳 尚,郭增旺

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué),國家雜糧工程技術(shù)研究中心,黑龍江大慶 163319; 2.糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程研究中心,黑龍江大慶 163319; 3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué),食品學(xué)院,黑龍江大慶 163319; 4.遜克縣農(nóng)場學(xué)校,黑龍江北安 164423; 5.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

圖1 乳清水殘留大豆蛋白回收工藝流程圖Fig.1 Process flow chart of whey water residual soybean protein recovery

大豆是豆科大豆屬一年生草本植物,含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白、不飽和脂肪酸、礦質(zhì)元素及B族維生素,它是居民膳食中優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的重要來源。大豆蛋白質(zhì)含量約為35%～40%,氨基酸比例均衡,富含谷類蛋白質(zhì)缺乏的賴氨酸,可與谷類蛋白質(zhì)互補。大豆分離蛋白(soy protein isolate,SPI)作為一種營養(yǎng)豐富的蛋白類食品添加劑[1],具有良好的溶解性、凝膠性、乳化性、起泡性等功能特性[2]。大豆分離蛋白的提取方法主要包括堿溶酸沉法、超濾法和離子交換法,基于成本和效益的考慮,國內(nèi)外常用的提取方式為堿溶酸沉法。研究發(fā)現(xiàn),堿溶酸沉法提取大豆蛋白過程中會產(chǎn)生大量的大豆乳清水又被稱為廢水,其約含1.5%～2.5%的固形物,富含大豆蛋白質(zhì)及大豆低聚糖[3]。為達到環(huán)保要求需對產(chǎn)生的廢水進行后續(xù)處理,這嚴(yán)重增加了大豆蛋白的生產(chǎn)成本,限制產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

為絮凝沉淀大豆乳清水中蛋白質(zhì)主要是采用多糖絮凝法,但普遍存在絮凝沉淀效率低等問題。利用高黏度殼聚糖(黏度>400 mPa·s)回收魚糜漂洗液中的蛋白質(zhì),結(jié)果表明:當(dāng)pH6.5、溫度20 ℃、作用時間90 min、殼聚糖質(zhì)量濃度1.67 mg/mL時,高黏度殼聚糖對魚糜漂洗液中蛋白質(zhì)回收率達43.68%[4];Huang等[5]利用殼聚糖回收大豆蛋白,得出蛋白回收的最佳條件為pH6.0～6.5,蛋白/殼聚糖比例4∶1,溫度25 ℃,凝聚產(chǎn)率大于60%;劉秉濤等[6]研究發(fā)現(xiàn)在不同pH條件下,殼聚糖回收粗蛋白的效果差異顯著。迄今為止,殼聚糖是絮凝沉淀廢液中蛋白質(zhì)常用的一種方法,其原理在于它是一種天然陽離子型聚電解質(zhì)高分子化合物,在蛋白生產(chǎn)中與帶負(fù)電的蛋白質(zhì)發(fā)生靜電相互作用形成相對穩(wěn)定的復(fù)聚物[7]。譚慧等[8]研究發(fā)現(xiàn)SPI-多糖混合體系在高壓均質(zhì)作用下蛋白質(zhì)部分功能特性得到顯著改善(P<0.05)。高壓均質(zhì)技術(shù)是一種廣泛應(yīng)用在食品與藥品方面的加工技術(shù),其利用撞擊力、空穴爆炸力、剪切力等作用力,將乳濁液或懸浮液均質(zhì)成微乳液[9-10]。高壓均質(zhì)協(xié)同殼聚糖界面復(fù)聚效應(yīng)處理廢液是否能提高蛋白回收率及其對回收蛋白結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響,目前尚缺乏系統(tǒng)研究。

本研究利用高壓均質(zhì)協(xié)同殼聚糖技術(shù)處理大豆乳清水回收殘留大豆分離蛋白,并研究該技術(shù)對回收蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性的影響,為工業(yè)化生產(chǎn)大豆分離蛋白廢水的處理和副產(chǎn)物資源化利用提供了理論及實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆乳清水(乳清蛋白0.5%(血球凝集素和7S球蛋白90.0%)、大豆低聚糖0.9%、黃酮類物質(zhì)0.2%) 實驗室自制;殼聚糖(脫乙酰度91.8%;黏度45 mPa·s;相對分子質(zhì)量31000 Da)、牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250 sigma公司。

FB-110T超高壓均質(zhì)機 上海勵途機械設(shè)備工程有限公司;CR22G型高速冷凍離心機 日本日立公司;FJ200-S型高速勻漿機 力辰科技有限公司;RF-5301PC型熒光分光光度計、UV-2600紫外分光光度計、PE Raman Station 400型激光顯微拉曼光譜儀 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳清水殘留大豆蛋白回收

操作要點:取500 mL大豆乳清水在25 ℃下,按照0、30、60、90、120 MPa等五個水平分別處理10 min;將一部分均質(zhì)后大豆乳清水的pH調(diào)至6.0(2 mol/L NaOH),按乳清水/殼聚糖質(zhì)量比2∶1分別加入殼聚糖,室溫(25 ℃)下攪拌1.5 h;將均質(zhì)后大豆乳清水和蛋白/殼聚糖混合溶液4 ℃條件10000×g離心30 min,沉淀水洗2～3次,調(diào)pH至7.0。同樣條件再離心20 min,得上清液;將離心得到的蛋白/殼聚糖混合溶液上清液調(diào)節(jié)pH至9.0,攪拌過夜后靜置,部分的殼聚糖會因為不溶而形成沉淀,同樣條件再離心30 min,得上清液;將上述所得溶液調(diào)pH至7.0,離心30 min,冷凍干燥得蛋白[11-12]。采用Bradford法[13]測定回收蛋白的蛋白含量。

1.2.2 回收蛋白回收率測定 為避免回收蛋白中存在游離氨基酸和其它一些具備還原性質(zhì)的化合物對蛋白含量測定結(jié)果的干擾,利用Bradford法[13]分別測定初始液蛋白濃度(乳清水)及經(jīng)不同方式處理后上清液蛋白濃度,并計算蛋白回收率。

蛋白回收率(%)=(初始液蛋白濃度-上清液蛋白濃度)/初始液蛋白濃度×100

按照上述方法分別繪制0.1～1.0和0～0.1 mg/mL蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y=0.81187x+0.00045,R2=0.99932;y=7.85247x+0.08185,R2=0.99946。其中y為吸光值,x為蛋白質(zhì)濃度。從決定系數(shù)R2來看,線性關(guān)系良好。本試驗中以500 mL酸沉清液回收蛋白為標(biāo)準(zhǔn)計算回收蛋白的回收率。

1.2.3 拉曼光譜分析 利用pH7.0的磷酸鹽緩沖液將樣品配制成100 mg/mL溶液,按照王中江的方法進行拉曼光譜測定[14]。

1.2.4 熒光光譜分析 回收蛋白樣品0.25 g/100 mL(0.1 mol/L磷酸鹽pH7.0),室溫(25 ℃)下溶解,避光保存。激發(fā)波長為290 nm,激發(fā)和發(fā)射的狹縫5 nm,掃描波長300～400 nm,恒定掃描速度240 nm/min,電壓500 mV[15]。

1.2.5 表面疏水性測定 將所得樣品溶于0.01 mol/L、pH7.0的磷酸鹽緩沖液中,配成2 mg/mL的蛋白溶液,按照Wang等[16]的方法進行表面疏水性的測定。

1.2.6 濁度測定 將蛋白樣品配制成3 mg/mL,參照許琳霜等[17]的方法進行蛋白溶液濁度測定。

1.2.7 溶解性測定 參考Samoto等[18]方法進行蛋白質(zhì)溶解性的測定。

1.2.8 乳化活性及乳化穩(wěn)定性測定 將回收蛋白樣品溶液配制成2 mg/mL,參考Tang等[19]方法進行蛋白乳化活性及乳化穩(wěn)定性的測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗處理均為3次平行,差異顯著性采用SAS 8.2軟件進行統(tǒng)計分析,并采用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 回收蛋白含量結(jié)果

高壓均質(zhì)組和高壓均質(zhì)協(xié)同殼聚糖組回收蛋白含量如表1所示,隨均質(zhì)壓力增加,高壓均質(zhì)組和高壓均質(zhì)協(xié)同殼聚糖組蛋白含量均逐漸增加,但當(dāng)均質(zhì)壓力大于60 MPa時,高壓均質(zhì)組和高壓均質(zhì)協(xié)同殼聚糖組回收蛋白含量無顯著增加(P>0.05),且高壓均質(zhì)組(壓力大于60 MPa)和高壓均質(zhì)協(xié)同殼聚糖組無顯著差異(P>0.05)。

表1 不同均質(zhì)壓力下回收蛋白含量Table 1 Contents of recovered protein under different homogenous pressures

2.2 均質(zhì)壓力對殘留大豆蛋白回收率影響

不同高壓均質(zhì)壓力對蛋白回收率的影響如圖2所示,隨高壓均質(zhì)壓力增加,蛋白回收率總體上呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢。對空白組(沒添加殼聚糖,僅高壓均質(zhì)處理)言時,大豆蛋白的回收率隨均質(zhì)壓力增加先增加后減小,當(dāng)均質(zhì)壓力90 MPa時取得最大的蛋白回收率。這是由于高壓均質(zhì)處理使蛋白分子空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,疏水基團暴露導(dǎo)致表面疏水性增加,從而增加了蛋白的回收率。但繼續(xù)增加高壓均質(zhì)壓力(120 MPa)會導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生一定程度上變性,蛋白表面疏水性下降,使得蛋白回收率下降[20]。當(dāng)高壓均質(zhì)協(xié)同殼聚糖處理時,在相同均質(zhì)壓力下,隨著殼聚糖添加量增加,蛋白回收率明顯增加。這可能是由于隨著殼聚糖用量的增大,蛋白和殼聚糖之間的相互作用增強,使得蛋白回收率增加?；诖诉x擇蛋白/殼聚糖質(zhì)量比為2∶1。當(dāng)均質(zhì)壓力從0 MPa升高到90 MPa,高壓均質(zhì)協(xié)同殼聚糖處理的蛋白回收率顯著增加(P<0.05),由43.01%上升到 61.92%,繼續(xù)增大壓力,回收率開始出現(xiàn)輕微的下降,且與單獨添加殼聚糖回收蛋白相比(即高壓均質(zhì)壓力0 MPa),高壓均質(zhì)(90 MPa)協(xié)同殼聚糖處理使蛋白含量增加了43.96%。這種現(xiàn)象產(chǎn)生的原因可能是由于強剪切作用使蛋白質(zhì)分子有一定程度的解離和伸展,從而導(dǎo)致大量極性基團暴露,表面電荷增加,蛋白疏水基團與殼聚糖間的靜電相互作用不斷加強,從而形成有效蛋白復(fù)凝聚[21]。但隨著高壓均質(zhì)壓力(120 MPa)的不斷增大,蛋白質(zhì)發(fā)生聚集作用,從而減弱了與蛋白-殼聚糖間的相互作用,影響了大豆蛋白的回收率[10]。

表2 回收蛋白的二級結(jié)構(gòu)表(%)Table 2 Secondary structure of recovered protein under different homogenous pressure(%)

圖2 不同高壓均質(zhì)壓力蛋白回收率Fig.2 Recovery rate of protein under different homogenous pressures注:不同小寫字母表示同一蛋白/殼聚糖質(zhì)量比, 不同均質(zhì)壓力之間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

2.3 拉曼光譜分析

不同高壓均質(zhì)壓力條件下回收的蛋白在酰胺Ⅰ帶(1630～1700 cm-1)拉曼光譜峰的結(jié)構(gòu)歸屬為:α-螺旋在1645～1660 cm-1,β-折疊在1665～1680 cm-1,β-轉(zhuǎn)角在1680～1690 cm-1,無規(guī)則卷曲在1660～1670 cm-1。酰胺Ⅰ帶的拉曼特征峰代表回收蛋白二級構(gòu)象,未C=O與C-N鍵的伸張[22]。如表2所示,隨高壓均質(zhì)壓力逐漸增加,高壓均質(zhì)及高壓均質(zhì)協(xié)同殼聚糖處理回收蛋白的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)含量先減少后增多,且兩組均在均質(zhì)壓力90 MPa時取得最小值,但無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量先增加后減少。這可能是由于均質(zhì)處理使大豆分離蛋白內(nèi)部弱氫鍵和分子間作用力裂解,蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)變化,導(dǎo)致其有序結(jié)構(gòu)含量下降[23]。隨高壓均質(zhì)壓力繼續(xù)增加到120 MPa后,強剪切力對蛋白分子內(nèi)部隱藏的疏水基團進行切割,從而導(dǎo)致大量疏水性基團暴露,蛋白質(zhì)分子間通過相互形成新的化學(xué)鍵,造成蛋白質(zhì)分子的有序性增加。從總體來看,與高壓均質(zhì)處理組相比,高壓均質(zhì)協(xié)同殼聚糖處理組的有序結(jié)構(gòu)α-螺旋和β-折疊含量更多。這種現(xiàn)象說明乳清水中的殘留蛋白可能與殼聚糖形成了部分聚合穩(wěn)定的蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),證明高壓均質(zhì)協(xié)同殼聚糖界面復(fù)聚效應(yīng)使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)更趨有序化[24]。

2.4 熒光發(fā)射光譜分析

從圖3可以看出,在290 nm激發(fā)波長下,峰位在波長325～350 nm之間,因此該熒光發(fā)射光譜可能為色氨酸殘基。高壓均質(zhì)處理使得回收蛋白的λmax和熒光強度均發(fā)生了顯著的改變。當(dāng)均質(zhì)壓力達到90 MPa時,回收蛋白的熒光強度和λmax增加,當(dāng)均質(zhì)壓力大于120 MPa后,λmax開始下降。這可能是由于高壓均質(zhì)處理使大豆蛋白分子發(fā)生部分解折疊,結(jié)構(gòu)伸展,致使色氨酸殘基暴露于蛋白質(zhì)分子表面[25]。但是當(dāng)均質(zhì)壓力達到一定的值后,回收蛋白變性程度增加,結(jié)構(gòu)緊密,包裹在蛋白內(nèi)部的活性基團增加[26]。此外還可以看出,高壓均質(zhì)協(xié)同殼聚糖處理后,回收蛋白的熒光強度顯著降低,這可能是與殼聚糖對色氨酸殘基的屏蔽作用有關(guān),減少了其與熒光猝滅物質(zhì)的反應(yīng),導(dǎo)致回收蛋白的熒光強度下降[27]。

圖3 不同均質(zhì)壓力下回收蛋白熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of recovered protein under different homogenous pressures

2.5 表面疏水性分析

不同均質(zhì)壓力對回收蛋白表面疏水性的影響如圖4所示?；厥盏鞍椎谋砻媸杷噪S著均質(zhì)壓力的增加而顯著上升,這是由于高壓均質(zhì)處理使蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,疏水基團部分逐漸暴露出來,表面疏水性開始逐漸增加[22]。當(dāng)均質(zhì)壓力為120 MPa時,高壓均質(zhì)組回收蛋白的表面疏水性迅速增加,這主要是由于更大均質(zhì)壓力產(chǎn)生的強剪切力對蛋白質(zhì)內(nèi)部的隱藏的疏水性基團進行切割,導(dǎo)致回收蛋白的表面疏水性大幅增加[25]?？傮w來看,與高壓均質(zhì)組相比,復(fù)合處理后回收蛋白的表面疏水性降低,多糖對蛋白質(zhì)中賴氨酸和精氨酸殘基等疏水性基團具有屏蔽了作用,回收蛋白質(zhì)的親水性增加,導(dǎo)致表面疏水性降低[28]。

圖4 不同均質(zhì)壓力下回收蛋白表面疏水性Fig.4 Surface hydrophobicity of recovered protein under different homogenous pressures注:不同小寫字母表示同一處理不同均質(zhì)壓力之間 數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

2.6 溶解度及濁度分析

如圖5所示,隨均質(zhì)壓力增加回收蛋白的溶解性不斷升高,但當(dāng)均質(zhì)壓力達到90 MPa時,其增加速度隨著壓力的繼續(xù)升高而逐漸減小;回收蛋白溶液的濁度逐漸減少,且與溶解性的變化趨勢相反。推測原因可能是:在高壓均質(zhì)作用下回收蛋白質(zhì)的顆粒減小,比表面積增加,改善了其溶解性。此外,蛋白顆粒在高壓均質(zhì)條件下易趨于穩(wěn)定的懸浮液,導(dǎo)致溶液濁度降低[26-27]。同時相同均質(zhì)壓力處理條件下,高壓均質(zhì)協(xié)同殼聚糖組具有更好的溶解性,且濁度更小。這可能是由于添加殼聚糖引入了親水性基團,增加了蛋白分子的水合作用,使得回收蛋白的溶解性增加,濁度減小[11]。

圖5 不同均質(zhì)壓力下回收蛋白濁度和溶解度Fig.5 Turbidity and solubility of recovered protein under different homogenous pressures注:不同小寫字母表示同一指標(biāo)不同均質(zhì)壓力之間 數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖6同。

2.7 乳化活性及乳化穩(wěn)定性分析

蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、溶解度、表面疏水性和表面電荷分布密切相關(guān)[20]。如圖6所示,隨高壓均質(zhì)壓力增加(0～120 MPa),回收蛋白乳化活性及乳化穩(wěn)定性逐漸增加,但變化趨勢逐漸減小。這是由于高壓導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生空間結(jié)構(gòu)變化,使埋藏在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水性基團暴露出來,導(dǎo)致其疏水性增加,有利于改善蛋白質(zhì)的親水/疏水平衡,降低了界面張力,改善蛋白質(zhì)乳化性[29]。隨著均質(zhì)壓力(120 MPa)的增加,高剪切作用不斷加強使埋藏的疏水性基團更多的暴露出來,蛋白顆粒減小,使得表面疏水性和單位蛋白的可吸附界面面積顯著增加(P<0.05),從而改善乳化活性[30]。與高壓均質(zhì)組相比,高壓均質(zhì)協(xié)同殼聚糖處理乳清水的回收蛋白具有較好的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。這可能是由于引入的親水性殼聚糖結(jié)合到蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈上,增加了其親水性,而且多糖鏈也抑制了油相的聚集,回收蛋白更容易在油/水界面上分散排列,具有較好的乳化活性和乳化穩(wěn)定性[31]。

圖6 不同均質(zhì)壓力下回收蛋白乳化特性Fig.6 Emulsifying properties of recovered proteins under different homogeneous pressures

3 結(jié)論

本文主要通過高壓均質(zhì)協(xié)同殼聚糖界面復(fù)聚效應(yīng)回收堿溶酸沉乳清水中殘留大豆蛋白,研究該處理方法對殘留蛋白回收率,并深入研究該技術(shù)對回收蛋白結(jié)構(gòu)(二級、三級結(jié)構(gòu))及功能特性的影響。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)乳清水/殼聚糖質(zhì)量比2∶1,高壓均質(zhì)壓力不大于90 MPa時,與單獨添加殼聚糖處理相比,高壓均質(zhì)協(xié)同殼聚糖處理顯著(P<0.05)提高了蛋白回收率,并改善了回收蛋白的部分功能性質(zhì)。高壓均質(zhì)處理改變回收蛋白分子的構(gòu)象和色氨酸殘基微環(huán)境的極性,使蛋白內(nèi)部活性基團發(fā)生變化,顯著提高了蛋白的表面疏水性及溶解性、濁度、乳化活性和乳化穩(wěn)定性。根據(jù)高壓均質(zhì)對殘留蛋白回收率及其對回收蛋白功能性質(zhì)的改善,選擇高壓均質(zhì)壓力為90 MPa,乳清水/殼聚糖質(zhì)量比2∶1。每處理1噸大豆乳清水可回收蛋白4 kg,具有顯著的經(jīng)濟效益,此外本技術(shù)的研究可以有效解決大豆乳清廢水的環(huán)境污染問題,具有良好的社會效益。本研究為工業(yè)化生產(chǎn)大豆分離蛋白廢水的處理和副產(chǎn)物資源化利用提供了理論及實踐基礎(chǔ)。